颈动脉肿瘤细胞注射，产生脑转移瘤小鼠模型

癌症中枢神经系统（CNS）的转移是一种破坏性的疾病，并且可涉及任何脑实质或（"脑转移"指的是既在本文中）的软脑膜。它是主要的颅内恶性肿瘤，由> 10数量上超过初级胶质瘤:1 ^1，2。肺癌，乳腺癌和黑色素瘤是产生脑转移^3,4的高发生率前三位主要肿瘤疾病。近年来，以新颖的癌症疗法跨出去已大幅延长生存期，改善生活质量为众多癌症患者。然而，在复发，脑转移瘤的发病率迅速上升。例如，所述抗HER2抗体曲妥单抗（赫赛汀）展示了在患者的HER2 +乳腺癌显著临床疗效;但令人不安的趋势已经出现在这些患者中:最多那些颅外全身性疾病最初从赫赛汀治疗获益以后开发的脑转移^5，6，7的1/3。不幸的是，患者的脑转移是难治几乎所有目前的治疗，通常遇到的生活质量的创伤恶化，以及他们的一年存活率诊断后仅为^〜20％8。对于脑转移瘤目前的疗法（包括类固醇，颅放疗，手术切除的患者选择）仅仅是治标不治本，不能治愈^9。因此，脑转移正在成为这个时代新的癌症治疗方法的下一个宏伟的挑战。为了解决患者每天面对的诊所未得到满足的挑战，我们迫切需要更好地了解脑转移的基本机制，并利用这些知识来开发新疗法。

伦理学声明:所有的动物研究由得克萨斯大学MD安德森癌症中心的大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1.准备注射癌细胞

1. 注射前种子癌细胞一天或两天。使用补充有10％FBS，除非特殊介质在文献表明对于特定的细胞系的DMEM / F12培养基。
2. 外科手术当天，收获细胞，当他们到达70 - 通过用无血清培养基一旦第一洗涤80％汇合胰蛋白酶（0.25％）1前 - 2分钟，在37℃。添加到细胞中的含FBS的DMEM / F12培养基的10％以淬灭0.25％胰蛋白酶。
3. 离心在80×g下将细胞3分钟。洗在无血清培养基中的细胞两次以除去残留的血清，用血球计数细胞并在Hank氏平衡盐溶液（HBSS）在1重新悬浮- 5×10 ^6个细胞/ ml，取决于细胞系。保持冰直到注射时间。
   注:MDA-MB-231乳腺癌细胞和K1735黑素瘤细胞在该研究中使用，并在2×10 ^6个细胞/ ml的浓度被用于这两种细胞系。保持胰蛋白酶消化持续时间尽可能地短的过度治疗可能影响转移测定法的结果。

2.准备小鼠肿瘤细胞注射

1. 麻醉通过腹膜内（IP）小鼠氯胺酮注射/甲苯噻嗪混合物（氯胺酮100毫克/千克，甲苯噻嗪10mg / kg的）。
2. 按捏脚动物的确认完全麻醉，观察毫无反应。
3. 放置在玻璃板上的鼠标（用于铸造蛋白凝胶），并用橡皮筋固定。
4. 如果需要的话，通过刮或施加脱毛产品少量并用纸巾擦拭头发断除去颈部的头发。注意:如果使用裸鼠，跳过这一步，因为他们没有体毛。
5. 通过应用清洁颈部皮肤聚维酮碘和70％乙醇。
6. 将鼠标放在解剖显微镜的阶段
7. 使在皮肤约1cm的切口长用外科手术刀。
8. 说白了解剖用有齿镊肌肉底下露出颈动脉。
9. 分开用外科钳子相邻的迷走神经的颈动脉。
10. 采用手术镊子，从棉花球分离一些棉花，滋润，并塑造成一个较小的棉花球。把这个缓冲区滋润棉球注射期望的站点的颈动脉下方。
11. 放置缝合线远端和近端的棉球，使松节。收紧近端结阻断血液流进注射部位。
12. 继续癌细胞注入如果在棉花球颈动脉出现新鲜的红血全压。

3.肿瘤细胞注射到颈动脉

1. 涡和借鉴100微升Ø˚F癌细胞进入注射器。
2. 下的解剖显微镜，慢慢插入31克针（带斜面向上）插入颈动脉坐在棉球的顶端的内腔中。
3. 缓缓注入从注射器到颈动脉中的细胞。成功注射可以在显微镜下通过附近的血管和肌肉的变色的观察时缓冲癌细胞推入循环。
4. 当整个体积的注射完成后，轻轻提起远端颈内动脉，以防止反流。
5. 很快收紧远端结完成注射过程。
6. 在完成注入后，拧紧连字和解剖显微镜下把过多的丝线用微型剪刀。移回分离的肌肉覆盖伤口部位。与两主食合皮肤。

