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“剪切环”的组装与应用：一种用于轨道式、单向周期性流体流动和剪切应力研究的新型内皮细胞模型

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DOI：

10.3791/54632

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2016年10月31日

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1Molecular and Cellular Physiology, Louisiana State University Health Sciences Center in Shreveport, 2Biological Sciences, Louisiana Tech University, 3Neurology, Louisiana State University Health Sciences Center in Shreveport, 4Institut Cochin, Inserm U1016, Cnrs Umr8104, Université Paris Descartes

本文内容

摘要

已知不同水平和模式的流体剪切力可调节内皮细胞的基因表达、表型及其对疾病易感性。本文讨论“剪切环”模型的组装与使用：该模型可产生单向、周期性的剪切应力模式。剪切环结构简单、成本低廉，且可获得较高的细胞产量。

摘要

血管流体剪切力的正常水平和模式发生偏离，在血管生理学和病理生理学中发挥重要作用，可诱导内皮细胞表型和基因表达发生适应性及病理性改变。特别是，周期性单向流动诱导产生的剪切应力对多种血管细胞类型（尤其是内皮细胞）具有不良适应效应，可触发多种生物学效应。尽管目前已有来自不同解剖来源的内皮细胞被成功培养，但对其在流体剪切力作用下反应的深入分析，却受限于现有剪切模型的相对复杂性（例如，平行板流动腔、锥板流动模型）。尽管这些模型均为优良的研究手段，但技术上较为复杂，且存在诸多缺陷，如设置时间较长、操作复杂、有效表面积较小、需要泵和加压装置，通常还需使用密封剂和垫圈，这既给无菌环境的维持带来挑战，也难以同时开展多个实验。然而，如果能够获得通量更高的流动与剪切模型，则有望更快速地推进对血管内皮细胞剪切响应的研究，尤其是在分子水平上对周期性剪切的研究。本文中，我们介绍剪切环的构建与使用方法：这是一种新型、易于组装、成本低廉的组织培养模型，具有相对较大的表面积，可方便地在内皮细胞的单向、周期性剪切应力研究中实现大量实验重复。

引言

流体剪切应力已被证明可通过激活顺式调控元件1-5、组蛋白乙酰转移酶活性6以及剪切应力反应元件（SSRE）78，调控内皮细胞的基因表达程序。剪切应力通过调节组织因子9和组织型纤溶酶原激活物（tPA）10的表达，影响内皮细胞在凝血过程中的作用。剪切应力还通过调控血小板源性生长因子B（PDGF-B）的合成与反应性，影响血管生成11和血管重塑的调控8。内皮细胞分泌的血管活性介质，如肾上腺髓质素、内皮素-1、尾加压素II和松弛素，其表达也受剪切应力的调控12。内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的转录及其一氧化氮（NO）的生成均依赖于剪切应力10。剪切应力还可调控内皮细胞ICAM-1的表达13。因此，血流诱导的剪切应力可强烈影响多种内皮细胞反应。重要的是，血管搏动在正常血管老化及血管性痴呆的病理生理过程中也发挥着重要作用14，甚至可能参与多发性硬化等其他神经退行性疾病的发生发展15。

静脉和动脉内皮细胞本质上暴露于多种不同的血流动力学流动模式 体内，并可表现出多种不同的内皮细胞表型16根据血流大小和周期性的不同，内皮细胞可能产生炎症细胞活化和凋亡等反应，这些反应可能反映了基因或蛋白表达的变化17,18因此，由于产生剪切现象的困难，内皮细胞对剪切力反应的研究仍然十分复杂 体外 能够充分产生此类剪切模式的模型。

已开发出多种不同的实验方案，用于向内皮细胞单层施加流体剪切应力。其中最常用的系统之一是平行板流动腔，该系统可在腔内产生均匀的层流。19-21通常连接蠕动泵以产生周期性流动，从而模拟许多部位常见的流动特性 体内22另一种常见的装置采用“锥板模型”，其中流体剪切应力由锥体的旋转速度决定23两种系统及其他类似装置的搭建过程可能较为繁琐，且需要一些相对昂贵、许多实验室难以获取的组件。

