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方法文章

利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对人源MxA多亚基蛋白复合物的表征

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DOI：

10.3791/54683

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2016年10月28日

 , 
1Institute for Medical Virology, University of Zurich, 2Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research

本文内容

摘要

本文介绍了一种简单快速的实验方案，通过非变性PAGE结合Western印迹分析，检测人细胞裂解液中动力蛋白样GTP酶MxA蛋白的寡聚状态。

摘要

寡聚复合物的形成是许多蛋白质发挥正常结构与功能的关键前提。干扰素诱导产生的抗病毒效应蛋白MxA对多种病毒具有广谱抗病毒活性。MxA属于一种类似于动力蛋白的GTP酶，能够形成高级别的寡聚结构。然而，MxA是否必须通过寡聚化才能发挥其抗病毒活性，目前仍存在争议。本文介绍了一种简单的方法，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）结合Western印迹分析，检测在人源细胞系胞质组分中内源性或外源性表达的MxA蛋白的寡聚状态。该方法的关键步骤之一是选择合适的去垢剂，以防止蛋白质（尤其是与细胞膜相关的MxA蛋白）发生聚集或沉淀，同时不干扰其酶活性。另一个关键环节是使用碘乙酰胺对半胱氨酸残基的游离巯基进行不可逆保护，以避免蛋白产生人为的相互作用。本方法适用于对MxA蛋白寡聚状态进行简便评估，并可进一步实现MxA界面突变体的抗病毒活性与其各自寡聚状态之间的直接关联分析。

引言

蛋白质的四级结构在许多细胞过程中起着关键作用。信号通路、基因表达以及酶的激活/失活均依赖于蛋白质复合物的正确组装1-4。这一过程也称为同源或异源寡聚化，由不可逆的共价键或可逆的静电作用及疏水性蛋白质-蛋白质相互作用所介导。寡聚化不仅能在不增加基因组大小的情况下增加细胞过程的多样性，还为蛋白质提供了一种形成稳定复合物的策略，使其更耐变性和降解5。寡聚化缺陷会影响蛋白质功能，并可能导致疾病的发生。例如，苯丙氨酸羟化酶可形成四聚体复合物，该复合物内部的某些突变可能削弱四聚体的形成，从而导致苯丙酮尿症的发生6。

人MxA蛋白是一种由干扰素（IFN）诱导产生的抗病毒效应蛋白，对多种RNA病毒和DNA病毒均具有广谱抗病毒活性7。它属于动力蛋白样大GTP酶超家族，能够在体外形成大型寡聚结构in vitro8。已有研究提示，寡聚化可能有助于保护MxA免于快速降解9,10。尽管多个研究团队进行了大量努力，MxA的作用分子机制仍不明确，其寡聚状态在抗病毒功能中的作用也尚存争议9,11,12。在此方面，Gao及其同事提出了一种模型，认为MxA以大型环状寡聚结构的形式与病毒核蛋白相互作用，从而发挥抗病毒活性11。然而，最近我们证明MxA二聚体也具有抗病毒活性，并能与甲型流感病毒的核蛋白相互作用12。基于MxA的晶体结构，Gao及其同事鉴定了寡聚化界面区域中多个对体外寡聚化及其抗病毒功能至关重要的氨基酸残基in vitro和抗病毒功能11,13。因此，为了阐明MxA的哪种寡聚状态具有抗病毒活性，我们试图建立一种简便的实验方案，以快速确定在人细胞中表达的MxA界面突变体以及经IFNα刺激后表达的内源性MxA的寡聚状态。

尽管已有多种常用技术可用于研究蛋白质之间的相互作用，例如分裂绿色荧光蛋白（split-GFP）互补分析14、表面等离子共振15以及荧光共振能量转移（FRET）16，但这些方法无法提供有关寡聚蛋白复合物确切化学计量比的信息。针对这一特定方面的研究，多角度光散射（MALS）17和分析型超速离心18等技术则非常有用。通常，使用这些方法分析的蛋白质为纯化的蛋白质。然而，寡聚化过程可能还依赖于其他细胞内因素。如果这些因素未知，则分析将更加困难。此外，某些蛋白质在E. coli中难以表达和纯化。因此，这些方法并非在细胞环境中分析蛋白质寡聚化的最佳选择。另外，这些技术需要昂贵的仪器，而这些仪器并不容易获得。

