多能干细胞衍生的心肌修复心肌细胞

人类诱导多能干细胞（人iPS细胞）是用于再生细胞治疗的最有前途的试剂中，因为它们可以分化成不由病人的免疫系统拒绝的细胞的潜在无限范围和数量。然而，它们的自我复制和分化能力也能导致肿瘤的形成，因此，人iPS细胞需要充分分化成特定的细胞类型，如心肌细胞（CMS），内皮细胞（EC），和平滑肌细胞（SMC ），给药前。之一的细胞给药的最简单和最常用的方法是直接的心肌内注射，但是这是由天然心肌组织嫁接移植细胞的数量是非常低的。许多这种消耗可以归因于缺血组织的细胞毒性的环境;然而，当鼠胚胎干细胞（ESC）是直接注入未受损伤心中的心肌Ó交付被保留为3-5小时^1，这表明施用的细胞的相当比例退出给药部位，这可能是因为它们是由过程中产生的高压通过针轨道挤出5百万细胞的唯一一句〜40％心肌收缩。

这里，我们提出新颖的和基本上更有效的方法，用于产生hiPSC衍生的心肌^{（hiPSC-CMS）2，}内皮细胞^{（hiPSC-ECS）3，}和平滑肌细胞^{（SMC）4。}值得注意的是，此hiPSC-SMC协议是第一模仿广泛的通过引导细胞向一个主要合成的或收缩的SMC表型在体平滑肌⁵观察到的形态和功能特征。我们还提供细胞递送的方法，其通过创建一个含有细胞因子的血纤维蛋白p提高注射细胞的植入率ATCH在注射部位。补丁似乎改善两种细胞保留，通过密封针轨道，以防止细胞从离开心肌，和细胞存活，通过在一段至少三天的释放胰岛素样生长因子（IGF）。

所有的实验过程符合阿拉巴马大学伯明翰大学的动物指导进行。

1.区分iPS细胞成hiPSC-CMS

1. 外套预冷生长因子减少的凝胶状蛋白混合物6孔板于4℃过夜的孔中。吸使用前胶状蛋白质混合物。在5％CO ₂和37℃下在mTeSR1介质补充有10μM的ROCK抑制剂播种人iPS细胞到预涂覆板，和培养的细胞（每孔1×10 ^5个细胞）。
2. 每日刷新介质直到细胞达到90％汇合;然后，生长因子减少的胶状蛋白质混合物添加到培养基（0.5毫克胶状蛋白质每6孔板混合物，每孔2毫升培养基），并培养所述细胞为5％的CO ₂和37℃两天。
   1. 要更换介质，轻轻地从经真空培养皿与吸出培养基出触摸的细胞，并使用移液管添加新介质。
3. 通过更换用补充有RPMI1640培养基培养基引发分化生长因子减少的凝胶状蛋白混合物，B27没有胰岛素，和100ng / ml的激活素A;培养的细胞在5％CO ₂和37℃下24小时。
4. 替换已补充有B27没有胰岛素的RPMI1640培养基，10纳克/毫升的骨形态发生蛋白4（BMP-4），和10ng / ml的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的介质;培养的细胞在5％CO ₂和37℃下96小时。
5. 替换用RPMI1640培养基补充有B27培养基并继续培养细胞在5％CO ₂和37℃;刷新介质每3天。
6. 观察开始分化后，在显微镜下收缩细胞〜3天的簇。收集集群后〜7天观察第一收缩和Hanks平衡盐溶液洗。
   1. 分离聚集细胞在板在含100U / ml胶原酶IV 10分钟，在37ºC轻轻摇动Hanks缓冲液培养他们。然后，5分钟加入乙二胺四乙酸（EDTA）0.25％胰蛋白酶。
   2. 中和用在RPMI / B27培养基10％胎牛血清的酶溶液中，然后悬浮细胞在RPMI / B27培养基。
   3. 由血球计数细胞的数目。培养在5％CO ₂和37℃至少3小时10 cm的培养皿的细胞中，这将允许非心肌细胞粘附于培养皿的表面上。
7. 收集细胞悬浮液，其中包含hiPSC-CMS，并通过在凝胶状蛋白质混合物涂覆的表面培养它们维持细胞（约1×10 ⁶每10cm培养皿的细胞）。

