超声评估大鼠肱动脉和股浅动脉的血流介导性舒张功能

摘要

在人类中，内皮功能的无创评估可通过血流介导的血管扩张技术实现。尽管已有数千项研究使用了该技术，但尚无研究在大鼠中实现该技术的无创操作。以下文章描述了在大鼠肱动脉和浅股动脉中进行血流介导的血管扩张的无创测量方法。

摘要

动脉对管壁剪切率升高的舒张反应可反映血管内皮功能。在人体中，可通过血流介导的舒张技术无创地测量内皮功能，该技术通常在肱动脉或浅股动脉中进行。简而言之，在超声探头远端放置一个血压袖带，并将其充气至高于收缩压的压力，从而引起肢体缺血。在5分钟的阻断后释放袖带，导致反应性充血，管壁剪切率升高，进而触发内皮细胞释放舒血管分子，引起血管舒张。尽管已有数千项研究在人体中开展血流介导的舒张实验，但令人意外的是，尚无研究在活体大鼠中无创地实施该技术。考虑到近年来研究重点日益转向转化医学，在大鼠及其他啮齿类动物中建立无创测量血流介导舒张的标准化操作指南将具有重要价值。本文提供了一套在大鼠肱动脉和浅股动脉中无创测量血流介导舒张的实验方案，因这些血管部位在人体研究中最常被检测。

引言

血管内皮是一层单细胞结构，衬于动脉管腔内壁，是调节血管功能的重要组织。内皮细胞会释放多种分子，从而调节血管直径。在这些分子中，一氧化氮（NO）似乎是血管内皮在受到刺激（例如胰岛素、乙酰胆碱或剪切应力变化）后释放的主要扩血管分子¹。在血管内皮中，NO由内皮型一氧化氮合酶（eNOS）催化生成，随后从内皮细胞释放出来²。NO扩散至血管平滑肌，引起平滑肌松弛，从而增加血管直径³。

内皮功能障碍可通过血流介导的血管扩张（flow-mediated dilation, FMD）技术在人体中进行无创评估^4,5。FMD 被认为可作为反映人体内皮源性一氧化氮（NO）生物利用度的功能性生物测定方法，通常在肢体阻塞约 5 分钟后，通过反应性充血刺激，于肱动脉或浅表股动脉处进行评估⁶。反应性充血会增加作用于内皮细胞的层流剪切力⁷，从而触发 NO 的释放信号⁸。尽管近年来关于 NO 释放所引发的血管舒张所占比例仍存在争议^9,10，但 FMD 能够反映内皮依赖性血管舒张功能，并已被持续证实可用于预测心血管事件^11-13。

迄今为止，已有数千项研究采用血流介导舒张（FMD）技术对人类内皮功能进行无创测量。鉴于近年来研究重点已转向转化医学，建立适用于啮齿类动物FMD无创测量的指南将极具价值。为保持转化研究的一致性，本实验方案针对大鼠肱动脉和浅股动脉的FMD测量而制定，因为这些血管部位在人类研究中最常被检测。本方案可在大鼠中获得稳定且可重复的FMD反应，然而大鼠FMD的测量在技术上具有较高难度，若无视频演示，其他研究人员可能难以成功重复该操作。因此，本文将演示一种用于大鼠肱动脉和浅股动脉FMD无创测量的方法。

方案

所有动物实验均遵循《实验动物护理与使用指南》¹⁴，并经犹他大学和盐湖城退伍军人事务医疗中心动物护理与使用委员会批准。

1. 动物准备

1. 将动物放入含有3%异氟烷和100%氧气的麻醉诱导室中。使动物在诱导室内停留，直至其对外界刺激无反应。
2. 将动物从诱导室中取出，置于配备心电图（ECG）电极的加热检查台上。以3%异氟烷和100%氧气维持麻醉。肱动脉和股浅动脉血流介导舒张（FMD）不能同时进行。因此，每项测量的准备步骤如下所列。

