Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Yatay Gen Transferi Çalışmasında Metodolojisi Published: March 10, 2017 doi: 10.3791/55087
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 5, 6,7, 6,7, 1
1Division of Biomedical Science, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, 2Department of Basic Biomedical Science, Universidad Europea de Madrid, 3Human Biology Program, School of Integrative and Global Majors, University of Tsukuba, 4Laboratory of Nosocomial Infections, Department of Bacteriology, Centro Nacional de MicrobiologÍa, Instituto de Salud Carlos III, 5Division of Microbiology, Department of Medicine, School of Medicine, Universidad Complutense, 6Biology of Gram-Positive Pathogens, Department of Microbiology, Institut Pasteur, Paris, France, 7ERL3526, CNRS, Paris, France
* These authors contributed equally

Summary

Burada Staphylococcus aureus konjugasyon, transdüksiyon ve doğal dönüşümün, in vitro incelenmesi için, üç farklı protokoller açıklanmaktadır.

Abstract

Ana fırsatçı insan patojeni Staphylococcus aureus önemli bir özelliği, hızlı bir şekilde antibiyotiklere direnç elde etmek için olağanüstü yeteneğidir. Genomik çalışmalar S. aureus yatay gen transferi (HGT) S. aureus evriminde önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir mobil genetik elementlerin bulunan birçok virülans ve direnç genleri taşıdığını ortaya koymaktadır. Ancak, yine de, eksik özellikle son zamanlarda bu bakterinin rapor edilmiştir doğal dönüşümü ile ilgili olan S. aureus HGT incelemek için kullanılan metodolojinin tam ve ayrıntılı bir açıklama. Konjugasyon faj iletimi ve doğal dönüşümün Bu çalışma, in vitro, S. aureus HGT incelemek için yararlı olan, üç protokollerini tasvir eder. Phenicols veren bu amaçla, cfr gen (kloramfenikol / florfenikol direnci), linkozamitler, Oksazolidinonlar, Pleuromutilins ve streptogramin A (PhLOPS içinA) fenotipi -karşı kullanılmıştır. S. aureus, diğer suşlar genetik materyaller aktaran geçtiği mekanizmaları anlamak direncin hızlı satın kavrama esastır ve yaygınlaştırma modları gözetim programlarında bildirilen veya gelecekte daha da yayılmasını moduna tahmin etmek netleştirmek için yardımcı olur.

Introduction

Staphylococcus aureus, doğal insan ve hayvanların deri ve burun boşluğu yaşar bir ortakçı Gram pozitif bir bakteridir. Bu bakteri türleri hastane ve sağlık ortamlarında hastane enfeksiyonlarının önde gelen nedenidir. Ayrıca, farklı antimikrobiyal bileşiklere direnç geliştirme kabiliyeti küresel bir endişe içine bu bakterinin neden olduğu enfeksiyonların yönetimini yapmıştır.

direnç fenotipleri yayılmasında karışan iki ana yollar bilinmektedir: dayanıklı genotiplerin klonal yayılmasını ve bakteriyel havuz arasındaki genetik belirleyicileri yayılmasını. S. aureus, farklı antibiyotik direnç genleri (ve hastalık oluşumunu belirleyen etkenin) durumunda, hareketli genetik elemanlara (MGES) ile ilişkili bulunmuştur 1. S. aureus genomunda bu unsurların varlığı gen kazanılması ve transfer olduğunu gösterirBakteriyel nüfus içinde etik malzeme S. aureus adaptasyonu ve evrim için önemli bir rol oynayabilir.

dönüşüm, konjugasyon ve faj iletimi: Genetik materyal, Gram-pozitif bakterilerde HGT üç iyi bilinen mekanizmalarla değiştirilebilir. Dönüşüm serbest DNA alımını kapsar. yetkinlik sahne: yabancı DNA elde etmek için, bakteri hücrelerinin özel bir fizyolojik faz geliştirmek gerekir. Bu aşamada ulaşıldığında, kompetan hücreler, sitoplazmaya DNA taşıyan yeni genetik determinantlar elde edebilmektedir. S. aureus durumunda, doğal transformasyon varlığı en son 2 gösterilmiştir. Buna paralel olarak, bizim grubun kurucu ifade reachin yeteneğine sahip S. aureus işler nasıl gelişme yeterlilik aşamasında ve üzerinde iç çekişi faktörünün ifade alaka (şifreli ikincil transkripsiyon sigma faktörü) ışık tutmuşturDoğal dönüşümü 2 ile dayanıklı fenotipleri edinimi için izin verir g yetkinlik sahne.