2.区分iPS细胞成hiPSC-ECS

1. 通过培养第解离hiPSC人口成单个细胞时间与在5％CO ₂和37℃5分钟螯合剂。转移细胞到含新鲜mTeSR1培养基15ml离心管中。
2. 降速细胞在200×g离心5分钟。重悬在补充有10微米ROCK抑制剂在mTeSR1培养基中的细胞。确定与血球细胞密度。
3. 加入250微升20 NIH单位/ ml凝血酶溶液至24孔板的一个孔中。
4. 加1×10 ⁶人iPS细胞以250微升12.5毫克/毫升纤维蛋白原溶液。与250微升的含细胞的纤维蛋白原溶液添加到凝血酶加载好。观察混合物固化以形成分钟内含hiPSC纤维蛋白支架。
5. 传送固化，含细胞的支架与盖玻璃镊子一个6孔板的孔中，和通过培养补充有没有胰岛素的2％B27在2ml EBM2培养基支架发起分化，激活素A（50毫微克/毫升）和BMP-4在5％的CO（25毫微克/毫升）24小时
6. 轻轻吸出经真空旧媒体不接触电池更换培养基。添加补充有B27没有胰岛素新EBM2培养基，血管内皮生长因子（VEGF，50纳克/毫升），促红细胞生成素（EPO，100纳克/毫升），和转化生长因子β1（TGFβ1，10纳克/毫升）中，并培养_的 CO ₂和37℃下48小时的支架为5％。
7. 刷新培养基和培养在5％CO ₂和37℃另外48小时的支架;然后，加入200单位胶原酶IV（100单位/毫升）对介质释放从支架的细胞。
8. 降速细胞之后发布。用补充有B27，VEGF-A（50毫微克/毫升）和SB-431542（10μM）的2％2毫升EGM2-MV培养基更换培养基;刷新介质每两天。
9. 大约10天后（ 即在14〜分化日开始后），游离细胞用100 U / ml胶原酶IV，隔离ħiPSC的内皮细胞从通过流式细胞分化的细胞的种群分析了EC特异性标志蛋白的表达（ 例如 ^{，CD31，CD144）3。}
10. 通过已建立的协议³展开隔离hiPSC-ECS。

3.区分iPS细胞成hiPSC，平滑肌细胞

1. 种子的人iPS细胞上已经涂覆有凝胶状蛋白质混合物，其板，以及培养中mTeSR1培养基中的细胞在5％CO ₂和37℃，用每日介质的变化，直到汇合（〜2天）。
2. 通过在RPMI1640培养基和2％B27加上胰岛素与CHIR99021（5μM）和BMP-4（10毫微克/毫升）培养细胞3天开始分化成中胚层谱系的细胞。
3. 为了生产hiPSC，校董会由于主要是合成型:
   1. 培养细胞VEGF-A（25纳克/毫升），成纤维细胞生长因子β（FGFβ，5毫微克/毫升）的RPMI1640我 dium和2％B27减去胰岛素在5％CO ₂和37℃下4天。
   2. 培养细胞中的VEGF-A（25毫微克/毫升），FGFβ（5毫微克/毫升）的RPMI1640培养基，2％B27加上胰岛素在5％CO ₂和37 °下进行2天。
   3. 培养的细胞在血小板衍生的生长因子β（PDGFβ，10纳克/毫升），TGFβ（3纳克/ ml）的RPMI1640培养基，2％B27加上胰岛素在5％CO ₂和37 °下进行4天。
4. 为了生产hiPSC-校董会与主要收缩型:
   1. 培养的细胞在RPMI1640 4天的VEGF-A（25毫微克/毫升）和FGFβ（5毫微克/毫升）和2％B27减去胰岛素。
   2. 培养的细胞在RPMI1640和2％B27加上胰岛素7天PDGFβ（5毫微克/毫升）和TGFβ（2.5纳克/毫升）。
5. 通过在含有〜6天RPMI1640代谢平台乳酸盐（4毫摩尔）培养细胞纯化的最终hiPSC-SMC的人群。

