使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳人的MxA多亚基蛋白复合物的表征

Summary

本文描述了一种简单快速的方案，该方案使用非变性 PAGE 与蛋白质印迹分析的组合来评估来自人类细胞裂解物的动力蛋白样 GTP 酶 MxA 蛋白的寡聚状态。

Abstract

寡聚复合物的形成是许多蛋白质正确结构和功能的关键先决条件。干扰素诱导的抗病毒效应蛋白 MxA 对许多病毒具有广泛的抗病毒活性。MxA 是一种动力蛋白样 GTP 酶，具有形成更高阶寡聚结构的能力。然而，MxA 的抗病毒活性是否需要寡聚化是一个争论的问题。我们在这里描述了一个简单的方案，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 结合 Western blot 分析来评估人细胞系细胞质级分中内源性或异位表达的 MxA 的寡聚状态。该方案的一个关键步骤是选择去污剂，以防止与细胞膜（如 MxA）特别相关的蛋白质聚集和/或沉淀，而不会干扰其酶活性。该方案的另一个重要方面是碘乙酰胺对半胱氨酸残基的游离巯基的不可逆保护，以防止蛋白质的人为相互作用。该方案适用于对 MxA 的寡聚体状态的简单评估，并且还允许 MxA 界面突变体的抗病毒活性与其各自的寡聚体状态直接相关。

Introduction

蛋白质的四级结构起着许多细胞过程至关重要的作用。信号通路，基因表达，和酶的激活/停用所有依赖蛋白复合物^1-4的正确组装。这个过程也被称为均聚物或杂低聚是由于不可逆的共价的或可逆的静电和疏水蛋白 - 蛋白相互作用。低聚不仅多样化的不同的细胞过程，而不增加基因组的大小，而且还提供了策略蛋白质来构建稳定的复合物是对变性和降解⁵更耐。在低聚缺陷对蛋白质的功能产生影响，并可能导致疾病的发展。例如，酶苯丙氨酸羟化酶形成四聚体复合物。蛋白质复合物内的一些突变可以削弱四聚体的形成，并导致该疾病苯丙酮尿症^6。

人MxA蛋白是干扰素（IFN）诱导的抗病毒效应蛋白施加对抗各种RNA的一个广泛的抗病毒活性以及DNA病毒^7。它属于dynamin上样大GTP酶超家族，并具有在体外形成^8个大寡聚结构的能力。齐聚已建议，以保护从MxA蛋白快速降解^9,10。尽管许多研究小组加紧努力，作用的分子机制在很大程度上仍然难以捉摸和的MxA为它的抗病毒功能齐聚国家的作用正在辩论^9,11,12。在这方面，高和同事提出，其中的MxA通过在大环状寡聚结构¹¹的形式的病毒核蛋白相互作用而发挥其抗病毒活性的模型。然而，最近，我们证明了MxA蛋白二聚体具有抗病毒活性，流感病毒¹²的核蛋白进行交互。乙ASED上的MxA....

Protocol

注意:此协议是基于以前出版的非变性PAGE协议^12。在该研究中，MxA蛋白的寡聚状态使用或Vero细胞过表达的MxA或IFN-α刺激的A549细胞表达内源性的MxA进行了评估。下面描述的协议可以用来分析除了的MxA任何蛋白质的寡聚状态。然而，可能需要进一步优化。

1.细胞裂解物的制备非变性PAGE

注意:为了分析在任一的Vero或A549细胞的人MxA蛋白的寡聚状态，收获1.0×10 ^6个细胞。取决于细胞类型或分析蛋白质的丰度，细胞数应调整。同样重要的是要尽快光敏碘乙酰胺加入保护裂解缓冲液从曝光。

1. 每孔种0.3×10 ^6个 A549或Vero细胞中6良好的菜肴。保持在每孔2mL的生长培养基中的细胞（ 见表1）。过夜孵育细胞在细胞培养孵育箱（37℃，5％CO _2）。
2. 收获洗涤的细胞用1ml磷酸盐缓冲盐水（PBS），并通过加入0.5ml 0.25％的胰蛋白酶 - 乙二胺四乙酸（EDTA），在室温下大约5分钟，1倍溶液分离。
3. 一旦细胞从培养皿分离，将0.5ml生长培养基中并通过上下抽吸小心混合。
4. 传送每个细胞以及成1个2毫升管，并用台式离心机（5000 xg离心，4℃，5分钟）沉淀它们。
5. 小心取出吹打上清，而不会干....