Konjugasyon başka bir (alıcı), bir canlı hücrenin (donör) DNA iletimi ile ilgili bir süreçtir. Her iki hücreleri, tüpler ya da gözenek gibi özel yapılar tarafından korunması suretiyle, DNA değiştirilmesine olanak verir, doğrudan temas içinde olması gerekmektedir. Bu yöntemle DNA transferi konjugatif makine gerektirir. S. aureus, prototip konjugatif plazmid konjugatif operon traa 3 barındıran PGO1 vardır.

Faj transdüksiyon bakteriyofaj enfeksiyonu yoluyla hücreden hücreye DNA transferini içermektedir ve faj kapsid içine yerine viral DNA'nın bakteriyel DNA ambalaj ifade eder. S. aureus izolatlarının çoğu bakteriyofajlar 1 ile lysogenized edilir. stres koşullarında üzerine prophages bakteriyel genom eksize edilebilirE ve litik döngüsü vardiya.

Bunlar S. aureus DNA aktarımı için üç iyi bilinen mekanizmalardır. Bu tür "sözde dönüşüm" 2 ve patojenite adaları 4 transferinde faj benzeri sistemler gibi bazı ek aktarım mekanizmaları vardır. Son zamanlarda, bir grup "nanotüpler" komşu hücreler 5, 6 arası (plazmid DNA dahil), hücresel materyallerin transferi dahil, ancak bir izlem çalışması şimdiye kadar diğer gruplardan ortaya olmadığını bildirdi.

Konjugasyon, transdüksiyon ve doğal dönüşümü: Bu çalışma üç ana aktarma yollarının ele alarak S. aureus HGT incelemek için gerekli bir metodoloji sağlar. Bu yöntemler ile elde edilen sonuçlar arasındaki CFR gen iletimini (kloramfenikol / florfenikol direnci) yapısını incelemek için kullanılmıştırS. aureus 7 suşları. Bu üç teknik S. aureus MGE iletim soruşturma çok yönlü araçlardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Bu çalışmada kullanılan suşlar ve malzemeler sırasıyla Tablo 1'de belirtilen ve Malzeme Tablosu vardır. Iletim deneylerinde, N315 ve pozitif türevleri cfr COL CFR geninin donör (N315-45 ve Col-45) olarak kullanılmıştır. Bu suşlar, daha önceden standart konjügasyon protokolü (aşağıya bakınız), aşağıdaki, verici klinik CFR pozitif Staphylococcus epidermidis soyu (ST2) halinde kullanılarak konjugasyon ile elde edilmiştir. Bu suş pSCFS7 benzeri plazmid 7 cfr genini barındırmıştır.

1. Konjugasyon Filtre çiftleşme Yöntemiyle

Not: CFR gen (N315-45) 7 (Cm R) taşıyan bir S. aureus N315 suşu verici olarak kullanılmıştır. COL 8 veya Mu50 9 suş (Tet R Cm S) alıcı olarak kullanılmıştır. Çift-dirençli koloniler 32 mg / kloramfenikol ve 8 mg L mevcudiyetinde büyüyebilen (Tet R Cm R) / tetrasiklin L, farazi Transkonjuganlardaki olarak kabul edildi ve koloni PCR ile CFR varlığını tespit etmek ve belirlemek için analiz edilmiştir alıcı duyarlılık profili.

  1. Bir kaç değişiklik ile önceden tanımlanmış bir protokole 10 aşağıdaki çekimleri gerçekleştirin:
    1. 37 ° C'de çalkalanarak (ve sırasıyla, 32 mg / L kloramfenikol olmadan) triptik soya suyu (TSB) ortam içinde alıcı ve verici arasındaki bir gece boyunca kültür 5 mL hazırlayın.
    2. Taze TSB ortamı kullanılarak 1 (OD = 1.0 600) gecede kültürlerin optik yoğunluk (OD 600) ayarlayın. Alıcı kültürü 0.5 mL (COL ya Mu50) donör kültürü (N315-45) 0.5 mL karıştırın. karışıma PBS 1 ml ilave edilir.
    3. 0.45 um'lik bir membran filtre USI üzerine bakteri karışımı aktarınBir vakum pompası sistemi ng.
    4. Bir koyun kanlı agar plaka üzerinde filtre membranlar koyun. 1 gün süreyle 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Bu adımda, zenginleştirilmiş orta çift dirençli hücrelerin büyümesine izin vermek için gereklidir.
    5. plaka filtre membran dışarı atın ve fosfat tamponlu salin (PBS) 10 ml askıya. Vortex iyi membran üzerine bağlı tüm bakterileri toplamak için.
    6. Taze TSB kullanılarak bir bakteri süspansiyonu içerisinde seri 10-misli seyreltme sağlayın. TSB agar üzerinde 0-10 -4 seyreltilmiş numune levhalar 100 ul (TSA) levhalarında 32 mg / ml Kloramfenikol ve 8 mg / transkonjugamn seçimi L tetrasiklin ile takviye edilmiştir. Seyreltilmiş süspansiyonu (10 -5 -10 -6) TSA plakaları üzerine tek başına 8 mg / L tetrasiklin plaka 100 ul alıcı sayısını saymak için. 18-24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    7. Cf varlığı için çift dayanıklı koloniler (varsayılan transkonjugamn) analizKoloni PCR 7 ve duyarlılık profili (antibiyograma) ile r geni.
    8. Standart mikrodilüsyon yöntemi veya disk difüzyon yöntemi 11'e göre, uygun antibiyotik minimum inhibitör konsantrasyonlar (MIC) ölçerek antibiyogram belirler. Transkonjugamn duyarlılık profili kloramfenikol (ve cfr geni tarafından etkilenen diğer bileşiklerin) hariç, alıcıya aynı olmalıdır. Bu belirleme donör suşu tarafından geliştirilen tetrasiklin direnci ekarte etmek için esastır.

