Summary
הערכה לא פולשני של תפקוד האנדותל בבני אדם יכולה להיקבע על ידי טכניקת התרחבות בתיווך הזרימה. למרות אלפי מחקרים השתמשו בטכניקה זו, אף מחקר לא ביצע את הטכניקה הזאת הלא פולשני בחולדות. המאמר שלהלן מתאר מדידה לא פולשנית של התרחבות זרימה בתיווך של הזרוע ועורקי ירך שטחית של חולדות.
Introduction
האנדותל של כלי הדם הוא בשכבה הסלולר המרפדת את לומן של העורקים הוא וסת חשוב של תפקוד כלי הדם. יש מולקולות רבות שוחררו מבית האנדותל שתוצאתן אפנון של קוטר כלי דם. בין המולקולות האלה, תחמוצת חנקן (NO), נראה כי מולקולת vasodilatory העיקרית שוחררה מן האנדותל של כלי הדם בתגובה לגירוי (למשל, אינסולין, אצטילכולין, או שינויי מאמץ גזירה) 1. בשנת האנדותל של כלי הדם, NO מיוצר על ידי האנזים אנדותל synthase NO (eNOS), והוא שוחרר לאחר מכן מתאי אנדותל 2. NO מפזר על שריר חלק בכלי הדם שם הוא גורם כלי הרפיה וגדילה בקוטר 3.
תפקוד האנדותל ניתן להעריך הלא פולשני בבני אדם באמצעות התרחבות בתיווך זרימת 4,5 טכניקה (FMD). FMD הוצע לייצג מבדק פונקציונלי האנדותל הנגזרNO הזמינות הביולוגית אצל בני אדם, נבחנת בדרך כלל על הזרוע או עורק הירך שטחית בתגובה hyperemia תגובתי הבאה איבר ~ 5 דקות חסימה 6. Hyperemia הריאקטיבי מגביר כוחות גזירה למינרית כי הם transduced אל תא האנדותל 7, מאותת על שחרורו של NO 8. אמנם בשנים האחרונות, חלקם של התרחבות ביוזמת אין לשחרר כבר התווכח 9,10, FMD מעיד על התרחבות האנדותל תלוי הוכח באופן עקבי לחזות אירועים קרדיווסקולריים 11-13.
נכון להיום, אלפי מחקרים מועסקים הטכניקה FMD למדידה לא פולשנית של תפקוד האנדותל אצל בני אדם. בהתחשב במשמרת האחרונה בפוקוס מחקר translational, הנחיות באשר לאופן מדיד לא פולשנית של FMD במכרסמים תהיינה יקרות מאוד. שמירה עם גישה translational, פרוטוקול זה הוקם למדידת FMD ב הזרוע ואת Supeעורקי ירך rficial של חולדות, כמו באתרים אלה ביותר נמדדים בדרך כלל אצל בני אדם. תוצאות פרוטוקול זה בתגובת FMD חזקה דיר בחולדות, לעומת זאת, מדידת FMD בחולדות הן תובענית מבחינה טכנית עלולה להיות קשה עבור חוקרים אחרים לשכפל בלי הפגנת וידאו. לכן, במאמר הבא ידגים שיטת למדידת לא פולשנית של FMD של הזרוע ועורקי ירך שטחית של חולדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
נהלי כל החיה תאמו את המדריך לטיפול והשימוש בחי המעבדה 14 ואושרו על ידי האוניברסיטה של יוטה בסולט לייק סיטי לענייני ותיקי מרכז רפואי בבעלי חיים לטיפול ושימוש.
1. הכנת בעלי חיים
- מניחים חיה בתא הרדמה אינדוקציה המכיל 3% isoflurane ב 100% חמצן. להשאיר את החיה בחדר האינדוקציה עד שהוא מגיב לגירויים חיצוניים.
- הסר את החיה מן חדר האינדוקציה ומניח אותו על שולחן בדיקה מחומם מצויד אלקטרודות רל (אק"ג). לשמור על הרדמה ב 3% isoflurane ב 100% חמצן. זרוע ושטחי ירך העורקת FMD לא ניתן לבצע בו זמנית. לפיכך, הוראות הכנות לכל מדידה מפורטות להלן.
2. הכנת עורק הזרוע
- מקם את פרקדן החיה ולרסן הגפה השמאלית העליונה וכל גפיים תחתונים שלimal לשולחן בדיקה בעזרת פלסטר.
- לרסן את האיבר הימני העליון של החיה, כך את החלק התחתון של הגפיים העליונים הוא מוגבה מעט (~ סנטימטר 0.2-0.5) מעל הרציף.
- החל סוכן מקריח (למשל, Nair) על הגפה העליונה הימנית של בעלי החיים כדי להסיר שיער.