当前这些模型的另一个主要局限性在于，能够同时进行的重复实验数量相对较少，且每个实验的表面积相对较小。这增加了此类方法所需的时间和复杂性。因此，理想的模型应能够诱导单向且周期性的剪切力，同时可轻松建立大量重复实验，且每个实验具有相对较大的表面积。此外，前述模型需要相当复杂的装置，对许多用户而言可能成本过高。若能使用基础实验室材料产生流体剪切扰动的模型，则可能具备多项优势。

一种简单且高度经济的施加单向周期性剪切应力的方法是将圆形培养皿放置在轨道摇床之上24。该方案非常简便，可根据需要扩大规模，以获得大量研究重复样本，每个样本均具有相对较大的表面积。然而，位于培养皿中心区域的细胞所受到的流体流动模式与边缘区域的细胞不同，导致在同一培养皿内出现混合的细胞表型反应。

在本报告中，我们描述了“剪切环”（shear rings）的构建与使用方法，该模型可用于产生单向且周期性的剪切应力。通过在圆形培养皿内设置内环，将流体通路限制在周边区域，剪切环的设计有效减少了由混合剪切力诱导的细胞表型。剪切环的构建和操作简单、经济，且可轻松适配多种常见的轨道摇床，仅需使用广泛可得的组织培养耗材即可实现。该模型可用于内皮细胞实验，以在生理及病理生理水平下提供单向且周期性的流动模式。

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方案

1. 150 mm 直径剪切环的构建（图 1）

注意：通过改变外层和内层培养皿的尺寸，可制作出多种不同规格的剪切环装置，从而获得不同总表面积、细胞产量以及不同范围剪切力的设备。本报告描述的是使用一个150 mm培养皿与一个内层100 mm培养皿组合，总表面积为98 cm2（图2）。

figure-protocol-1
图1. 剪切环组件。 图的上半部分显示了一个部分组装的剪切环。如果内层和外层培养皿之间尚未完全形成密封，可用移液管通过3 mm的孔注入0.5 ml的二氯甲烷。通过在剪切环顶部内侧边缘涂一圈约1 mm厚的硅橡胶粘合剂，将剪切环完全密封。图的下半部分显示了组装完成的剪切环。蓝色区域代表接种的内皮细胞区域。外侧和内侧的红色箭头分别表示当剪切环置于轨道摇床上时，剪切环本身及其中培养基的轨道运动方向。请点击此处查看此图的放大版本。

