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Summary

在人类血管内皮功能的非侵入性的评估可以通过血流介导的扩张的技术来确定。虽然千研究中使用了该技术，没有研究在大鼠进行这种技术非侵入。下面的文章介绍肱血流介导的扩张和大鼠股浅动脉无创测量。

Abstract

Arterial vasodilation to increases in wall shear rate is indicative of vascular endothelial function. In humans, the non-invasive measurement of endothelial function can be achieved by employing the flow-mediated dilation technique, typically performed in the brachial or superficial femoral artery. Briefly, a blood pressure cuff placed distal to an ultrasound probe is inflated to a suprasystolic pressure, which results in limb ischemia. After 5 min of occlusion the cuff is deflated, resulting in reactive hyperemia and increases in wall shear rate that signal vasodilatory molecules to be released from the endothelium eliciting vasodilation. Despite the thousands of studies performing flow-mediated dilation in humans, surprisingly, no studies have performed this technique non-invasively in living rats. Considering the recent shift in focus to translational research, the establishment of guidelines for non-invasive measurement of flow-mediated dilation in rats and other rodents would be extremely valuable. In the following article, a protocol is presented for the non-invasive measurement of flow-mediated dilation in brachial and superficial femoral arteries of rats, as those sites are most commonly measured in humans.

Introduction

血管内皮是蜂窝单层该线条动脉的内腔并且是血管功能的重要调节剂。有从内皮释放众多分子导致血管直径的调制。在这些分子，一氧化氮（NO），似乎是在响应于刺激从血管内皮释放的主血管舒张分子（例如，胰岛素，乙酰胆碱，或剪切应力的变化^）1。在血管内皮细胞，编号是由酶产生内皮NO合酶（eNOS）和随后从血管内皮细胞²释放。否扩散到血管平滑肌，其中它引起松弛和增加的血管直径^3。

内皮功能障碍可以在利用血流介导的舒张（FMD）技术^4,5-人类非侵入性进行评估。口蹄疫已经提出来表示一个功能生物测定内皮衍生在人类中NO的生物利用度，且通常评估在下列一〜5分钟肢闭塞⁶响应于反应性充血肱或股浅动脉。反应性充血增加了被转导至内皮细胞的⁷层的剪切力，信令NO ⁸的释放。虽然近年来，血管舒张由NO释放发起的比重一直争论不休^9,10，口蹄疫表明内皮依赖性扩张，并一直被证明预测心血管事件^11-13。

迄今为止，成千上万的研究已经使用的口蹄疫技术用于人类血管内皮功能的非侵入性测量。考虑到在重点转化研究近期的转变，对口蹄疫的啮齿类动物的非侵入性测量准则将是非常有价值的。与平移方法保持一致，该协议是建立在肱动脉和苏佩FMD的测量大鼠rficial股动脉，由于这些网站都是人类最常用的测量。在大鼠一个强大的和可重复的口蹄疫响应这个协议的结果，然而，在大鼠口蹄疫测量技术要求高，可能是困难的其他研究者没有视频演示复制。因此，下面的文章将演示口蹄疫肱和大鼠股浅动脉血管无创测量的方法。