- למקם השרוול חסימה (10 מ"מ לומן occluder וסקולרית תקן קוטר) על דיסטלי הגפה העליונה הזכות המרפק. אין להניח את occluder על הרציף, כמו אינפלציה / דפלציה תעביר את האיבר ומפריעה הדמית אולטרסאונד.
- להגדיר את המכשיר אולטרסאונד במצב B באמצעות המקלדת אולטרסאונד.
- למרוח כמות קטנה של ג'ל אולטרסאונד על הגפה העליונה של החיה, הפרוקסימלי שרוול החסימה.
- ידני ליישר מתמר מערך ליניארי תדר אולטרה גבוה המצורפת לבעל stereotactic עם הגפה העליונה. עורק הזרוע צריך להיות גלוי 2-3 מ"מ עמוק.
- כדי לאשר כי עורק הזרוע, לא וריד הזרוע, הוא להיותצילמו, לעבור למצב PW באמצעות המקלדת אולטרסאונד. העורק יהיה זרימת דם pulsatile בניגוד הווריד הסמוך אשר תהיה זרימת דם רציפה.
3. הכנת עורקים שטחי ירך
- מקם את פרקדן החיה ולרסן את הגפיים העליונים ואת האיבר השמאלי תחתון אל שולחן הבדיקה בעזרת פלסטר.
- לרסן את זכות גפיים תחתונים של החיה בעמדה מוגבהת (~ 0.5-1 סנטימטר) מעל הפלטפורמה באמצעות כרית (למשל, מגבות נייר מקופלות).
- החל סוכן מקריח (למשל, Nair) על גפיים תחתונים של ימין החיה להסרת שיער. לאחר הסרת שיער וריד הירך צריך להיות בבירור על הירך הפנימית העליונה.
- למקם השרוול חסימה (10 מ"מ לומן occluder וסקולרית סטנדרטי בקוטר) הפרוקסימלי הקרסול הימני. אין להניח את occluder על הרציף, כמו אינפלציה / דפלציה תעביר את הגפיים התחתונים ומפריעה הדמית אולטרסאונד.
- להגדיר את מכשיר אולטרסאונדB-mode.
- למרוח כמות קטנה של ג'ל אולטרסאונד על הגפיים התחתונים של החיה, הפרוקסימלי שרוול החסימה.
- ידני ליישר מתמר מערך ליניארי תדר אולטרה גבוה המצורפת לבעל stereotactic עם וריד הירך, שהוא נראה לעין מבעד לציפוי. עורק הירך השטחי צריך להיות גלוי <1 מ"מ עמוק.
- כדי לאשר כי עורק הירך השטחי, לא וריד הירך, מתבצע הדמיה, לעבור למצב PW. העורק יהיה זרימת דם pulsatile בניגוד הווריד הסמוך אשר תהיה זרימת דם רציפה.
4. שלב Baseline
- למטב את התמונה B-mode, בדומה לאופן בו הדבר ייעשה בבני אדם 15. ודא תמונה אופקית, אורך של הכלי עם תקשורת-אינטימה דמיינה בשני הכתלים הוא ציין. מטב את התמונה על ידי התאמת מיקום בדיקת אולטרסאונד מעט על מנת להבטיח כי כמו הרבה של העורק ככל האפשר ניתן לצפייה בחלון ללכוד.
- לחלופין, לשנות את גדרות אולטרסאונד כדי לקבל תמונה טובה יותר על ידי שינוי בהירות / ניגודיות, אזורי מוקדים, תדירות, טווח דינמי, וצפיפות קו. ישנן דרכים אחרות כדי למטב את תמונת אולטרסאונד, אך תיאור מפורט של אלה הם מעבר להיקף של פרוטוקול זה.
- אחרי אופטימיזציה של דימויים עורקים, להדליק-gating א.ק.ג. להציג תמונות בלבד שנתפסו במשך-גל R כדי להבטיח שרק מסגרת בקוטר אחד נאספת הם במהלך כל מנה הדיאסטולי של מחזור לב.
הערה: א.ק.ג.-gating נגיש מכונת אולטרסאונד להשתמש בפרוטוקול זה על ידי בחירת א.ק.ג.-gating תחת אפשרות הגדרות הפיזיולוגיות, עם זאת, ייתכן שתכונה זו לא תהיה זמינה בכל מכונות אולטרסאונד. א.ק.ג.-gating צריך להיות מופעל לאחר התמונה ממוטבת, כמו שקשה להשיג תמונת מסגרת חליפין נמוכים (כלומר, פעם אחת לכל-גל R). ללא א.ק.ג.-gating, השילוב של קצב לב גבוה אצל חולדות דרישה של מסגרת גבוההשיעור ללכוד את החלק הדיאסטולי של מחזור הלב מאפשר רק עבור ~ 10-20 קליפים שניים. גודל מסורבל כמות הנתונים בכל קליפ מגביר את העומס ניתוח משמעותי. - שיא 60 שניות על בסיס נתוני שימוש במצב B.