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图2. 150 mm剪切环的表面测量示意图（未按比例绘制）。 上图显示了轨道旋转引起的液体向外围环的离心位移。请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 在演示软件中创建一个剪切环结构模板，生成一个外径为 150 mm 的圆形轮廓，并在其中心放置一个直径为 100 mm 的内圆。将该模板打印在一张 A4 白纸上。
  2. 用移液器将 10 ml 甲基氯（二氯甲烷）加入一个 150 mm 的玻璃培养皿中。必须使用玻璃培养皿而非聚苯乙烯（或其他乙烯类塑料）培养皿，因为甲基氯可溶解大多数塑料，此处用于连接塑料部件。
    注意：操作过程中必须佩戴手套，并确保通风橱通风良好。甲基氯具有接触刺激性，且具有肝毒性。
  3. 将一个 150 mm 的塑料培养皿对准外层剪切环模板的轮廓。
  4. 使用旋转工具在 100 mm 培养皿的中心钻一个 3 mm 的孔。清除钻孔过程中产生的塑料碎屑。
  5. 用戴着手套的手握住上一步骤中的 100 mm 培养皿，将其倒置，并将顶部边缘浸入甲基氯溶液中约 3 秒。
  6. 将“润湿”后的 100 mm 培养皿边缘朝下转移至 150 mm 培养皿的中心位置，仔细对准标记的模板，使 100 mm 培养皿居中。甲基氯会熔融塑料，从而将 100 mm 与 150 mm 培养皿粘合在一起。轻轻顺时针和逆时针旋转 100 mm 培养皿数次，以确保其与 150 mm 培养皿之间牢固粘合。
    注意：务必确保内层培养皿与外层培养皿中心对齐。偏心对齐可能导致剪切环不同位置处的剪切应力不均。在放置 100 mm 培养皿时，需防止甲基氯意外滴落到 150 mm 培养皿的外圈区域，否则会熔化细胞生长区域的底部表面，形成不平整的表面，进而引起流动扰动。
  7. 待甲基氯完全干燥后，将新粘合的培养皿翻转，并仔细检查接触点，确认两个培养皿之间已形成紧密密封。
  8. 若密封不完全，使用移液管通过 3 mm 孔注入 0.5 ml 甲基氯。拿起培养皿并轻轻旋转，使甲基氯流至边缘。
    注意：若旋转过快，甲基氯可能溢入 150 mm 培养皿的外圈区域，导致细胞生长表面变形，从而破坏剪切环结构。出现泄漏的剪切环应予以废弃。
  9. 在 100 mm 培养皿的孔上涂抹一条 3 mm 宽的硅橡胶密封胶，以封闭该孔。
  10. 使用配备平面切割头的旋转工具，切下 15 ml 锥形聚苯乙烯组织培养管的顶部 3 cm 部分，保留盖子下方至少 1 cm 的管体。使用切割头的平面侧对切口边缘进行打磨，直至光滑平整。清除研磨过程中产生的塑料碎屑。
  11. 用记号笔将切下的 15 ml 锥形管轮廓描画在 150 mm 培养皿盖上，距离培养皿边缘约 0.5 cm。在所画圆圈内钻一个孔，孔边缘距离圆圈边缘约 1–2 mm。
  12. 将切下的锥形管顶部覆盖在钻好的孔上。使用移液管向锥形管的切口边缘加入约 250 µl 甲基氯，以将锥形管固定在 150 mm 培养皿盖上。
  13. 在 150 mm 培养皿盖的内边缘周围涂抹一条厚约 1 mm 的硅橡胶密封胶，将 150 mm 盖子密封至 150 mm 培养皿上。

2. 剪切环的灭菌

  1. 通过15 ml锥形管端口，用移液器向新制备的剪切环中加入约10 ml磷酸盐缓冲液。轻轻旋转混匀，以清除剪切环内部的任何碎片。使用巴斯德移液管或真空抽吸装置将磷酸盐缓冲液移除。
  2. 重复上一步骤，直至碎片完全清除。
  3. 为对剪切环进行灭菌，采用70%乙醇冲洗结合紫外线照射的方法。
    1. 拧开通气盖帽，通过入口端口用移液器加入约10 ml 70%乙醇，然后重新拧紧盖帽。多次旋转并翻转剪切环，确保其内壁被充分清洗。
    2. 在通风橱内，抽吸除去多余的70%乙醇。使用喷雾瓶将盖帽和入口端口彻底喷洒70%乙醇。
    3. 将剪切环及其盖帽置于细胞培养超净台内的紫外线下照射，直至完全干燥。
  4. 干燥后，重新拧紧盖帽，并将已灭菌的剪切环于室温下储存，待用于细胞培养接种时使用。

3. 剪切应力研究

  1. 按照标准细胞培养方案，将内皮细胞以通常用于转化内皮细胞系的1:4传代比例接种于无菌的剪切力培养环中。
    注意：大鼠视网膜微血管内皮细胞购自商业来源。人脑微血管内皮细胞（hCMEC/D3）由法国Inserm的Pierre-Oliver Couraud博士慷慨惠赠，使用完全内皮基础培养基（EBM）进行培养。
  2. 待细胞培养物达到汇合状态后，再开始进行灌注实验。使用30 ml组织培养基（含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素/两性霉素的DMEM培养基）。每3天更换一次细胞培养基，并将细胞维持在 37 °C 含7.5% CO2 和92.5%的空气。
  3. 将轨道摇床放入培养箱中。
    注意：摇床通常较重（>10 kg）。将轨道摇床放置在培养箱的底层搁板上，以尽量减少搁板承受的压力和振动。
  4. 将实验用剪切环置于轨道摇床中，将静态对照组剪切环放入同一培养箱内。
  5. 利用公式估算剪切环内的最大剪应力 figure-protocol-3 其中 figure-protocol-4 是轨道摇床的旋转半径（单位：cm）， figure-protocol-5 是介质的黏度（单位：泊）， figure-protocol-6 是介质的密度（单位：g/ml），以及 figure-protocol-7 是旋转频率（单位：转/秒）24.
  6. 将轨道摇床的转速设置为所需的 rpm例如， 90 rpm），使剪切环在摇床中保持设定的剪切应力作用时间例如，72 小时。
    注意：轨道摇床可能产生热量，因此应先监测培养箱温度以确保 37 °C 在整个实验过程中保持不变。或者，可将剪切环转移至环境室中（例如，模块化培养箱室），然后置于旋转培养箱中。
  7. 在细胞层暴露于剪切力达到所需时间后，从培养箱中取出剪切环。取下剪切环盖，收集细胞和/或培养基用于后续所需的终点分析例如， 蛋白质印迹，荧光激活细胞分选 等等。)25.