2. 肱动脉准备

1. 将动物仰卧位固定，并使用手术胶带将其左前肢和两后肢固定于检查台上。
2. 固定动物右前肢，使其前肢下段略高于平台约0.2–0.5 cm。
3. 在动物右前肢涂抹脱毛剂（如Nair），以去除毛发。
4. 在右前肢肘关节远端放置一个阻断袖带（内径10 mm的标准血管阻断器）。切勿将阻断器直接放置在平台上，因为充气和放气过程会导致肢体移动，干扰超声图像。
5. 使用超声键盘将超声设备设置为B模式。
6. 在阻断袖带近端的动物前肢部位涂抹少量超声耦合剂。
7. 手动调整连接在立体定位支架上的超高频线阵探头，使其与前肢对齐。肱动脉应位于皮下2–3 mm处，清晰可见。
8. 为确认成像目标为肱动脉而非肱静脉，使用超声键盘切换至脉冲多普勒模式（PW模式）。动脉表现为搏动性血流，而邻近静脉则表现为连续性血流。

3. 股浅动脉准备

1. 将动物仰卧位固定，并用手术胶带将其上肢和左下肢固定在检查台上。
2. 使用垫片（例如折叠的纸巾）将动物右下肢固定于高于平台约0.5–1 cm的抬高位置。
3. 在动物右下肢涂抹脱毛剂（例如Nair）以去除毛发。脱毛后，股静脉应在大腿内侧上部清晰可见。
4. 在右踝近端放置一个阻断袖带（内径10 mm的标准血管阻断器）。切勿将阻断器直接放置在平台上，因为充气/放气会导致下肢移动，干扰超声图像。
5. 将超声设备设置为B模式。
6. 在动物下肢、阻断袖带近端处涂抹少量超声耦合剂。
7. 手动调整连接在立体定位支架上的超高频线阵探头，使其对准透过皮肤可见的股静脉。浅表股动脉应可见，深度小于<1 mm。
8. 为确认成像目标为浅表股动脉而非股静脉，请切换至脉冲多普勒模式（PW模式）。动脉表现为搏动性血流，而邻近的静脉则表现为连续性血流。

4. 基线期

1. 优化B型图像，方法类似于在人体中进行的操作¹⁵。确保观察到血管的横向纵向图像，并在血管壁两侧均能清晰显示内膜-中膜结构。通过轻微调整超声探头的位置，使尽可能多的动脉段落在成像窗口中可见，从而优化图像。
   1. 或者，可通过调整亮度/对比度、聚焦区域、频率、动态范围和扫描线密度等超声设置来获得更佳图像。还有其他优化超声图像的方法，但这些方法的详细描述不在本实验方案的范围之内。
2. 在完成动脉图像优化后，开启心电门控（ECG-gating），仅显示R波期间捕获的图像，以确保每个心动周期的舒张期仅采集一个直径帧。
   注：本实验方案所用超声设备可通过生理设置选项中的“ECG-gating”功能启用此模式，但并非所有超声设备均具备该功能。应在图像优化完成后开启心电门控，因为在较低帧率下（即每R波一次）获取图像较为困难。若不使用心电门控，由于大鼠心率较高，且需高帧率仅捕获心动周期的舒张期部分，因此每次录制仅能持续约10–20秒。每个视频片段的数据量大且繁琐，显著增加了后续分析负担。
3. 使用B型模式记录60秒的基础数据。
   注：超声设备始终处于记录状态，但由于超声视频片段可记录的帧数有限，并非所有图像都会被保存。可在设置中调整片段长度（即帧数），建议设置为每段最大帧数。当录制达到片段末尾（即达到最大帧数）时，录制将继续，但片段会向前滚动，仅保留最新捕获的帧，而超出最大帧数限制的早期帧将被自动删除。尽管不同设备在记录机制上存在差异，但可能需要根据实际情况调整录制长度。
4. 切换至脉冲多普勒模式（PW-mode）。将光标置于管腔中央。取样门将根据光标位置自动放置，但可通过超声键盘调整其宽度。保持入射角≤60°。
   1. 通过调节多普勒声束角度来调整入射角，并使用超声键盘进行微调。如果上述方法均无法获得适合测量的角度，可手动倾斜探头，将动脉调整至更佳角度。一旦对超声角度进行了任何调整，需重新采集B型图像。
5. 记录10秒的血流速度数据。

5. 闭塞阶段

1. 使用一个装有空气的10 ml注射器充气以膨胀血管阻断器。为保持血管阻断器内的气压恒定，将管路自身折叠并用文件夹夹子夹住折叠处。
2. 切换至脉冲多普勒模式（PW模式），通过观察血流速度显著降低来确认袖带已成功阻断血流。
3. 切换至B模式，并以60秒为一段录制数据，持续至完成4分45秒的阻断时间。
4. 切换回脉冲多普勒模式（PW模式）。记录每次超声采集时的心率及对应时间，以供后续分析。