הערה: מכשיר אולטרסאונד תמיד מקליט, לעומת זאת, לא כל התמונות מאוחסנות על מכונת אולטרסאונד, כפי שיש מגבלה על מספר המסגרות שניתן נרשמת קליפ אולטרסאונד. אורך קליפ (כלומר, מספר המסגרות) ניתן לכוונן את ההגדרות. זה מוצע לקבוע עבור מספר מרבי של פריימים קליפ. כאשר ההקלטה תהיה בסוף קליפ (כלומר, מספר מרבי של מסגרות הגיע), ההקלטה נמשכת, אבל הקליפ גלגולים קדימה לכיד המסגרות האחרונה. במקרה זה, מוקדם יותר מסגרות כי נתפסו מחוץ לגבול מסגרת מקסימלית נמחקות לאחר מכן. בעוד המורכבויות הללו בהקלטה שונה בין מכונות, התאמת אורך הקלטה עשויה להיות נחוצה. - Swiטצ אל מצב PW. מניחים את הסמן באמצע לומן. שערים לדוגמא תוצבנה באופן אוטומטי בהתייחס הסמן, אך ניתן להתאימו עבור רוחב בעזרת מקלדת אולטרסאונד. לשמור בזווית insonation של ≤60 °.
- התאם את זווית insonation על ידי שינוי זווית קורה דופלר. לבצע התאמות בסדר לזווית באמצעות מקלדת אולטרסאונד. אם אפשרויות אלו אינן מספקות זווית מתאימה למדידה, באופן ידני להתאים הבדיקה אולטרסאונד על ידי הטיית העורק לזווית אופטימלית יותר. אם התאמה כלשהי של זווית אולטרסאונד מבוצע, לשחזר תמונות B-mode.
- שיא של 10 שניות של נתונים מהירים.
5. ספיגת שלב
- לנפח את occluder וסקולרית באמצעות מזרק אוויר מלא 10 מ"ל. כדי לשמור קבוע בלחץ האוויר occluder וסקולרית, לקפל את הצינור על עצמו ולמקם קליפ קלסר על צינור מקופל.
- Switch to-mode PW לאשר חסימת שרוול, כפי שמעידירידה גדולה מהיר דם.
- Switch to נתוני B-mode ולהקליט 60 קליפים שניים, עד 04:45 דק 'של חסימה.
- Switch to-mode PW. לשמור תיעוד של קצב הלב ואת הזמן של כל קליפ אולטרסאונד לניתוח.
6. Hyperemic שלב
- שחרר את השרוול בעת ההקלטה ב-מצב PW ידי הסרת קליפ קלסר מהצינור מקופל. שיא 5 שניות לפני ו -5 שניות לאחר שחרור השרוול.
- Switch to נתוני B-mode ולהקליט 60 קליפים שניים עד 3 דקות לאחר חסימה. לשמור תיעוד של קצב הלב ואת הזמן של כל קליפ אולטרסאונד לניתוח.
- לאחר השלמת FMD ולהסיר את החיה מהשולחן בדיקה וניטור עד שב להכרתו מספיק כדי לשמור שכיבה sternal.
ניתוח 7.
- לניתוח, אולטרסאונד יצוא כקובצי DICOM אל המחשב מחובר המצוידים בתוכנת קצה-זיהוי, המאפשר משוחדת להרתיעmination בקוטר העורק בכל מסגרת. ניתוח אפשרי על מכונת אולטרסאונד, לעומת זאת, זה לא מומלץ, כפי שהוא מאוד זמן אינטנסיבי ובכפוף ההטיה חוקרת.
- ניתוח נתונים בקוטר עורק ב -60 מקטעים שניים בשלב מחקר ולאחר חסימה, ובשנת 10 קטעים שניים בשלב hyperemic.
- ניתוח נתונים מהירים דם באמצעות יכולות ניתוח תזרים של תוכנת קצה-זיהוי האוטומטי. לקבוע מהירויות דם ממוצעות ידי מדידת 5 או יותר גל רצוף של מראה אחיד במהלך שלבי מחקר ולאחר חסימה. לקבוע מהירויות דם ממוצעות במהלך hyperemia תגובתי עבור מהירויות דם מייד לאחר שחרור שרוול. צורת הגל עם מהירויות דם גבוהות נחשבת מהיר דם שיא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תזרים בתיווך ההתרחבות בוצעה על הזרוע ועצם ירך שטחי של 8 חולדות Wistar. מיצוב של עכברוש מוצג באיור 1.