2. Faj İletimi

Not: Sıphovındae ailesi (laboratuvar stok) ait bakteriyofaj MR83a transdüksiyon deneyleri kullanılmıştır. N315-45 faj enfeksiyonu için CFR verici olarak kullanılmıştır. N315, COL ya da Mu50 suşları alıcı olarak kullanılmıştır. CFR edinimi ab belirlendiAlıcı soyunun ility 32 mg / L kloramfenikol varlığında gelişme. Bu koşullarında yetiştirilen Kolonileri (koloni PCR ile) CFR varlığını belirlemek ve potansiyel kontaminasyonu ekarte etmek duyarlılık profilini belirlemek için analiz edilmiştir.

  1. Donör üzerinde faj amplifikasyon
    1. (180 rpm) çalkalanarak 37 ° C'de 3.6 mM Ca2 + (NBCaCl 2) ile takviye edilmiş bir besin sıvısının 5 ml N315-45 bir gecelik kültürü hazırlayın.
      Not: Kalsiyum faj enfeksiyonu için gereklidir. Malzemeler Tablo Bkz. diğer şirketlerden Besin suyu, kalsiyum yağış gibi konuları, olabilir.
    2. 50 ml cam şişeler veya cam şişeler içinde NBCaCl 2 10 mL'lik bir son hacim içinde 1.000: gece boyunca kültür 1 seyreltilmesi ile alt kültür hazırlayın. (180 rpm) çalkalama ile 37 ° C'de 1 saat boyunca bakteri büyütün.
    3. NBCaCl 2 medi içinde seyreltilmiş faj MR83a bir dizi hazırlanmasıum (10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 ve 10 -6). Bakteriyel kültür seyreltilmiş faj 20 ul ekle. Ayrıca, bakteriyel hücre büyümesi için pozitif kontrol olarak hizmet eder ve bir sonraki gün faj titresini belirlemek için kullanılabilen faj enfeksiyonu olmayan bir kontrol kültürü hazırlamak.
    4. gece boyunca hafifçe çalkalanarak (100 rpm) ile 37 ° C 'de kültür büyütün.
      NOT: bulaşmasını faj fazla değilken hücrelerin bir ölçüde artacaktır; Daha sonra, onlar yüzünden litik döngüsü boyunca faj amplifikasyon lizis fazına girecektir. faj ile kültürler şeffaflık farklı oranlarını gösterir iken faj olmadan kültür, tam büyüme gösterecek.
    5. katma faj en yüksek seyreltme ile bir ya da iki temizlenir kültür şişeleri seçin.
    6. 15 mi santrifüj tüplerine kültürleri aktarın. kloroform 250 ul ekleyin ve tüpler tersini iyice karıştırın.
    7. 5,000 tüpler santrifüj
    8. yeni tüplere transfer süpernatantlar ve kullanılana kadar 4 ° C'de saklayın.
      faj en az birkaç ay boyunca stabil, ancak çok uzun süre faj hazırlık depolama titre ve transdüksiyon etkinliğini azaltır: NOT.
  2. Faj titresi Ölçme (faj plak deneyi)
    1. besin sıvısı agar (% 1.5 ağar) orta hazırlayın; 55 ° C 'de bir su banyosunda sıcak tutmak. 3.6 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar orta otoklavlanmış, 0.5 M CaCI2 çözeltisi ekleyin. 90 mm Petri kapları (NBCaCl 2 tabak) içine dökün.
    2. Çalkalanarak 37 ° C'de NBCaCl 2 5 ml N315 bir gecelik kültürü hazırlamak; Bu, yukarıda tarif edilen kontrol kültürü (aşama 2.1.3) ile ikame edilebilir.
    3. NBCaCl 2 200 ul içinde bir gece boyunca kültürün 10 ul ekle ve eşit NBCaCl 2 plaka üzerine yayıldı. zaman yüzey yayılmasını durdurmakPlaka, sıvı ile kaplanır. plaka kurumasını bekleyin.