Protocol

所有动物的程序符合指南实验动物14的管理和使用以及犹他州大学和盐湖城的退伍军人医疗中心动物护理和使用获得批准。 1.动物的制备将动物含100％氧气3％异氟醚麻醉诱导室。留在感应室中的动物，直到它响应外部刺激。 从感应腔室取出动物，并将其放置在配备有心电图（ECG）电极加热的检查表。维持在100％的氧气3％异氟醚麻醉。肱动脉和股浅动脉FMD不能同时进行。因此，对于每个测定准备指令在下面列出。 2.肱动脉准备放置动物仰卧，抑制左上肢和一个各下肢进制与手术磁带的体检表。 抑制动物的右上肢，使上肢的下部略微升高的平台之上（〜0.2-0.5厘米）。 应用脱毛剂（如奈尔），以动物的右上肢去除毛发。 定位在右上肢远端的肘闭塞箍（10毫米管腔直径标准血管阻塞）。不休息平台上的封堵器，因为通胀/通缩将移动肢体，扰乱超声图像。 使用超声波键盘的超声波机器设置为B型。 应用超声凝胶的少量动物，近端闭塞箍的上肢。 手动对齐附着到立体支架与上肢的超高频线性阵列换能器。肱动脉应该是可见2-3毫米深。 以确认肱动脉，不肱静脉，正在成像，切换到使用超声波键盘PW-模式。动脉将脉动血流，而不是这将有连续血流相邻静脉。 3，股浅动脉准备定位动物仰卧和抑制上肢和左下肢到检查台与手术胶带。 抑制动物的右下肢到升高位置（〜0.5-1厘米），使用垫（例如，折叠的纸巾）的平台之上。 应用脱毛剂（如奈尔），以动物的右下肢去除毛发。脱毛后股静脉应在上内大腿清晰可见。 位置的闭塞套（10毫米管腔直径标准血管封堵器）近端右脚踝。不休息平台上的封堵器，因为通胀/通缩将移动下肢，扰乱超声图像。 超声机器设置为B模式。 应用超声凝胶的少量动物，近端闭塞箍的下肢。 手动对齐附着到立体支架与股静脉，这是通过皮肤可见的超高频线性阵列换能器。股浅动脉应该是可见的<1毫米深。 以确认该股浅动脉，而不是股静脉，进行成像，切换至PW-模式。动脉将脉动血流，而不是这将有连续血流相邻静脉。 4.基线阶段优化B模式图像，类似于如何将在人类15来完成。确保与在两壁可视内膜中层容器的水平，纵向图像观察。通过稍微调整超声探头位置，以确保尽可能多动脉尽可能优化图像是在拍摄窗口中查看。可替代地，调整超声波的设置，通过改变亮度/对比度，聚焦区，频率，动态范围和线密度，以获得更好的图像。还有其他的方法来优化超声图像，但这些详细的说明超出了本协议的范围。 动脉影像优化后，打开心门控只显示R波期间捕获，以确保只有一个直径收集框架是一个心动周期的每个部分舒张时的图像。 注：心电图门控可在该协议由生理的设置选项下选择ECG门控使用的超声波机器上，但是，此功能可能无法适用于所有超声仪器。图像被优化后的ECG门控应当接通，因为它是难以在较低的帧速率，以获得的图像（即，每R波一次）。没有心电图门控，在大鼠高心脏速率和要求高的帧的组合率捕捉心动周期的舒张部仅允许〜10-20秒的剪辑。数据的每个剪辑繁琐的大小和数量大大增加分析负担。 记录使用B模式的基线数据的60秒。 注：超声机总是记录，然而，并非所有的图像被存储在超声机上，因为有上可记录在超声剪辑帧的数目的上限。剪取物长度（即帧数）可在设置调整。建议以每夹帧的最大数量设置。当记录在剪辑的结束（即帧的最大数量达到），录制继续，但剪辑向前滚动捕捉最新的帧。在这种情况下，被抓获的最大帧的限制之外较早帧随后被删除。虽然这些错综复杂在记录机之间不同，记录长度的调整可能是必要的。 SWITCH为PW-模式。将光标放置在管腔的中间。样品闸门会自动在参照光标放置，但应可以调整为使用超声键盘宽度。保持≤60°的角度声波作用。 通过改变多普勒波束角度，调整角度声波作用。通过使用超声键盘进行细微调整的角度。如果这两个提供适合于测量的角度，手动通过倾斜动脉到一个更加最佳角度调整超声波探头。如果执行了超声角的任何调整，夺回B模式图像。 记录速度数据10秒钟。 5.遮挡阶段膨胀用空气填充10毫升注射器血管阻塞。为了保持空气压力恒定在血管封堵器，折上本身的管放置一个长尾夹在折叠管。 切换到PW-模式确认袖口闭塞，就是明证大量减少血流速度。 切换到B模式和记录数据，60秒的短片，直到闭塞4:45分钟。 切换到PW-模式。保持心脏率的记录，并分析各超声剪辑的时间。 6.充血阶段松开袖带通过从折叠管长尾夹PW-模式记录时间。录制5秒钟之前和袖口释放后5秒。 切换到B模式和记录数据，60秒的短片，直到闭塞后3分钟。保持心脏率的记录，并分析各超声剪辑的时间。 口蹄疫完成后请从体检表中的动物和监视，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧。 7.分析为了分析，出口超声如DICOM文件到装有边缘检测软件的脱机计算机，其允许无偏阻止动脉直径在每个帧的mination。分析是可能的超声机上，但是，它不推荐的，因为它是非常耗费时间和受研究者偏压。 期间基线和闭塞相分析60第二区段动脉直径数据，并在过程中充血性相10第二区段。 分析使用自动边缘检测软件的流量分析功能血液速度数据。通过在基线和闭塞阶段测量外观均匀的连续5个或多个波形确定平均血流速度。确定袖口释放后立即血流速度反应性充血时的平均血流速度。最高血流速度波形被认为是峰值血流速度。

Representative Results

于8 Wistar大鼠的肱动脉和股浅动脉进行血流介导的扩张。的大鼠的定位，如图1所示。 股浅动脉的代表超声图像示于图2。 图1. 鼠和超声定位。 大鼠的定位臂丛（A）的测量和?…

Discussion

在本研究中，FMD的一种非侵入性测量表现在肱动脉和大鼠股浅动脉。类似于人类^6，以下5分钟闭塞期内，在血流速度（即，反应性充血），从而在动脉壁上导致动脉的后续血管舒张增加的剪切速率迅速增加。口蹄疫是在肱动脉和股浅动脉两个观察。此外，还有在FMD动脉之间有很强的关系。虽然最高剪切速率在股浅动脉较高，口蹄疫归到最高剪切速率保持动脉之间牢固的关系。总之，这些结…

Materials

Vevo 2100 High Resolution Micro-Ultrasound Imaging System	VisualSonics, Toronto, ON, CAN
MicroScan Ultra-High Frequency Linear Array Transducer – MS-700 30-70 MHz	VisualSonics, Toronto, ON, CAN
Vevo Imaging Station	VisualSonics, Toronto, ON, CAN
Thermasonic gel warmer	Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA	82-03	Optional
Signacreme electrode cream	Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA	17-05
Transpore surgical tape	3M, Maplewood, MN, USA	1527-1
Depilatory cream (e.g., Nair)	General supply
Cotton swabs	General supply
Ultrasound gel	General supply
Standard vascular occluder, 10 mm lumen diameter	Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA	62-0115
10 ml syringe with Luer-Lok tip	General Supply		Used for occlusion cuff apparatus
Paperclip	General Supply		Used for occlusion cuff apparatus
Hypodermic needle – 18 gauge	General Supply		Used for occlusion cuff apparatus
Medium binder clip	General Supply		Used for occlusion cuff apparatus