תמונות אולטרסאונד נציג של עורק הירך השטחי מוצגות באיור 2.
איור 1. עכברוש ומיצוב אולטרסאונד.
מיצוב של עכברוש למדידת הזרוע (א) ו ירך שטחית (B) עורק FMD. מיצוב של בדיקת אולטרסאונד ו שרוול חסימה למדידת הזרוע (C) ירך שטחית (D) עורק FMD. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
FO: keep-together.within-page = "1"> 
איור 2. תמונות אולטרסאונד נציג.
תמונה אולטראסאונד של עורק הירך השטחי באמצעות הדמית B-mode לקביעת הקוטר (א). מהירויות דם נקבעו באמצעות מצב PW. שמוצג באיור הם מהירות דם בתחילת המחקר (B), הפחתת מהירות דם בשלב חסימה (C), ואת העלייה המהירה מהירות דם על שחרורו השרוול בשלב hyperemic (D). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
כפי שניתן לראות בתרשים 3, יש תגובת vasodilatory דומה בין הזרוע ועורקי ירך שטחית. כאשר כאחוז של הבסיס, FMD היה דומה בין העורקים, אולם כאשר מביעיםד כשינוי מוחלט מנקודת ההתחלה, FMD היה גבוה משמעותית בעורק הזרוע (p <0.05). הבדל זה הוא ככל הנראה תוצאה של קוטר כלי גדול בעורק הזרוע מאשר עורק הירך השטחי (498 ± 28 לעומת 397 ± 11 מיקרומטר, P <0.05). בדומה למדידת FMD בבני האדם 16, מקדם intersession שונה עבור זרוע ואת FMD ירך השטחי היו 9 ± 1 ו -10 ± 4%, בהתאמה. למרות ההבדלים בגודל כלי, קיים קשר לינארי חזק בין הזרוע ו FMD עורק הירך שטחית כאשר כאחוז או שינוי מוחלט מנקודת ההתחלה.
איור 3. תזרים בתיווך התרחבות בחולדות.
Vasodilation של הזרוע ו femoralartery השטחית לאחר תקופת 5 דקות של איסכמיה האיבר הביע כאחוז (א) ו מוחלט (B) לשנות מן הבסיס. FMD היה דומה בין העורקים כאשר כאחוז של הבסיס (C). עם זאת, כאשר כפי שבאה לידי ביטוי לשינוי אבסולוטי מתחילת המחקר (D), FMD היה גבוה משמעותית בעורק הזרוע. אם כאחוז (E) או מוחלט (F) שינוי מתחילת המחקר, קיים קשר חזק בין FMD זרוע ועורקי ירך שטחיים. * P <0.05 לעומת עורק הזרוע. ערכים הם ממוצע ± SEM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
כפי שניתן לראות בטבלה 1, משתנים לב וכלי דם נמדדו במהלך המחקר, חסימה, ושלבי hyperemic. קוטר עורק נקבע באמצעות אינטימה-אל-אינטימה או מדיה-to-מדיה מרחקת במהלך החלק הדיאסטולי של מחזור הלב. קוטר עורק נמדד במשך 60 שניות בתחילת מחקר ומתמשך in ~ 60 מרווחים שניים דרך החסימה ושלבי hyperemic. מהירויות דם נקבעו באמצעות מהירויות דם הממוצעות של דם לומן במהלך מחזור לב אחד. זרימת הדם חושבה לפי המשוואה: זרימת הדם (μl / min) = (מהירות דם (מיקרומטר / sec) · π · [קוטר כלי (מיקרומטר) / 2] 2 · 60). שיעור גזירה חושב על פי המשוואה: גזירת שיעור (s -1) = מהירות דם · בקוטר 8 / כלי. FMD חושב על פי המשוואה: FMD = (קוטר כלי שיא - קוטר כלי מחקר) / קוטר כלי מחקר.