    4. Seri 1:10 seyreltme yapın (10 -5 -10 -10) NBCaCl 2 ortamı kullanılarak önceden hazırlanmış faj (aşama 2.1.8) arasında.
    5. Noktası bakteri ile kaplı plaka üzerine, her faj seyreltme 3 ul.
    6. 30 ° C'de gece boyunca inkübasyona bırakılır.
    7. Plak sayıları sayın ve aşağıdaki denklem kullanılarak faj titresi hesaplanır: plak oluşturma birimi (pfu) / ml = plakların sayısı x seyreltme faktörü / lekeli hacmi (3 x 10 mi -3)
  3. faj iletimi
    NOT: Bir önceki aşamada (2.1.8) 'da hazırlanmış faj havuzu, S. aureus suşları içine CFR genin transdüksiyonunu test etmek için kullanılır. Bu deneyde, N315, sütun veya Mu50 alıcı olarak kullanılan türler.
    1. (180 rpm) çalkalanarak 37 ° C'de NBCaCl 2 5 ml N315, COL ya da Mu50 gece boyunca kültür hazırlayın.
    2. t seyreltinO 10 9 pfu / mL ° 'ye kadar NBCaCl 2 faj.
    3. 50 ml'lik bir cam şişe içinde, bir gece boyunca kültür, 500 ul taze NBCaCl 2 500 ul ve faj 1 ml (~ 10 9 pfu / ml) karışımı; enfeksiyonun beklenen (MOI) yumuşak bir 30 dakika (100 rpm) çalkalanarak 37 ° C'de 1 inkübe kanşım aşmamalıdır.
      Not: hemen önce faj ilavesiyle (endojen restriksiyon enzimleri etkisiz hale getirmek 2 dakika boyunca 52 ° C), alıcı hücrelerin ısı tedavisi verimliliği 12 artırabilir.
    4. % 20 Na 3 -Citrate 50 ul ekle. 37 ° C'de 30 dakika boyunca hafif sallama devam edin.
      Not: Na 3 -Citrate kalsiyum ılımlı kenetleyici olarak işlev görür.
    5. Erimiş beyin kalp infüzyon (BHI) agarı (% 1.5 ağar) orta hazırlayın ve 55 ° C'de bir su banyosu içinde muhafaza edin.
    6. , 100 ml'lik bir şişeye bakteri faj karışımı aktarın 32 mg / ml ile takviye edilmiş chloramp sıcak BHI agar 50 ml ilavehenicol ve iyice karıştırın. 90 mm Petri kapları içine karışımı dökün.
      NOT: Bu yöntem, büyüyen koloniler (putatif transdüklenmişler) az sayıda belirlenmesini sağlar.
    7. 24-48 saat boyunca 37 ° C'de inkübe plakası.
    8. Bundan başka, 32 mg / L kloramfenikol ile takviye edilmiş yeni bir BHI agar plakları üzerine koloniler aktarılarak direnç koloniler (transdüklenmişler) test edin. Kolonisi PCR 7 tarafından cfr genin varlığını doğrulamaktadır.

3. Doğal Dönüşüm

Not: S. aureus doğal transformasyon deneyi daha önceki çalışmamızda 2 de tarif edilen yönteme göre gerçekleşir. N315 türevi N2-2.1 2, 7, alıcı olarak kullanılmıştır. Bu zorlanma ise, iç çekişi odağı çoğaltılamaz edildi yapısal ekspres sigh 2 şekilde. det içiniç-ifade yetkinlik varyantlarını izole etmek için nasıl ailed prosedürler, bir önceki açıklamasına 2 bakınız. Transfer edilecek direnç marker kloramfenikol değilse, pRIT-nefes (Cm R), daha önce tarif edildiği gibi, 2, iç geçirerek ifade etmek için kullanılabilir. Saflaştırılmış plasmid ya da CFR gelen bütün DNA ekstraktı, S. aureus COL-45 7 transformasyon için donör DNA olarak kullanılmıştır -acquired.