Results

使用非变性PAGE，我们分析了人野生型MxA蛋白，二聚体界面突变体的MxA（R640A）和MxA蛋白（L617D），以及从细胞裂解物¹²单体界面突变体的MxA（M527D）的寡聚状态。细胞在含有1％辛基苯氧基（NP-40）和碘乙酰胺，以确保蛋白质溶解和游离的巯基的保护缓冲液中裂解（参见图1）。如前所述，盐和小代谢物通过透析¹⁹除去。蛋白分离是通过非变性PAGE进行。促进有效免疫印迹，将凝胶在SDS缓冲液印迹之前温育。所述的MxA蛋白通过使用针对的MxA一兔多克隆抗体的免疫染色可视化。工作流在图2中说明。

从IFN-α比较内源性人MxA蛋白的寡聚状态 ;刺激的A549细胞中，我们转染Vero细胞（缺乏内源性的MxA）用重组野生型，单体和二聚体的MxA变体。这些重组野生型相比，未染色天然蛋白质标记（ 图3A）时单体和二聚体的MxA变形成稳定的四聚体，分别单体和二聚体，。因此，我.......

Discussion

在这里，我们描述一个简单的方法，它允许通过非变性PAGE，随后通过Western印迹分析在哺乳动物细胞中表达的蛋白质的寡聚状态的快速测定。这种方法的主要优点是，一个给定的蛋白的寡聚状态可以从没有事先的蛋白质纯化全细胞裂解物来确定。这可能是对于低聚或发挥它们的相关联功能的辅助因子蛋白重要。此外，该蛋白仍然在其天然状态，如果进一步从凝胶中提取，酶活性或其它蛋白质的功能可以被确定和相关的寡聚状态。

该协议的一个重要方面是洗涤剂样品制备过程中的选择。这是特别重要的用于与细胞膜相关的蛋白质。 MxA蛋白似乎与滑面内质网²⁵的膜进行相关的主要。对于细胞裂解的非离子型洗涤剂NP40是最佳的，防止MxA蛋白的沉淀。缓冲液交换和去除的透析的裂解物的低分子量杂质之后如先前¹⁹描述的0.1％3的存在下- [（3-胆酰胺丙基）二甲氨基]需要-1-丙烷（CHAPS）中，以防止凝胶中的MxA的沉淀电泳。此外，CHAPS不与MxA蛋白的酶活性干扰与在大肠杆菌中表达的纯化的重组MxA蛋白测定大肠杆菌 ^12。.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slide-A-Lyzer MINI 透析装置，10K MWCO，0.5 ml	Thermo Fisher Scientific	69570	在透析缓冲液中预平衡（如果需要去除甘油） 可以根据 Fiala 等人 2011
&ndash 自制;15% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶，10 孔，	Bio-Rad	456-1083	预运行缓冲液，以调整缓冲液系统
cOmplete、Mini、不含 EDTA	Roche	11836170001	每 50 ml
PBS（pH 7.4）使用 1 片剂  装瓶 500 ml Gibco	Thermo Fisher Scientific	14190-094
丽春红 S 溶液	Sigma-Aldrich	P7170<	强>毒性 戴手套并保护眼睛
NativeMark 未染色蛋白质标准品  50 µl	Invitrogen	P/N 57030	负载 5 µl/孔
A549 细胞	ATCC	ATCC CCL185	在生长培养基中生长（见<强>表 1）
Vero 细胞	ATCC	ATCC CCL81	在生长培养基中生长（见<强>表 1）
抗 Mx1 抗体	Novus Biologicals	H00004599_D01P	以 1：1,000 稀释度使用
ECL 抗兔 IgG、辣根过氧化物酶连接的全抗体（来自驴）	GE-Healthcare	NA934V	以 1：10,000 稀释度使用
0.5% 胰蛋白酶-EDTA （1x）       Life Technologies	Thermo Fisher	15400-054
乙酰胺  5克	Sigma-Aldrich	I-6125	库存  100 mM
溴酚蓝	Sigma-Aldrich	B0126-25G
DMEM +4.5g/l Gluc，+L-Glut，+Pyruvate life technologies	Thermo Fisher Scientific	41966-029
链球菌 100 x    100 毫升              Life Technologies	Thermo Fisher Scientific	15140 - 130
Glutamax 100x原液，100毫升    Life Technologies	Thermo Fisher Scientific	350500-038
牛血清，透析，美国原产地500 ml Gibco 批次：42G9552K	Thermo Fisher Scientific	10270-106
滤纸	Bio-Rad	1703965
PVDF 印迹  膜	GE-Healthcare	10600022
Tris（羟甲基）氨基甲烷	Biosolve	0020092391BS
氟化钠 （NaF）	Sigma Aldrich	S-7920
NP-40	钙生物化学	492015
cOmplete， Mini， 不含 EDTA	的罗氏
吐温 20	钙生化学	6555204
CHAPS 10% 溶液	Amresco	N907
DL-二硫苏糖醇 （DTT）	Sigma Aldrich	43819
甘氨酸	Biosolve	0007132391BS
原钒酸钠 （Na3VO4）	Sigma Aldrich	450243
甘油	Sigma Aldrich	G7757
β-甘油磷酸盐	Sigma Aldrich	G9422
奶粉	Migros/瑞士
甲醇	Millipore	1.06009
氯化钠 （NaCl）	Sigma Aldrich	71380
氯化镁 （MgCl2）	Amresco	288
十二烷基硫酸钠 （SDS）	Sigma Aldrich	L4509
氢氧化钠 （NaOH）	Sigma Aldrich	S-8045