1. 热橄榄油在水浴45℃。
2. 保温5毫升10％的明胶溶液至50℃。
3. 明胶加入橄榄油，搅拌，然后通过加入冰水浴快速冷却到5℃。
4. 二十五分钟后，冷却（4℃）丙酮添加到橄榄油以诱导形成微球。
5. 保持5温度 ℃下1小时;然后，收集微球，用预冷却的丙酮洗5次以除去橄榄油，并且允许它们风干，在4℃。
6. 悬浮的微球在70％乙醇和0.25％戊二醛溶液在4℃过夜以诱导交联，然后中和用100mM甘氨酸的混合物。
7. 负载的IGF成微球混合5毫克微球15微升蒸馏水含有5μg的IGF和0.1％牛血清白蛋白30分钟₂ O。

5.创建了损伤部位的修补程序和注射的细胞

1. 在1毫升的最低基本培养基（MEM）一起暂停hiPSC衍生的CMS（2元），平滑肌细胞（100万），和ECS（100万）。
2. 暂停在1ml的纤维蛋白原溶液（25毫克/毫升）5毫克微球。
3. 填充一个针筒与含细胞溶液，用纤维蛋白原/微球体溶液另一注射器，并用1ml的凝血酶溶液的第三注射器（80 NIH单位/ ml，补充有2微升400mM的_氯化钙和200mM的ε氨基己酸）。
4. 通过左前为²如前所述冠状动脉前降支结扎手术诱发心肌梗死心脏的猪。
   注:简单地说，女性约克夏猪（〜13千克，45日龄）的镇静与Telazol /甲苯噻嗪（4.4毫克/千克）的肌内注射，并用异氟烷（0.5-5％）全身麻醉下插管。 A 4 ^日 interc执行ostal开胸手术，左冠状动脉前降支被暴露。冠状动脉被结扎60分钟闭塞，然后结扎被除去。立即电除颤在室颤的情况下进行的。
5. 猪心脏的梗死区的心外膜无菌塑料圈（约2.5厘米）的位置，然后同时注入微球/纤维蛋白原和凝血酶的解决方案成环。
6. 允许该混合物凝固（〜30秒），然后通过固化的混合物插入含细胞注射器的针头插入梗死心肌和注入细胞。关闭肌肉层，皮下组织，与胸壁与取决于动物大小3-0或2-0 Monocryl缝线。丁丙诺啡0.01-0.02毫克/公斤肌注，每8小时将用于控制疼痛为手术后的第3天。
7. 使用心脏磁共振评估心脏功能之前的外科手术，一周和手术过程^2，3，4四周后成像（MRI）。最终MRI研究后，牺牲动物和处理他们的组织学和分子分析^2，3，4心。

差异化hiPSC-CMS，-ECs和-SMCs表征

人iPS细胞的鉴别能力进行了评价2，3，4。流式细胞仪分析肌钙蛋白T（cTnT）的表达表明，最终hiPSC-CM人口的纯度超过90％（ 图1A，1B，面板B1）。几乎所有的细胞中的表达的慢肌球蛋白重链（ 图1B，面板A1），α-肌节肌动蛋白（ 图1B，面板A2），而大约25％的表达肌球蛋白轻链的2V同种型（MLC2v）（ 图1B，面板B2），其被发现仅在心室的CM 4。所述hiPSC-EC分化方案的效率（ 即 ，CD31的百分比+细胞）是质LLY更高时从夹具线人iPS细胞（45.6％， 图1C，面板C2）比用PCBC16iPS细胞（31.3％， 图1C，面板D2）执行;纯度> 95％的人口都通过选择对CD31的表达实现的，所选择的细胞> 90％，继续表达CD31或CD144长达4周的时候培养补充B27 EGM2-MV培养基（无FBS），VEGF，和SB431542（ 图1D）3。纯化hiPSC-平滑肌细胞的94％以上的表达平滑肌肌动蛋白（SMA），但合成hiPSC-平滑肌细胞比收缩hiPSC-平滑肌细胞更可能表达胶原1，连接蛋白43，或波形蛋白（ 图1E）。 hiPSC-平滑肌细胞的迁移和增殖能力进行了评估4。合成hiPSC-平滑肌细胞也比收缩hiPSC-平滑肌细胞更迁移和增殖（ 图1F，面板I和II），而收缩平滑肌收缩更强烈我ñ回应卡巴治疗（ 图1F，面板III，IV和V）。