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、尺寸排阻色谱或化学交联后接常规十二烷基硫酸钠（SDS）-PAGE，是用于表征细胞裂解液中寡聚体形成的有用工具2,19,20。这些方法无需特殊设备，可在标准实验室中轻松实施。我们最初评估了多种化学交联方案，但这些方案 invariably 导致 MxA 发生非特异性聚集和沉淀。因此，我们随后测试了非变性 PAGE 方案。由于非变性 PAGE 不使用 SDS，蛋白质的迁移依赖于其天然电荷。蓝非变性 PAGE 利用考马斯亮蓝 G250 使蛋白质携带整体负电荷，作用类似于 SDS，但不会使蛋白质变性21。然而，考马斯亮蓝在含有高盐和二价阳离子（例如 Mg2+）的裂解缓冲液中会发生沉淀，而这些成分常被添加至裂解缓冲液中。根据所用缓冲液的不同，可能难以在不对影响寡聚蛋白复合物的步骤进行进一步优化的情况下分析样品。

本文介绍了一种基于先前发表方法22的简单实验方案，利用非变性PAGE检测来自细胞裂解液的人源MxA蛋白的寡聚化状态。

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方案

注意：本方案基于先前发表的非变性 PAGE 方案12。在该研究中，通过过表达 MxA 的 Vero 细胞或经 IFN-α 刺激后表达内源性 MxA 的 A549 细胞评估了 MxA 蛋白的寡聚状态。下述方案可用于分析除 MxA 外任何蛋白的寡聚状态，但可能需要进一步优化。

1. 非变性PAGE用细胞裂解液的制备

注意：为了分析Vero或A549细胞中人MxA蛋白的寡聚状态，需收集1.0 × 106个细胞。根据细胞类型或待分析蛋白的丰度，应相应调整细胞数量。此外，在加入对光敏感的碘乙酰胺后，必须注意避免裂解缓冲液暴露于光照下。

  1. 将 A549 或 Vero 细胞以每孔 0.3 × 106 个接种至 6 孔板中。每孔加入 2 ml 生长培养基（见表 1）。在细胞培养箱中孵育过夜（37 °C，5% CO2）。
  2. 用 1 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后加入 0.5 ml 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）1× 溶液，在室温下作用约 5 分钟以使细胞脱落。
  3. 一旦细胞从培养皿上脱落，立即加入 0.5 ml 生长培养基，并通过上下吹打轻轻混匀。
  4. 将每孔的细胞转移至一个 2 ml 离心管中，使用台式离心机离心收集细胞沉淀（5,000 × g，4 °C，5 分钟）。
  5. 用移液器小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。
  6. 用 1 ml 冰冷的 PBS 洗涤细胞，通过上下吹打轻轻重悬细胞悬液。
  7. 在台式离心机中离心收集细胞（5,000 × g，4 °C，5 分钟）。
  8. 用移液器小心吸除上清液，避免使细胞沉淀脱落。
  9. 用 200 μl 冰冷的裂解缓冲液（见表 1）通过上下吹打重悬细胞，并置于冰上。
  10. 立即用锡箔纸包裹离心管以避光，并在冰上孵育 30 分钟。
    注意：在冰上孵育 30 分钟后，不再需要对裂解液进行避光保护，因为游离巯基的保护反应已不可逆。
  11. 在预冷的台式离心机中离心去除细胞碎片（13,000 × g，4 °C，20 分钟）。
  12. 在离心过程中，将透析柱于 4 °C 冷室中用透析缓冲液（表 1）平衡 20 分钟。使用截留分子量为 10,000 的透析柱。
    1. 将透析柱固定在浮力支架上，并放入盛有透析缓冲液的烧杯中。为确保轻柔搅拌，使用磁力搅拌器。切勿触碰透析膜。
      注意：透析柱可直接购买，也可根据 Fiala 及其同事19描述的方法用 1.5 ml 离心管自行制备。
  13. 从透析缓冲液和浮力支架上取下透析柱。用移液器将澄清的裂解液转移至已准备好的透析柱中，避免接触透析膜。将透析柱重新固定在浮力支架上，并放回盛有透析缓冲液的烧杯中。
  14. 在 4 °C 条件下，将裂解液在含有冰冷透析缓冲液（表 1）的烧杯中透析至少 4 小时（或更佳为过夜），同时使用磁力搅拌器轻柔搅拌。每 200 µl 裂解液体积应使用至少 100 ml 透析缓冲液。
  15. 将透析后的样品转移至 1.5 ml 离心管中。在台式离心机中离心去除沉淀（13,000 × g，4 °C，20 分钟）。为防止寡聚蛋白复合物解离，透析后应立即进行后续实验步骤（第 2 节）。切勿冷冻已制备的裂解液。