  1. Donör DNA'nın hazırlanması
    1. TSB 50 mL içeren 300 ml'lik bir şişe içinde 37 ° C'de çalkalama ile COL-45, gece boyunca yetiştirmek 32 mg / L kloramfenikol ile takviye edilmiştir. Kültür, E. coli HST04 taşıyan pHY300 Plazmid (Tet R) kontrol deneyi için plazmid elde etmek için.
      NOT: HST04 (baraj - / dcm -) DNA genleri 13 metilazıyla yoksundur. DNA, metilazlar olan diğer geleneksel suşlar da kullanmak olabilirDNA metilasyonu devlet dönüşüm verimini etkilemez çünkü d DNA donör hazırlamak. Seçenek olarak ise, S. aureus, COL suşundan saflaştırılmıştır pT181 Plazmid aynı zamanda transformasyon deneyi 2 için bir pozitif kontrol olarak kullanılabilir.
    2. Santrifüj (4 ° C'de 10 dakika boyunca 8,000 x g) hücreleri toplamak.
    3. Bütün DNA arındırmak için bir plazmid DNA ekstraksiyon kiti ya da geleneksel DNA saflaştırma yöntemiyle plasmidler ekstrakte edin.
    4. spektrometresi ile saflaştırılmış DNA sayısal olarak ve kullanılana kadar 4 ° C'de tutun.
      NOT: dönüşüm deneyi, eski genellikle az bir hafta taze bir DNA hazırlık kullanın. Alt DNA preparatları dönüşümün etkinliğini azaltır.
  2. Dönüşüm deneyi
    1. Kültür çalkalanarak 37 ° C'de gece boyunca TSB 5 ml alıcı hücre (N2-2.1).
    2. 1.5 ml tüp içine gece boyunca kültür 0.5 mi aktarın. precipisantrifüj (4 ° C 'de 1 dakika süre ile 10,000 x g) hücreleri Tate.
    3. 50 ml'lik bir tüp içinde CS2 ortamı 10 mL süspanse.
      NOT: CS2 orta (Malzeme Tablo orta kompozisyon bakınız) S. aureus 2 doğal dönüşümü için yeterlilik uyaran bir tam sentetik ortamıdır. Örneğin TSB ya BHI gibi diğer standart laboratuvar ortamı, dönüşüm 2, 13 için uygun değildir.
    4. Geç üstel faz (yaklaşık 8 saat) kadar (180 rpm) çalkalanarak 37 ° C'de bakterileri büyür.
    5. Santrifüj (4 ° C'de 5 dakika boyunca 5000 xg) hücreleri hasat.
    6. Taze CS2 ortamı 10 ml tekrar süspansiyon hücreleri.
    7. Hücre süspansiyonuna saflaştırılmış plazmid ya da genom DNA (aşama 3.1.4) 10 ug ekleyin. 37 ° C 'de çalkalanır ve 2.5 saat için 180 rpm.
      Not: DNA ile kısa bir kuluçkalama süresi (<2.5 saat) daha düşük transf nedenormation frekansları.
    8. Santrifüj (5,000 x g 5 dakika, 4 ° C) hücreleri toplamak.
    9. BHI ortamı 10 mL tekrar süspansiyon hücreleri. erimiş BHI agar ve 90 ml 32 mg / L kloramfenikol (kontrol deneyinde veya 5 mg / L tetrasiklin) ile (55 ° C) ek hücre süspansiyonu karıştırın. 90 mm Petri kapları içine karışımı dökün. Hızla serin ve agar katılaşmaya edelim.
    10. 2 gün boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    11. onların direnç özelliklerini teyit etmek için uygun antibiyotik içeren yeni BHI agar plakalarına (kürdan kullanarak) koloniler aktararak üretilen koloniler (dönüştürücüler) çoğaltmak. Kolonisi PCR 7 tarafından satın direnç geni (cfr veya tetM) onaylayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada temsil edilen sonuçlar, daha önce yayınlanmıştır (yayıncının izni ile referans 7 uyarlanmıştır). Biz HGT üç mekanizmaları araştırmak düşük düzeyli linezolid direnci ve S. aureus suşları PhLOPSA dirençli fenotip 14, 15 ifade edilmesine neden olur CFR geninin, potansiyel iletim yollarını inceledi.

Şekil 1, konjugatif deneylerinde elde edilen sonuçları göstermektedir. konjügasyon protokolü farklı konjugatif donör aynı eşli vektörü kullanılarak benzer sonuçlar verir türler arası iletimi (A), hem de tür içi iletimi (B) için kullanışlıdır. konjügasyon etkinliği transkonjugamn Nº (koloni oluşturan birimler, ve cfu / ml), alıcı hücrelerin / Nº (CFU / mL) olarak hesaplanır. Elde edilen frekanslar S. epidermidis veya donör olarak S. aureus kullanarak benzer değerlere sahip, 1 x 10 -6 1 x 10 -5 arasında değişmektedir.