从明胶微球生长因子释放

在从培养的，无细胞的补丁介质IGF-1水平的ELISA测量表明，生长因子是从微球体在一段至少3天（ 图2A）2释放。该分析是通过加载5毫克的含IGF的微球具有5微克的IGF-1进行。通过混合用1毫升纤维蛋白原溶液和1ml凝血酶微球产生的贴片。贴片是在2ml的MEM中培养。 1毫升培养基中收集和与每个天1毫升新鲜的MEM（ 图2B）所取代。数据以平均值±SEM。

从IR-损伤模型观察

2的猪模型中研究。一共有600万hiPSC-CMS，-ECs和-SMCs（每种细胞类型的200万美元）的直接注射到受伤的心肌组织。对于细胞中+修补组中的动物，贴剂由纤维蛋白和IGF-1的含微球在注射前损伤的部位被创建，而电池组中动物用相同的细胞剂量，但没有补丁处理;两种治疗是从动物的MI组中扣缴。四周伤害和治疗后，细胞中+修补组递送到动物细胞的9％被保留下来并且继续在给药部位中生存，相比于电池组中施用给动物的细胞的4％（ 图图3A）。与细胞既与贴片，但不能与单独的细胞治疗，也associated与心脏功能和梗塞大小（ 图3B）的测量显著改进。

图1:人iPS细胞成心肌细胞，内皮细胞，和平滑肌细胞的分化。心肌细胞的分化和hiPSC-CMS的纯度通过流式细胞仪（A）和组织学不同心脏标志物（B）中进行了评价。 hiPSC的内皮分化用流式细胞仪（℃）来确定。 hiPSC-内皮的血管内皮表型的维护是通过流式细胞术（D）的纯化后分析在2，3，4周CD31和CD144的表达进行评估。 hiPSC的平滑肌细胞的分化是由各种标记（E）的测定。和的迁移和增殖潜力合成平滑肌细胞与从人iPS细胞衍生的收缩平滑肌细胞进行了评估（F）。细胞核中的免疫荧光染色用DAPI复染。比例尺= 100微米（B）和200微米（E和F）。合成hiPSC-平滑肌细胞的迁移和增殖能力进行评价（F，面板I和II）。并在回应卡巴治疗收缩平滑肌收缩了评估（F，面​​板III-V）。 * P <0.05，合成hiPSC-平滑肌细胞收缩与hiPSC-平滑肌细胞。 A和B是从叶升， 等修改。 2。 C和D从张S， 等改性。 3。 E和F是从杨L 等人修改。 4。数据被呈现为平均值（SEM）的平均值±标准误差。两组之间的比较是通过学生的T检验进行评价，和多组间比较是通过单向ANOVA评估。 P <0.05被认为是显着。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2:从微球的生长因子释放的影响。微含IGF-合成（A）。从微球的IGF-1的释放是在1，3，5和7天测量它们合成后（B）。比例尺= 200微米。 A组由叶L 等修改。 2。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3:用hiPSC衍生三系CEL细胞疗法的效率的评价LS。三个细胞群的整体植入率细胞移植（A）4周后评估。心脏功能（由射血分数所示）和梗塞大小物在细胞移植后（B）1和4周通过心脏MRI评估。 * P <0.05与MI; ＃P <0.05与补丁。 A和B是从叶L 等修改。 2。数据以平均值±SEM。组之间的比较分析了用单向方差分析意义。 P <0.05被认为是显著。通过方差分析确定为显著结果与杜克修正了重新分析。

没有。