| עורק הזרוע | עורק ירך שטחי | |
| Baseline שלב | ||
| קצב לב, BPM | 367 ± 12 | 368 ± 16 |
| קוטר, מיקרומטר | 498 ± 28 | 397 ± 11 * |
| דם מהירות, מיקרומטר / sec | 85 ± 8 | 76 ± 11 |
| זרימת הדם, μl / min | 1,027 ± 147 | 568 ± 90 * |
| שיעור גזירה, s -1 | 1.4 ± 0.1 | 1.5 ± 0.2 |
| ספיגת שלב | ||
| קצב לב, BPM | 362 ± 12 | 359 ± 14 |
| קוטר, מיקרומטר | 499 ± 32 | 390 ± 11 * † |
| דם מהירות, מיקרומטר / sec | 63 ± 9 † | 38 ± 8 † |
| זרימת הדם, μl / min | 722 ± 122 † | 272 ± 62 * † |
| שיעור גזירה, s -1 | 1.0 ± 0.2 † | 0.8 ± 0.2 † |
| Hyperemic שלב | ||
| קצב לב, BPM | 363 ± 12 | 357 ± 12 |
| קוטר Peak, מיקרומטר | 586 ± 22 † ‡ | 457 ± 15 * † ‡ |
| מהירות דם Peak, מיקרומטר / sec | 149 ± 11 † ‡ | 205 ± 12 * † ‡ |
| שיא זרימת הדם, μl / min | 1,778 ± 229 † ‡ | 1,495 ± 127 † ‡ |
| שיא שאר דרג, s -1 | 2.5 ± 0.3 † ‡ | 3.7 ± 0.2 * † ‡ |
| * P <0.05 לעומת עורק הזרוע. </ Td> | ||
| † P <0.05 לעומת Baseline שלב. | ||
| ‡ P <0.05 לעומת ספיגת שלב. | ||
| ערכים הם ממוצעים ± SEM. |
טבלה 1. משתנים לב וכלי דם דרך כל שלב של הפרוטוקול.
לא חלו שינויים בקצב לב לאורך או פרוטוקול, וכן בין מדידות העורקות (P> 0.05). הקוטר של עורק הזרוע היה גדול יותר באופן משמעותי מאשר עורק הירך השטחי (P <0.05). בשלב החסימה, חל קיטון משמעותי מהירות דם, זרימת דם, וקצב גזירה לעומת הבסיס בשני העורקים (P <0.05). לאחר שחרורו שרוול, מהירויות דם שיא, זרימת דם, וקצב גזירה גבוה כל היו באופן משמעותי מאשר שלבי מחקר או חסימה בשני העורקים (P <0.05). בדומה למדידת hyperemia תגובתי בבני האדם 16, מקדם intersession שונה עבור זרוע ואת hyperemia תגובתי ירך השטחי היו 24 ± 9 ו -19 ± 5%, בהתאמה. היו הבדלים מהירים דם, זרימת דם, וקצב גזירה בין עורקים, בשל במידה רבה את ההבדל בקוטר עורק.
לאחר הנרמול לשיא שיעור גזירה, ההתרחבות הייתה גבוהה בעורק הזרוע (איור 4). זה היה נכון גם עבור FMD מבוטא שינוי מוחלט מנקודת ההתחלה. עם זאת, למרות הבדלים מבחינת היקפו, קיים קשר לינארי חזק באחוזים והמוחלט FMD מנורמל לשיא שיעור גזירה בין הזרוע ועצם ירך שטחית.
/54762fig4.jpg "/>
איור 4. תזרים בתיווך ההתרחבות מנורמלת לשיא שיעור גזירה בחולדות.
לאחר הנרמול לשיא שיעור גזירה, FMD expressedas אחוז (א) או שינוי מוחלט (B) מתחילת המחקר היה גבוה בעורק הזרוע לעומת עורק הירך השטחי.
למרות ההבדלים בין העורקים FMD מנורמל לשיא שיעור גזירה, קיים קשר חזק בין הזרוע ועורקים הירך שטחית כאשר FMD התבטאה כאחוז (C) או שינוי מוחלט (D) מתחילת המחקר. * P <0.05 לעומת עורק הזרוע. ערכים הם ממוצע ± SEM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר הנוכחי, מדידה לא פולשנית של FMD הייתה הפגינו הזרוע ועורקי ירך שטחיים של חולדות. בדומה לבני אדם 6, לאחר תקופת חסימה 5 דקות, חלה עלייה מהירה מהיר דם (כלומר, hyperemia תגובתי) ובכך להגדיל שיעור גזירה על דפנות העורקים אשר הביאו ההתרחבות הבאה של העורק. FMD נצפתה הוא הזרוע ועורקי ירך שטחית. בנוסף, קיים קשר חזק בין FMD העורק. למרות שיעור גזירת שיא היה גבוה בעורק הירך השטחי, FMD מנורמל לשיא שיעור גזירה שומר על קשר חזק בין עורקים. יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך המדידה הבלתי פולשני של FMD יכול להתבצע בהצלחה בחולדות.