Sonuçlar Tablo 2. CFR özetlenmiştir S. aureus daha konjugasyon ile hem de faj transdüksiyonu ile S. aureus suşları CFR gen transferi mümkün -acquired. Farklı bir direnç markeri (pHY300 plazmit üzerinde tetM geni) için tespit edildi, ancak Bununla birlikte, sonuçlar, cfr iletim için, doğal dönüşümün olmadığını göstermektedir.

Şekil 1
Şekil 1: konjugatif tayinlerde elde edilen alıcı ve transconjugant CFU Temsil. açık barlar sonra izole toplam alıcı suşları temsilAlıcı suşları için seçici ortamda kültür 18-24 saat. dolu çubuklar transconjugant suşları için seçici ortamda kültür 18-24 saat sonra elde edilen toplam çift dirençli suşlar temsil etmektedir. (A) Inter-türler konjugatif tahlil. Staphylococcus epidermidis (SE45) CFR verici olarak kullanılmıştır, ve Staphylococcus aureus, N315 suşu alıcı olarak kullanılmıştır. N315-45 transconjugant suş pSCFS7 benzeri plazmid takılı CFR genini barındırmıştır. Bu tür, MRSA-To-MRSA iletim deneylerde CFR kaynağı olarak kullanıldı. (B) MRSA-to-MRSA konjugatif deneyler. Daha önce elde edilen N315-45 verici olarak kullanılmıştır ve CO veya Mu50 suşları alıcı olarak kullanılmıştır. iki bağımsız deneyin ortalama değerleri, standart sapma (SD) ile gösterilmiştir. Bir büyük görmek için tıklayınızBu rakamın sürümü.

Gerilme adı Açıklama referans kaynağı
Bakteriyel suşlar
SE45 Klinik isolatated S. epidermidis 7
N315 Ön-MRSA, kmr, ErmR 9
COL pT181 plazmid MRSA taşıyan tetrasiklin direnç geni 8
Mu50 MRSA, VISA 9
N315-45 konjugasyon ile S. epidermidis elde edilen bir pSCFS7 benzeri plazmid üzerinde gen cfr taşıyan N315 türevi, 7
COL-45 dkonjugasyon ile S. epidermidis elde edilen bir pSCFS7 benzeri plazmid üzerinde gen cfr taşıyan COL erivative, 7
RN4220-45 konjugasyon ile S. epidermidis elde edilen bir pSCFS7 benzeri plazmid üzerinde gen cfr taşıyan RN4220 türevi, 7
N2-2.1 dönüşüm için hücre doğal yetkinlik sağlayan N315 türetilmiş aktif hücreyi sigh 7
E.coli HST04 hasar / dcm- pHY300 E.coli HST04 hasar / dcm- (Takara) taşıyan tetrasiklin direnç pHY300 plasmidi 11
bakteriyofajlar
MR83a Sıphovındae ailesi Laboratuvar stok
MR83-45 faj MR83a Infect sonra genin CFR taşıyan pSCFS7 benzeri plazmid paketlemeN315-45 içine iyon Bu çalışma

Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan suşlar listesi.

HTG verici alıcı Sıklık
Birleşme N315-45 COL 1.00 x 10 -6
N315-45 MU50 1.29 x 10 -5
iletimi N315-45 COL 1.00 x 10 -11
N315-45 MU50 3.68 x 10 -10
N315-45 N315 6.88 x 10 -10
dönüşüm Plazmidler (COL-45) N2-2.1 ULD
Tüm DNA (COL-45) N2-2.1 ULD
pHY300 (kontrol) N2-2.1 6.52 x 10 -10

