已知不同水平和模式的流体剪切力可调节内皮细胞的基因表达、表型及其对疾病易感性。本文讨论“剪切环”模型的组装与使用：该模型可产生单向、周期性的剪切应力模式。剪切环结构简单、成本低廉，且可获得较高的细胞产量。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
血管流体剪切力的正常水平和模式发生偏离，在血管生理学和病理生理学中发挥重要作用，可诱导内皮细胞表型和基因表达发生适应性及病理性改变。特别是，周期性单向流动诱导产生的剪切应力对多种血管细胞类型（尤其是内皮细胞）具有不良适应效应，可触发多种生物学效应。尽管目前已有来自不同解剖来源的内皮细胞被成功培养，但对其在流体剪切力作用下反应的深入分析，却受限于现有剪切模型的相对复杂性（例如，平行板流动腔、锥板流动模型）。尽管这些模型均为优良的研究手段，但技术上较为复杂，且存在诸多缺陷，如设置时间较长、操作复杂、有效表面积较小、需要泵和加压装置，通常还需使用密封剂和垫圈，这既给无菌环境的维持带来挑战，也难以同时开展多个实验。然而，如果能够获得通量更高的流动与剪切模型，则有望更快速地推进对血管内皮细胞剪切响应的研究，尤其是在分子水平上对周期性剪切的研究。本文中，我们介绍剪切环的构建与使用方法：这是一种新型、易于组装、成本低廉的组织培养模型，具有相对较大的表面积，可方便地在内皮细胞的单向、周期性剪切应力研究中实现大量实验重复。
引言
流体剪切应力已被证明可通过激活顺式调控元件1-5、组蛋白乙酰转移酶活性6以及剪切应力反应元件（SSRE）78，调控内皮细胞的基因表达程序。剪切应力通过调节组织因子9和组织型纤溶酶原激活物（tPA）10的表达，影响内皮细胞在凝血过程中的作用。剪切应力还通过调控血小板源性生长因子B（PDGF-B）的合成与反应性，影响血管生成11和血管重塑的调控8。内皮细胞分泌的血管活性介质，如肾上腺髓质素、内皮素-1、尾加压素II和松弛素，其表达也受剪切应力的调控12。内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的转录及其一氧化氮（NO）的生成均依赖于剪切应力10。剪切应力还可调控内皮细胞ICAM-1的表达13。因此，血流诱导的剪切应力可强烈影响多种内皮细胞反应。重要的是，血管搏动在正常血管老化及血管性痴呆的病理生理过程中也发挥着重要作用14，甚至可能参与多发性硬化等其他神经退行性疾病的发生发展15。
静脉和动脉内皮细胞本质上暴露于多种不同的血流动力学流动模式 体内，并可表现出多种不同的内皮细胞表型16根据血流大小和周期性的不同，内皮细胞可能产生....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 150 mm 直径剪切环的构建（图 1）
注意：通过改变外层和内层培养皿的尺寸，可构建出多种不同规格的剪切环装置，从而获得不同的总表面积、细胞产量以及施加的剪切力范围。本报告描述的是将一个150 mm培养皿与一个内层100 mm培养皿组合，总表面积为98 cm2（图2）。
图1. 剪切环组件。 图的上半部分显示了一个部分组装的剪切环。如果内层和外层培养皿之间尚未完全形成紧密密封，可使用移液管通过3 mm孔注入0.5 ml甲基氯化物。通过在剪切环顶部内边缘周围涂布一条约1 mm厚的硅橡胶粘合剂，将剪切环完全密封。图的下半部分显示了组装完成的剪切环。蓝色区域代表接种的内皮细胞区域。外层和内层的红色箭头分别表示当剪切环置于轨道摇床上时，剪切环本身及内部培养基的轨道运动方向。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本文展示了在剪切力环中培养的人脑微血管内皮细胞系 hCMEC/D3 和大鼠视网膜微血管内皮细胞单层的代表性结果。
在完全培养基 EBM 中培养 hCMEC/D3 脑微血管内皮细胞单层至完全汇合后，将剪切环置于轨道摇床上持续作用 72 小时。根据步骤 3.5 中的公式计算，最大剪切应力 
约为 2.8 dynes/cm2（参数取值为：
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
构建用于使内皮细胞暴露于剪切力的剪切环系统，是进行剪切应力研究的一种简单方法。然而，有几个步骤对于获得优质的剪切环并取得更好的实验结果至关重要。内环与外环之间应形成完全密封，以防止培养基泄漏，否则可能导致不同样本间的剪切应力不一致。如果未能形成完全密封，可通过内环上的孔洞，用移液管将少量二氯甲烷滴加至内盘与外盘之间的边缘处。轻轻旋转环体，可使二氯甲烷形成完整的密封。此外，在切割过程中可能意外产生塑料碎屑并残留在剪切环轨道上，因此在组装完成后应冲洗剪切环，以去除可能影响细胞生长并导致剪切应力施加不一致的任何残留物。
文章中描述的剪切环尺寸相对较大，导致每个样品的输出量较高。然而，可以使用较小的培养皿来构建更小的版本例如，100 mm 培养皿配 60 mm 插入环）。构建多个较小的剪切环可在与其他方法相比仍保持相对较大的液体体积和样品表面积的同时，实现更高数量的实验重复。
使用剪切环时已发现一些问题。首先，某些轨道摇床会产生过多热量，而某些培养箱无法有效控制温度升高。可通过适当选择旋转装置以及使用非水套式培养箱来.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
J. Winny Yun 获得了 Annette Funicello 基金会的研究资助。J. Steven Alexander 获得了路易斯安那州立大学健康科学中心-什里夫波特分校神经病学系的研究支持。
致谢
作者谨此感谢 Christopher Nguyen 先生、Aaron Hunter 以及什里夫波特 Jumpstart、SMART 和 Biostart 培训项目，同时感谢路易斯安那州什里夫波特百年学院生物物理学系的协助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 x 20 mm 塑料组织培养皿 | Corning | 430167 | 培养皿必须为聚苯乙烯材质 |
| 150 x 25 mm 塑料组织培养皿 | Corning | 430599 | 培养皿必须为聚苯乙烯材质 |
| 150 mm 玻璃培养皿 | Fisher | 3160150BO | |
| 15 ml 聚苯乙烯组织培养塑料离心管 | Falcon | 352099 | |
| 二氯甲烷 | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| 硅橡胶密封剂 | DAP | 7079808641 | |
| 乙醇 | Decon | 2701 | |
| 3 ml 移液管 | Becton-Dickinson | 357524 | |
| 打印纸 | |||
| 剪刀 | |||
| 手套 | |||
| 旋转工具及配件套装 | Dremel | 4000-6/50 | |
| 旋转工具切割头 | Dremel | EZ476 | |
| 旋转工具钻头 | |||
| 蒸馏水 | |||
| 轨道摇床 | VWR | 57018-754 | |
| 培养箱 | |||
| 大鼠视网膜微血管内皮细胞 | Cell Biologics | RA-6065 |
参考文献
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. FASEB J. 9 (10), 874-882 (1995).
- Malek, A. M., Izumo, S. Control of endothelial cell gene expression by flow. J Biomech. 28 (12), 1515-1528 (1995).
- Ando, J., Ka....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