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结果

本文展示了在剪切力环中培养的人脑微血管内皮细胞系 hCMEC/D3 和大鼠视网膜微血管内皮细胞单层的代表性结果。

在完全 EBM 培养基中使 hCMEC/D3 脑微血管内皮细胞单层生长至融合后，将剪切环置于轨道摇床上处理 72 小时。根据步骤 3.5 中的公式计算，最大剪切应力 figure-results-1 约为 2.8 dynes/cm2（参数为 figure-results-2 = 0.95 cm，figure-results-3 = 0.0101 poise， 

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讨论

构建用于使内皮细胞暴露于剪切力的剪切环系统，是进行剪切应力研究的一种简单方法。然而，有几个步骤对于获得优质的剪切环并取得更好的实验结果至关重要。内环与外环之间应形成完全密封，以防止培养基泄漏，否则可能导致不同样本间的剪切应力不一致。如果未能形成完全密封，可通过内环上的孔洞，用移液管将少量二氯甲烷滴加至内盘与外盘之间的边缘处。轻轻旋转环体，可使二氯甲烷形成完整的密封。此外，在切割过程中可能意外产生塑料碎屑并残留在剪切环轨道上，因此在组装完成后应冲洗剪切环，以去除可能影响细胞生长并导致剪切应力施加不一致的任何残留物。

文章中描述的剪切环尺寸相对较大，导致每个样品的输出量较高。然而，可以使用较小的培养皿来构建更小的版本例如，100 mm 培养皿配 60 mm 插入环）。构建多个较小的剪切环可在与其他方法相比仍保持相对较大的液体体积和样品表面积的同时，实现更高数量的实验重复。

使用剪切环时已发现一些问题。首先，某些轨道摇床会产生过多热量，而某些培养箱无法有效控制温度升高。可通过适当选择旋转装置以及使用非水套式培养箱来...

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披露

J. Winny Yun 获得了 Annette Funicello 基金会的研究资助。J. Steven Alexander 获得了路易斯安那州立大学健康科学中心-什里夫波特分校神经病学系的研究支持。

致谢

作者谨此感谢 Christopher Nguyen 先生、Aaron Hunter 以及什里夫波特 Jumpstart、SMART 和 Biostart 培训项目，同时感谢路易斯安那州什里夫波特百年学院生物物理学系的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 x 20 mm 塑料组织培养皿Corning430167培养皿必须为聚苯乙烯材质
150 x 25 mm 塑料组织培养皿Corning430599培养皿必须为聚苯乙烯材质
150 mm 玻璃培养皿Fisher3160150BO
15 ml 聚苯乙烯组织培养塑料离心管Falcon352099
二氯甲烷Sigma-AldrichD65100
硅橡胶密封剂DAP7079808641
乙醇Decon2701
3 ml 移液管Becton-Dickinson357524
打印纸
剪刀
手套
旋转工具及配件套装Dremel4000-6/50
旋转工具切割头DremelEZ476
旋转工具钻头
蒸馏水
轨道摇床VWR57018-754
培养箱
大鼠视网膜微血管内皮细胞Cell BiologicsRA-6065

参考文献

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