Tablo 2: MRSA-to-MRSA deneylerinde elde edilen cfr gen aktarımı HTG frekansları. Konjugatif iletim donör olarak N315 cfr pozitif türevi (N315-45) kullanılarak değerlendirildi. Bu deneylerde iletim frekansı transkonjuganları / alıcı hücrelerin Nº olarak ifade edilir. İletimi N315-45 suşundan amplifiye nakleden faj MR83a kullanılarak değerlendirildi. transdüksiyon frekans transdüklenmişler / pfu Nº olarak hesaplandı. transformation deneyleri vericisi olarak saflaştırılmış DNA (plazmid ya da bütün hücre DNA'sı) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. dönüştürme sıklığı transformantlar / alıcı hücrelerin sayısı olarak hesaplanmıştır. ULD: Limit tespiti altında.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu eser S. aureus genetik belirleyicilerin HGT incelemek için üç büyük yöntem açıklanır. Iletimi ve konjügasyon yıllardır incelenmiştir, ancak doğal dönüşümün mevcudiyeti son 2 tanındı. Böylece, S. aureus HGT üç ana modları hepsi ile donatılmıştır ve hepsi test genetik belirleyicilerinin olası yayma yolları açıklığa kavuşturmak için gereklidir. Bu çalışmanın amacı, tam protokolleri derlemek ve önceden yayınlanmış çalışmaları 7 kullanılan metodolojileri üzerine pratik bilgiler vermektir. Çekimi ve transdüksiyon protokolleri mevcut olmakla birlikte, bu detaylı transformasyon protokolü tarif edildiği ilk çalışmadır.

Filtre birleşme yöntemiyle Konjugasyon basit bir tekniktir ve farklı bakteri türlerinin eş transfer çalışması uygulanabilir= "xref"> 7, 10. Standart inokulum kullanılarak alıcı 18-24 saat sonra ~ 10 9 CFU / mL'lik bir değere ulaşmak sayar. Transconjugant sayımları değişkendir ve değerler güçlü gerilme-to-gerginlik bağımlılığını gösteriyor, ama konjugasyon sonuçları pozitif iken genellikle 10 2 5 10 için ideal bir transconjugant aralığı elde edildi. Burada verilen protokol kullanılarak elde edilen saptama sınırı / <10 mL transkonjuganların oldu. Bu sınır filtre süspansiyon konsantre edilerek optimize edilebilir.

Burada açıklanan doğal dönüşüm protokolü S. aureus N315-türevi suşları kurulmuştur. Transformasyon TSB ve BHI 13 gibi diğer standart laboratuvar ortamı içinde tespit edilemez olduğu CS2 ortamın kullanılması, dönüşüm için kritik önem taşır.

Verici olarak uzun vadeli depolanan plazmidler (örneğin, pT181 ve pHY300) kullanımı hakkında sonuçlandı 10 ila 50-kat düşük frekansı (veriler gösterilmemiştir), DNA kalitesi öne transformasyon sıklığını etkileyebilir. Çentikli plazmidler B. subtilis 16 doğal transformasyon için uygun değildir bilinmektedir.

S. aureus ve E. coli hem de elde edilen DNA, bir restriksiyon engelleyici doğal dönüşüm inhibe etmediğini ortaya koyarak, doğal dönüşüm deneylerinde verici olarak kullanılabilir. Biz de E.coli HST04 hazırlanan DNA arasında aynı dönüşüm frekansını gözlenen (- / dcm - baraj) DNA taşımayan metilasyon durumu dönüşüm sıklığını etkilemez fikrini destekleyen, genleri metilazıyla ve JM109 gelen.

Protokol kullanılarak tespit dönüşüm frekansı düşük olduğu not edilmelidir (~ 10 -9 -10 -10) ve dönüştürülebilir suşları N315 türevleri ile sınırlıdırclass = "xref"> 2. Aynı zamanda, diğer dönüştürülebilir bakteriler 15, 16, 17, rapor edildiği gibi S. aureus dönüşüm verimliliği, suşa özel olabilir muhtemeldir. Daha ileri çalışmalar dönüşüm verimliliği artırmak için devam etmektedir; Bu başka yerlerde tarif edilecektir.

Faj iletimi çoğu S. aureus izolatları bakteriyofajlar 18 tarafından lysogenized çünkü S. aureus en yaygın HGT mekanizma gibi görünüyor. nakleden faj enfeksiyonu yeteneği yatkınlığının bağlıdır ve plak analizi ile kontrol edilmesi gerekir. faj iletimi başka sınırlama DNA boyutudur. Küçük DNA etkin bir şekilde transfer edilebilir, fakat DNA daha büyük 45 kb stafilokok faj kafası 19 paketlenmiş edilemez parçaları. Ancak, yeni bir dev stafilokok faj son zamanlarda b vardıreen ortamından izole edilir ve itcould makul daha büyük bir DNA fragmanlarının 20 aktarabilmek.