למרות מדידת FMD בוצעה על שני עורקים שונים, סדר הגודל של FMD היה דומה כאשר מבוטא אחוז שינוי מנקודת ההתחלה. However, כאשר כפי שבא לידי ביטוי לשינוי אבסולוטי מתחילת המחקר, FMD התחזק בעורק הזרוע, כמו עורק כי היה ~ 25% יותר בקוטר מנוחה מ עורק הירך השטחי. תוצאות אלו דומות לאלו של מחקרים בבני אדם בהם FMD נמדדה הזרוע ועורקים הירך שטחית באותם נושאים 17,18. למרות ההבדלים בקוטר עורק, מערכת היחסים של FMD, כאחוז או שינוי מוחלט מנקודת ההתחלה, היה חזק מאוד בין עורקים.
תזרים בתיווך התרחבות הוצעה לייצג מבדק פונקציונלי נגזרות האנדותל זמין ביולוגי NO בבני אדם 6, כמו התרחבות מתרחשת דרך כל הקלה מפני האנדותל בתגובת שיעור גזירה מוגבר 1,3. לפיכך, FMD גבוה מנורמל לשיא שיעור גזירה מייצג האנדותל כי גדל רגישות גידול נתון שיעור גזירה. לאחר נרמול FMD לשיא שיעור גזירה, FMD היה גבוה יותר בראךעורק ial, בין אם היא באה לידי ביטוי כאחוז או שינוי מוחלט מנקודת ההתחלה. למרות הבדלי גודל של FMD מנורמלים לשיא שיעור גזירה בין זרוע ועורקי ירך שטחיים, קיים קשר לינארי חזק באחוזים והמוחלט FMD מנורמל לשיא שיעור גזירה בין עורקים.
במחקר הנוכחי, המדידה לא פולשנית של FMD מתואר הזרוע ועורקי ירך שטחי עם דיסטלי חסימת שרוול כדי בדיקת אולטרסאונד. מיקום שרוול זו נבחר מכמה סיבות, 1.) בבני האדם, זה נפוץ ביותר שיטה למדידת FMD, 2.) את התרומה של NO אל FMD הוכחה להיות גדול ככל שמדידה בקוטר העורק היא הפרוקסימלי לאתר חסימה 9 הקושי, ו -3) לא היה בשמירה באולטראסאונד לאחר אינפלצית שרוול כאשר האתר המדיד היה דיסטלי החסימה. למרות הליך זה מייצג מדידה לא פולשנית של FMD,אחרים ביצעו FMD לחיות החולדות באמצעות חסימה כירורגית של עורק הכסל המשותף עם דיסטלי המדידה אולטרסאונד כדי חסימה בעורק הירך 19. FMD התגובה באמצעות פרוטוקול תוארה לראשונה על ידי Heiss et al. היה עצור על ידי עירוי של מעכבי אינס. אכן, הליך זה נעשה שימוש על מנת להוכיח כי עליות תרופתיות בשום תאיים משפרות FMD בשני דגמי חולדה של בתפקוד האנדותל ויתר לחץ דם 20, וחשיפת תוצאות לעישון פסיביות ירידת ערך של FMD בחולדות 21,22. מחקרים אלה הראו את התרומה של NO אל FMD בחולדות ולהקים את היחס של FMD לבריאות הלב וכלי הדם. עם זאת, כמו טכניקה זו היא פולשנית, עלול להגביל את היכולת למדוד FMD longitudinally באותה חולדות על פני תקופה של שבועות עד שנים. שימוש בשיטה דומה במחקר הנוכחי, בשני מחקרים שנעשו לאחרונה ביצעו מדידה לא פולשנית של FMD של הגפיים האחוריות של עכברים 23,24,אבל היו כמה וריאציות טכניות בין מחקרים (כלומר, כמובן זמן מדידה ומיקום של בדיקת אולטרסאונד ו שרוול חסימה). בשל הפערים בין המחקרים הללו וקושי בשכפול התוצאות הללו, מדידה לא פולשנית של FMD בחולדות היה ניסיון במקום, כמו חולדות משמשות במחקר translational, אבל יש גודל כלי הדם והגוף גדול מאשר עכברים. בעוד מדידת FMD בעורק של מכרסמים הירך אינו רומן בדרך כלל, אבל שום מחקר לא ביצע מדידה של FMD בעורק הזרוע מכל מכרסמים החיים. הקשר חזק של FMD בין הגפיים במחקר הנוכחי עשוי להמחיש את האופי המערכתי של תפקוד האנדותל, אלא גם מספק שיטה הלא פולשני למדידת FMD בבעלי חיים אשר שיבשו את זרימת הדם בגפיים האחוריות (למשל, פיסטולה arteriovenous הירך).