2. 电泳

注意：电泳操作按照先前所述方法进行，但略有修改22。在下述方案中，使用了预制的梯度凝胶（4–15% 梯度）。或者，凝胶也可在实验室中自行制备。必须避免使用任何变性剂（如SDS），以防止寡聚蛋白复合物解离，这一点至关重要。电泳时间已针对人MxA蛋白的不同寡聚状态进行了优化。然而，对于其他蛋白，电泳时间可能有所不同，具体取决于寡聚复合物的大小以及分析复合物所需达到的分离范围。因此，最佳电泳时间应通过实验确定。为了获得待分析寡聚体的最佳分辨率，电流不应超过25 mA。

  1. 在凝胶室中组装非变性PAGE凝胶。向内槽和外槽中加入预冷的电泳缓冲液（表1）。
  2. 在4 °C的冷室中，使用预冷的运行缓冲液以每块凝胶25 mA的电流预电泳15分钟。
  3. 取15 µl上述制备的裂解液与5 µl 4x上样缓冲液（表1）混合。样品勿需煮沸。
  4. 每孔上样15 µl样品，并同时加载选定的天然蛋白标准品。在4 °C冷室中以25 mA电流电泳运行4小时。
    注意：对于半定量分析，可进行蛋白定量实验（例如 Bradford蛋白测定法23），以确保每泳道上样等量的总蛋白。

3. 蛋白质印迹

注意：以下描述的是湿转 Western 印迹系统的操作步骤。可使用任何类型的印迹膜。在将聚偏二氟乙烯（PVDF）膜置于印迹缓冲液中平衡之前，需先将其在100%甲醇中活化。也可采用半干转 Western 印迹技术，但该方法需要针对较大的寡聚复合物进行优化。

  1. 拆卸凝胶，并小心将其转移至 SDS 缓冲液中（表 1）。
  2. 室温下轻轻振荡孵育 10 分钟。
  3. 每块凝胶准备 2 块海绵、4 张纤维素滤纸和 1 张转印膜。将其浸泡于转印缓冲液中（表 1）。
  4. 按以下顺序组装“三明治”结构（从下至上）：1 块海绵、2 张纤维素滤纸、转印膜、凝胶、2 张纤维素滤纸、1 块海绵。
  5. 将“三明治”结构放入转印槽中。确保转印膜朝向正极，凝胶朝向负极。
  6. 用预冷的转印缓冲液充满转印槽。
  7. 在 4 °C 下以 90 mA 恒流转印过夜，以获得最佳的蛋白转移效果。
  8. 拆开“三明治”结构，将膜在 Ponceau S 溶液中孵育 5 分钟（室温），以显影蛋白标准品。
  9. 用去离子水小心漂洗，去除 Ponceau S 染色液，直至清晰可见蛋白标准品的条带。
  10. 使用记号笔标记蛋白标准品的条带。
    注意：残留的 Ponceau S 可能干扰后续免疫染色。为避免此问题，可将膜在 0.1 M NaOH 中孵育 1 分钟，随后用去离子水充分洗涤，以进一步脱色。
  11. 用封闭缓冲液（见 表 1）在室温下封闭至少 1 小时，或在 4 °C 下封闭过夜。
  12. 使用针对目标蛋白的特异性抗体，通过免疫染色法检测目的蛋白。
    注意：人 MxA 蛋白的检测使用兔多克隆抗体（抗人 Mx1 抗体），按 1:1,000 比例稀释于封闭缓冲液中（表 1），4 °C 孵育过夜。也可选用单克隆抗 MxA 抗体（克隆 143）（数据未显示）24。

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结果

采用非变性 PAGE 分析了人野生型 MxA、二聚体界面突变体 MxA(R640A) 和 MxA(L617D)，以及单体界面突变体 MxA(M527D) 在细胞裂解液中的寡聚状态12。细胞在含有 1% 辛基苯氧基聚乙氧基乙醇（NP-40）和碘乙酰胺的缓冲液中裂解，以确保蛋白质溶解并保护游离巯基（见图 1）。如前所述，通过透析去除盐和小分子代谢物19。使用非变性 PAGE 进行蛋白质分离。为促进高效的 Western 印迹，转膜前将凝胶在 SDS 缓冲液中孵育。采用兔抗 MxA 多克隆抗体通过免疫印迹检测 MxA 蛋白。实验流程见图 2。

为了比较来自IFN-α刺激的A549细胞的内源性人MxA蛋白的寡聚状态，我们将缺乏内源性MxA的Vero细胞转染了重组型野生型、单体和二聚体MxA变体。与未染色的天然蛋白标记物相比（图3A），这些重组型野生型、单体和二聚体MxA变体分别形成...