4.手术恢复

1. 移动运营动物到一个加热垫进行恢复。这可能需要30 - 60分钟为动物恢复知觉。在此期间， 通过皮下注射作为手术后的镇痛施用丁丙诺啡（0.05毫克/千克）。注:镇痛应根据当地IACUC批准的协议来提供。
2. 一旦动物唤醒，恢复正常的行为，返回老鼠他们的住房位置。数天手术后提供凝胶食品的小鼠。保持手术记录，并保持它在房间里。

5.非侵入性的体内成像

1. 为标记有荧光素酶报道构建体的细胞， 使用体内成像系统¹⁴测量癌细胞注入效率。
   未在注射当天进行成像，以避免过大的应力，以研究动物:注。

有在该注射液的质量进行评估的两点。第一次机会是通过注射期间改变血管的颜色操作者的观察。来自贫穷注射泄漏解剖显微镜下很容易观察到。鼠标主体的稳定和安全的放置（ 图1A）和在支撑棉球其颈动脉（ 图1B）是用于顺利成功注射到颈动脉的关键因素。第二点来评价喷射质量是手术后的非侵入性成像。为了这个目的，癌细胞通常标记有荧光素酶报道体外注射前。为了尽量减少对动物应力， 体内成像，通常进行后24小时注射。一个成功的注射导致颅内强肿瘤细胞负荷，鼠标头部阳性是唯一区域ignals（ 图2A）。

活体成像系统中使用跟踪荧光素标记的肿瘤细胞，我们观察到天注射后内信号强度的初始下降;然而，能够在CNS生长的癌细胞最终管理分裂生成的体内成像系统的信号增加为脑转移发展（ 图2B）。动脉注射通常会产生具有相对低的变异，这是使用这种方法，以产生实验脑转移的一大优势在体内成像系统的信号相一致。作为生长的肿瘤病灶置换脑组织，健康的动物的质量具有快速进展脑转移可以迅速恶化，镜像人脑转移的患者的临床表现。表明脑转移的显著存在的典型症状的行为包括损失重量，弯腰驼背的姿势，并不断盘旋。在实验结束点，动物的大脑可以提取用于生化指标的检查或组织学检查。除了黑色素转移灶（ 图3A），它通常是难以从周围之前组织学评价（ 图3B）的脑组织区分肿瘤病灶。在这样的情况下，建议以标记肿瘤细胞与荧光报告（ 如 GFP）的分离转移性细胞（ 图3C）的便利性。或者，整个大脑可以解离成单细胞和肿瘤细胞通过磁珠标记的抗体分离。

图1:用于颈动脉注射制备。一）麻醉小鼠被放置在玻璃板上，并与る固定BBER带。站点和切口的长度标有在颈部有一条黑线。 B）毕竟准备手术步骤完成后，露出颈动脉被放置在支持一个企业棉球，准备对癌症细胞注射。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2:脑转移瘤生长无创监测。 A）的改性的MDA-MB-231乳腺癌细胞用萤光素酶报道基因体外 。从后24小时颈动脉注射开始，脑转移发展中监测非侵入通过体内成像系统成像（比例尺= 50毫米）重复。 B）的 体内成像系统伊马量化晋数据表明肿瘤负荷，颈动脉后注入的初始下降，其次是脑转移瘤的生长指数直到动物濒死。误差棒反映总发光信号的平均（SEM）的标准误差。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3:收获脑转移病灶。 A）K1735黑色素细胞产生的同基因C3H小鼠大脑，极大地方便了从周围间质脑转移灶的分离，但仅限于某些机型黑色素黑色素脑转移病灶。 B）游离的乳腺肿瘤细胞转基因MMTV-NEU / PTEN的 -null小鼠产生明显的脑转移AF经颈动脉注射植入之三。肿瘤/间质利润率很难尽管血管转移灶的存在明显区别。 C）的 MDA-MB-231乳腺癌细胞进行预标记有绿色荧光蛋白（GFP）记者体外 ，以促进通过手术切除或细胞分选脑转移病灶提取。注意，大多数转移性病灶都集中在何处颈动脉注入发生在脑的相同侧。 请点击此处查看该图的放大版本。

作者没有什么可透露的。