6. 高充血期

1. 在脉冲波模式（PW模式）下记录时，通过从折叠的导管上取下长尾夹来松开袖带。在松开袖带前5秒和松开后5秒内进行记录。
2. 切换至B模式，并以60秒为片段持续记录数据，直至阻塞后3分钟。记录每次超声片段的心率及时间，以供后续分析。
3. FMD检测完成后，将动物从检查台移下，并持续监测，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。

7. 分析

1. 用于分析时，将超声图像以 DICOM 文件格式导出至配备边缘检测软件的离线计算机，该软件可对每一帧图像中的动脉直径进行无偏倚测定。虽然也可在超声仪器上直接进行分析，但不推荐此方法，因其耗时极长且易受研究者主观判断影响。
2. 在基线期和阻塞期，以 60 秒为时间段分析动脉直径数据；在充血期，则以 10 秒为时间段进行分析。
3. 使用自动边缘检测软件的血流分析功能分析血流速度数据。在基线期和阻塞期，通过测量 5 个或以上形态一致的连续波形来确定平均血流速度。在反应性充血期，取袖带释放后即刻的血流速度计算平均血流速度。其中血流速度最高的波形定义为峰值血流速度。

结果

对8只Wistar大鼠的肱动脉和股浅动脉进行了血流介导的血管舒张实验。大鼠的体位如图1所示。

股浅动脉的代表性超声图像见图2。

图1. 大鼠与超声探头定位。
用于测量肱动脉（A）和浅股动脉（B）血流介导性舒张（FMD）的大鼠体位。用于测量肱动脉（C）和浅股动脉（D）血流介导性舒张（FMD）的超声探头与阻断袖带的放置位置。

讨论

本研究展示了在大鼠肱动脉和浅股动脉中进行内皮依赖性血管舒张功能（FMD）的无创测量。与人类相似⁶，在5分钟的阻断后，血流速度迅速增加（即反应性充血），从而提高了动脉壁的剪切率，进而引起动脉的继发性舒张。在肱动脉和浅股动脉中均观察到了FMD现象。此外，不同动脉之间的FMD表现出高度相关性。尽管浅股动脉的峰值剪切率较高，但以峰值剪切率校正后的FMD在不同动脉之间仍保持显著的相关性。综上所述，这些结果表明，FMD的无创测量可在大鼠中成功实施。

尽管FMD在两条不同的动脉上进行测量，但以相对于基线的百分比变化表示时，FMD的幅度相似。然而，当以相对于基线的绝对变化表示时，肱动脉的FMD更高，因为该动脉的静息直径比股浅动脉大约25%。这些结果与在相同受试者中同时测量肱动脉和股浅动脉FMD的人体研究结果相似^17,18。尽管动脉直径存在差异，但两条动脉之间FMD（以相对于基线的百分比变化或绝对变化表示）的相关性极强。

血流介导的血管扩张被认为可作为人体内皮源性一氧化氮（NO）生物利用度的一种功能性...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Vevo 2100 高分辨率微型超声成像系统	VisualSonics, 多伦多, ON, 加拿大
MicroScan 超高频率线性阵列换能器 - MS-700 30-70 MHz	VisualSonics, 多伦多, ON, 加拿大
Vevo 成像工作站	VisualSonics, 多伦多, ON, 加拿大
Thermasonic 凝胶加热器	Parker Laboratories, 费尔菲尔德, NJ, 美国	82-03	可选
Signacreme 电极乳膏	Parker Laboratories, 费尔菲尔德, NJ, 美国	17-05
Transpore 外科手术胶带	3M, 枫木市, MN, 美国	1527-1
脱毛膏（例如，Nair）	通用耗材
棉签	通用耗材
超声耦合凝胶	通用耗材
标准血管阻断器，10 mm 内径	Harvard Apparatus, 霍利斯顿, MA, 美国	62-0115
10 ml 带鲁尔锁扣接头的注射器	通用耗材		用于阻断袖带装置
回形针	通用耗材		用于阻断袖带装置
皮下注射针头 – 18 号	通用耗材		用于阻断袖带装置
中型文件夹夹	通用耗材		用于阻断袖带装置