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讨论

本文介绍一种简单方法，可通过非变性PAGE结合Western印迹分析，快速确定在哺乳动物细胞中表达的蛋白质的寡聚状态。该方法的主要优势在于，无需预先纯化蛋白质，即可直接从全细胞裂解液中确定特定蛋白质的寡聚状态。这对于那些在辅助因子存在下发生寡聚化或发挥功能的蛋白质尤为重要。此外，蛋白质仍保持其天然状态，若进一步从凝胶中回收，还可测定其酶活性或其他蛋白质功能，并将其与寡聚状态相关联。

该方案的一个关键环节是在样品制备过程中选择合适的去垢剂。这对于与细胞膜相关的蛋白质尤为重要。MxA 似乎主要与光面内质网的膜结构相关联。 25对于细胞裂解，非离子型去污剂NP40效果最佳，可防止MxA沉淀。按照先前所述方法，通过透析进行缓冲液置换并去除裂解液中的低分子量杂质 19 在凝胶电泳过程中，需添加0.1%的3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐（CHAPS）以防止MxA沉淀。此外，CHAPS不会干扰MxA的酶活性，这一点已通过在表达纯化的重组MxA蛋白测定证实 E. coli 12去垢剂在裂解过程中不...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由瑞士国家科学基金会（资助号：31003A_143834）向 JP 提供的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Slide-A-Lyzer MINI 透析装置，10K 截留分子量，0.5 mlThermo Fisher Scientific69570在透析缓冲液中预平衡（如需去除甘油）
可根据 Fiala 等人 2011 年的方法自制
4–15% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶，10 孔Bio-Rad456-1083用运行缓冲液预电泳以平衡缓冲系统
cOmplete, Mini, 无 EDTA 蛋白酶抑制剂Roche 11836170001每 50 ml 使用 1 片
PBS，pH 7.4  500 ml 瓶装，GibcoThermo Fisher Scientific14190-094
丽春红 S 溶液Sigma-AldrichP7170有毒 操作时需佩戴手套并保护眼睛
NativeMark 未标记蛋白标准品  50 µlInvitrogenP/N 57030每孔上样 5 µl
A549 细胞ATCCATCC CCL185在生长培养基中培养（见 表 1）
Vero 细胞ATCCATCC CCL81在生长培养基中培养（见 表 1）
抗 Mx1 抗体Novus BiologicalsH00004599_D01P使用稀释比例为 1:1,000
ECL 抗兔 IgG，辣根过氧化物酶标记的全抗体（驴来源）GE-HealthcareNA934V使用稀释比例为 1:10,000
0.5% 胰蛋白酶-EDTA (1x)        Life TechnologiesThermo Fisher15400-054
碘乙酰胺   5 gSigma-AldrichI-6125储存液  100 mM
溴酚蓝Sigma-AldrichB0126-25G
DMEM +4.5g/l 葡萄糖，+L-谷氨酰胺，+丙酮酸，Life TechnologiesThermo Fisher Scientific41966-029
青霉素-链霉素 100 x      100ml               Life TechnologiesThermo Fisher Scientific15140 - 130
Glutamax 100x 储存液，100 ml     Life TechnologiesThermo Fisher Scientific350500-038
透析胎牛血清，美国来源，500 ml，Gibco，批号：42G9552KThermo Fisher Scientific10270-106
纤维素滤纸Bio-Rad1703965
PVDF 印迹 膜GE-Healthcare10600022
三羟甲基氨基甲烷（Tris）Biosolve0020092391BS
氟化钠（NaF）Sigma AldrichS-7920
NP-40Calbiochem492015
cOmplete, Mini, 无 EDTA 蛋白酶抑制剂Roche 11836170001
吐温 20（Tween 20）Calbiochem6555204
CHAPS 10% 溶液AmrescoN907
DL-二硫苏糖醇（DTT）Sigma Aldrich43819
甘氨酸Biosolve0007132391BS
正钒酸钠（Na3VO4）Sigma Aldrich450243
甘油Sigma AldrichG7757
β-甘油磷酸盐Sigma AldrichG9422
脱脂奶粉Migros/瑞士
甲醇Millipore1.06009
氯化钠（NaCl）Sigma Aldrich71380
氯化镁（MgCl2）Amresco288
十二烷基硫酸钠（SDS）Sigma AldrichL4509
氢氧化钠（NaOH）Sigma AldrichS-8045

参考文献

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MxA 寡聚化非变性PAGE蛋白质印迹分析碘乙酰胺保护细胞裂解液制备透析缓冲液平衡蛋白质复合物表征抗病毒活性评估内源性MxA检测四聚体形成分析
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