אופטימיזציה ותחזוקה של תמונות אולטרסאונד באיכות גבוהה הן מיומנויות חיוניות הנדרשות procedu זהמחדש ודורש תרגול נרחב. לדוגמה, למדידת FMD בבני אדם, הוא הציע כי לפחות 100 סריקות בפיקוח מבוצעות לפני סריקת 5 עצמאי. לפעמים, התמונה עשויה להשתנות במהלך חסימת שרוול ודורשת שינויים קלים של בדיקת אולטרסאונד. שלב קריטי פרוטוקול זה הוא מעבר בין B-mode ו- PW-mode בנקודות זמן ספציפיות. B-mode סימולטני והדמיה PW-mode אינם אפשריים על מכונת אולטרסאונד בשימוש בפרוטוקול זה. לכן, הוא נדרש לעבור במהירות בין מצבי אולטרסאונד כדי ללכוד מדידות מהירות בקוטר במהלך פלחי זמן מסוימים. לאחר פרוטוקול נכתב מתוך ולתרגל ביצוע הפרוטוקול ישפר את היעילות של מיתוג מאוד בין מצבי אולטרסאונד. בהתחשב באופי הזמן רגיש של קלטות אולטרסאונד במהלך בפרוטוקול זה, שגיאות תתרחשנה, אז תהיה מוכן לרשום בתופעות חריגות פרוטוקול, כגון שוכח לתפוס קליפ אולטרסאונד.חסר קליפ אולטרסאונד במהלך שלב החסימה אינו קריטי, לעומת זאת, אם הקלטה אבדה במהלך שלב hyperemia תגובתי הוא הציע לבצע את ההליך שוב לאחר 30 דקות לפחות חלפו 25.
כמו בכל מחקר יש מגבלות על פרוטוקול הניסוי. במחקר זה, הרדמה הייתה מנוהלת על חולדות תחת 100% חמצן, ובכך, מדידות של FMD עשויות לשקף vasoreactivity כדי hyperoxia. צורות אחרות של הרדמה, כגון נתרן pentobarbital יכולות לשמש כדי ליצור פרופיל גז דם מייצג בצורה טובה יותר לבני אדם ולחסל את הדאגה הזו. לחץ דם לא היה פיקוח בכל שלב של פרוטוקול זה. למרות לחץ דם אינו משנה בתגובה לחסימת שרוול חריפה אצל בני אדם, זה לא ידוע אם כל שינוי חולף בלחץ דם היה להתרחש אצל חולדות. בנוסף, אוויר דחוס שמש כדי למלא את occluder וסקולרית, לעומת זאת, ממלא במים עלול להסתיים חסימה תקיפהשל זרימת דם כמים זה לא דחיס כמו אוויר. לבסוף, מדידה לא פולשנית של FMD בתנאים שבהם eNOS מעוכבת (כלומר, L-NMMA אינפוזיה) לא בוצעו. לפיכך, התרומה של NO אל FMD, כפי שהיא מבוצעת בפרוטוקול זה, טרם נקבע.
לסיכום, מאמר זה הוכיח פרוטוקול למדידת לא פולשנית של FMD של הזרוע ועורקי ירך שטחית של חולדות. בד בבד עם השינוי האחרון בפוקוס מחקר translational, ההערכה של FMD בחולדות עשויה לספק כלי רב ערך עבור תרגום תוצאות בבני אדם לחולדות, כמו גם לספק את היכולת להעריך את תפקוד האנדותל במספר נקודות זמן במחקרי אורך של חולדות קבלת טיפולים שונים. אכן, הנחה FMD מלוות התקשות העורקים אבי העורקים נצפו הבאים נזק לכליות במודל חולדה של אי ספיקת כליות כרונית (ממצאים לא פורסם), אשר מביא לידי ביטוי את האפליקציהlication של פולשני FMD כסמן של תפקוד כלי דם במחקרים בבעלי חיים אורכים. מחקרים עתידיים לחקור מנגנונים של FMD בחולדות הם ערובה יספקו תובנה נוספת לתוך מדידת FMD פולשני בבני אדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo 2100 High Resolution Micro-Ultrasound Imaging System | VisualSonics, Toronto, ON, CAN | ||
| MicroScan Ultra-High Frequency Linear Array Transducer - MS-700 30-70 MHz | VisualSonics, Toronto, ON, CAN | ||
| Vevo Imaging Station | VisualSonics, Toronto, ON, CAN | ||
| Thermasonic gel warmer | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | 82-03 | Optional |
| Signacreme electrode cream | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | 17-05 | |
| Transpore surgical tape | 3M, Maplewood, MN, USA | 1527-1 | |
| Depilatory cream (e.g., Nair) | General supply | ||
| Cotton swabs | General supply | ||
| Ultrasound gel | General supply | ||
| Standard vascular occluder, 10 mm lumen diameter | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | 62-0115 | |
| 10 ml syringe with Luer-Lok tip | General Supply | Used for occlusion cuff apparatus | |
| Paperclip | General Supply | Used for occlusion cuff apparatus | |
| Hypodermic needle – 18 gauge | General Supply | Used for occlusion cuff apparatus | |
| Medium binder clip | General Supply | Used for occlusion cuff apparatus |
References
- Smits, P., et al. Endothelial release of nitric oxide contributes to the vasodilator effect of adenosine in humans. Circulation. 92, 2135-2141 (1995).
- Forstermann, U., et al. Nitric oxide synthase isozymes. Characterization, purification, molecular cloning, and functions. Hypertension. 23, 1121-1131 (1994).
- Gardiner, S. M., Compton, A. M., Bennett, T., Palmer, R. M., Moncada, S. Control of regional blood flow by endothelium-derived nitric oxide. Hypertension. 15, 486-492 (1990).
- Harris, R. A., Nishiyama, S. K., Wray, D. W., Richardson, R. S.
- Corretti, M. C., et al. Guidelines for the ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery: a report of the International Brachial Artery Reactivity Task Force. J Am Coll Cardiol. 39, 257-265 (2002).
- Celermajer, D. S., et al. Non-invasive detection of endothelial dysfunction in children and adults at risk of atherosclerosis. Lancet. 340, 1111-1115 (1992).
- Niebauer, J., Cooke, J. P. Cardiovascular effects of exercise: role of endothelial shear stress. J Am Coll Cardiol. 28, 1652-1660 (1996).
- Sessa, W. C.
- Wray, D. W., et al. Does brachial artery flow-mediated vasodilation provide a bioassay for NO? Hypertension. 62, 345-351 (2013).
- Green, D. J., Dawson, E. A., Groenewoud, H. M., Jones, H., Thijssen, D. H. Is flow-mediated dilation nitric oxide mediated? A meta-analysis. Hypertension. 63, 376-382 (2014).
- Green, D. J., Jones, H., Thijssen, D., Cable, N. T., Atkinson, G. Flow-mediated dilation and cardiovascular event prediction: does nitric oxide matter? Hypertension. 57, 363-369 (2011).
- Brevetti, G., Silvestro, A., Schiano, V., Chiariello, M. Endothelial dysfunction and cardiovascular risk prediction in peripheral arterial disease: additive value of flow-mediated dilation to ankle-brachial pressure index. Circulation. , 2093-2098 (2003).
- Gokce, N., et al. Predictive value of noninvasively determined endothelial dysfunction for long-term cardiovascular events in patients with peripheral vascular disease. J Am Coll Cardiol. 41, 1769-1775 (2003).
- National Research Council (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th, National Academies Press. (2011).
- Alley, H., Owens, C. D., Gasper, W. J., Grenon, S. M. Ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery in clinical research. J Vis Exp. , e52070 (2014).
- Ghiadoni, L., et al. Assessment of flow-mediated dilation reproducibility: a nationwide multicenter study. J Hypertension. 30, 1399-1405 (2012).
- Thijssen, D. H., et al. Heterogeneity in conduit artery function in humans: impact of arterial size. Am J Physiol Heart Circ. 295, H1927-H1934 (2008).
- Green, D. J., et al. Why isn't flow-mediated dilation enhanced in athletes? Med Sci Sports. 45, 75-82 (2013).
- Heiss, C., et al. In vivo measurement of flow-mediated vasodilation in living rats using high-resolution ultrasound. Am J Physiol Heart Circ. 294, H1086-H1093 (2008).
- Chen, Q., et al. Pharmacological inhibition of S-nitrosoglutathione reductase improves endothelial vasodilatory function in rats in vivo. J Appl Physiol. 114, 752-760 (2013).
- Pinnamaneni, K., et al. Brief exposure to secondhand smoke reversibly impairs endothelial vasodilatory function. Nicotine Tob Res. 16, 584-590 (2014).
- Liu, J., et al. Impairment of Endothelial Function by Little Cigar Secondhand Smoke. Tob Regul Sci. 2, 56-63 (2016).
- Schuler, D., et al. Measurement of endothelium-dependent vasodilation in mice--brief report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 2651-2657 (2014).
- Erkens, R., et al. Left ventricular diastolic dysfunction in Nrf2 knock out mice is associated with cardiac hypertrophy, decreased expression of SERCA2a, and preserved endothelial function. Free Radic Biol Med. 89, 906-917 (2015).
- Harris, S. A., Billmeyer, E. R., Robinson, M. A. Evaluation of repeated measurements of radon-222 concentrations in well water sampled from bedrock aquifers of the Piedmont near Richmond, Virginia, USA: : effects of lithology and well characteristics. Environmental research. 101, 323-333 (2006).