Bu çalışmada tarif plak deneyi yöntemi, üst agar kullanılan geleneksel protokol daha kolaydır. Bununla birlikte, bu yöntem, bakteriyel hücrelerin yüzeyi üzerinde oluşturulan küçük plaklar tespit etmek için eşit bir dağılıma sahiptir gerektirir. Sıvı eşit agar yüzeyini kaplayan zaman durdurma, ağar yüzeyinde bakteriyel süspansiyon tamamen bile yayılan biz yayılma öneririz yeterli hacme ulaşmak için. Sonra, temiz bir tezgah hava akışında plakaları kurutun. Bu iletme faj lysogenization önlemek için gerekli ise, enfeksiyon düşük (MOI 1 geçmemelidir) tavsiye edilir. Lysogenized hücreler plak tayininde faj kendi azalmış duyarlılık ile ayırt edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Broth (TSB)  Becton Dickinson  211825
Brain Heart Infusion (BHI) Becton Dickinson  211059
Nutrient Broth No. 2 Oxoid CM0067
Sheep blood agar Eiken Chemical Co.,Ltd. E-MR96 Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer. 
Agar powder Wako Pure Chemical Industries 010-08725
Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate) Wako Pure Chemical Industries 191-01785
Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter Merck Milipore HAWG 02500
QIAfilter Plasmid Midi kit QIAGEN 12243

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lindsay, J. A. Genomic variation and evolution of Staphylococcus aureus. IJMM. 300, 98-103 (2010).
  2. Morikawa, K., et al. Expression of a cryptic secondary sigma factor gene unveils natural competence for DNA transformation in Staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 8, e1003003 (2012).
  3. Caryl, J. A., O'Neill, A. J. Complete nucleotide sequence of pGO1, the prototype conjugative plasmid from the Staphylococci. Plasmid. 62, 35-38 (2009).
  4. Novick, R. P., Christie, G. E., Penades, J. R. The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria. Nat. Rev. Microbiol. 8, 541-551 (2010).
  5. Dubey, G. P., Ben-Yehuda, S. Intercellular nanotubes mediate bacterial communication. Cell. 144, 590-600 (2011).
  6. Dubey, G. P., et al. Architecture and Characteristics of Bacterial Nanotubes. Dev cell. 36, 453-461 (2016).
  7. Cafini, F., et al. Horizontal gene transmission of the cfr gene to MRSA and Enterococcus: role of Staphylococcus epidermidis as a reservoir and alternative pathway for the spread of linezolid resistance. J. Antimicrob. Chemother. 71, 587-592 (2016).
  8. Dyke, K. G., Jevons, M. P., Parker, M. T. Penicillinase production and intrinsic resistance to penicillins in Staphylococcus aures. Lancet. 1, 835-838 (1966).
  9. Kuroda, M., et al. Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 357, 1225-1240 (2001).
  10. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322, 1843-1845 (2008).
  11. Clinical Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Growth Aerobically - Seventh Edition: Approved Standard M7-A7. , CLSI. Wayne, PA, USA. (2006).
  12. Edwards, R. A., Helm, R. A., Maloy, S. R. Increasing DNA transfer efficiency by temporary inactivation of host restriction. BioTechniques. 26, 892-894 (1999).
  13. Thi, L. T., Romero, V. M., Morikawa, K. Cell wall-affecting antibiotics modulate natural transformation in SigH-expressing Staphylococcus aureus. J. Antibiot. , (2015).
  14. Long, K. S., Poehlsgaard, J., Kehrenberg, C., Schwarz, S., Vester, B. The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 2500-2505 (2006).
  15. Ando, T., et al. Restriction-modification system differences in Helicobacter pylori are a barrier to interstrain plasmid transfer. Mol microbiol. 37, 1052-1065 (2000).
  16. Evans, B. A., Rozen, D. E. Significant variation in transformation frequency in Streptococcus pneumoniae. ISME J. 7, 791-799 (2013).
  17. Wilson, D. L., et al. Variation of the natural transformation frequency of Campylobacter jejuni in liquid shake culture. Microbiology. 149, 3603-3615 (2003).
  18. McCarthy, A. J., Witney, A. A., Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus temperate bacteriophage: carriage and horizontal gene transfer is lineage associated. Front Cell Infect Microbiol. 2, 6 (2012).
  19. Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus genomics and the impact of horizontal gene transfer. IJMM. 304, 103-109 (2014).
  20. Uchiyama, J., et al. Intragenus generalized transduction in Staphylococcus spp. by a novel giant phage. ISME J. 8, 1949-1952 (2014).

Tags

İmmünoloji Sayı 121, Yatay gen transferi konjugasyon transdüksiyon transformasyon antibiyotik direnci.
Yatay Gen Transferi Çalışmasında Metodolojisi<em&gt; Staphylococcus aureus</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cafini, F., Thi Le Thuy, N.,… More

Cafini, F., Thi Le Thuy, N., Román, F., Prieto, J., Dubrac, S., Msadek, T., Morikawa, K. Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (121), e55087, doi:10.3791/55087 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter