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采用荧光素二乙酸酯-碘化丙啶双染法评估小脑颗粒神经元培养物中的神经元存活率

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DOI：

10.3791/55442

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2017年5月10日

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1Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, 2Department of Applied Biology and Chemistry Technology, Institute of Modern Chinese Medicine, The Hong Kong Polytechnic University, 3Institute of New Drug Research, Guangdong Provincial Key Laboratory of Pharmacodynamic, Constituents of Traditional Chinese Medicine & New Drug Research, College of Pharmacy, Jinan University, 4International Joint Laboratory (SYSU-PolyU HK) of Novel Anti-Dementia Drugs of Guangdong

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了如何利用荧光素二乙酸酯（FDA）和碘化丙啶（PI）双染色法，在培养的小脑颗粒神经元（一种常用的原代神经元培养模型）中准确测定神经元存活率。 体外 神经科学和神经药理学研究中的模型

摘要

原代培养的小脑颗粒神经元（CGNs）已被广泛用作一种 体外 在神经科学和神经药理学研究中，CGN 培养模型具有重要意义。然而，CGN 培养物中胶质细胞与神经元的共存可能导致神经元活力评估结果出现偏差。荧光素二乙酸酯（FDA）与碘化丙啶（PI）双染法可通过同时检测活细胞与死细胞来测定细胞活力。我们采用 FDA-PI 双染法以提高比色法检测的灵敏度，并用于评估 CGN 中的神经元活力。此外，我们还加入了蓝色荧光 DNA 染料（例如， Hoechst）以提高准确性。本方案描述了在小脑颗粒神经元（CGN）培养中利用这些方法提高神经元存活率评估准确性的操作步骤。通过本方案，可借助荧光显微镜排除胶质细胞的数量干扰。类似的策略也可应用于区分多种混合细胞培养体系中的非目标胶质细胞与神经元，例如原代皮层神经元培养和海马神经元培养。

引言

比色法细胞毒性检测（如3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2-H-四氮唑溴盐（MTT）检测）常用于体外测定细胞活力。in vitro培养的大鼠小脑颗粒神经元（CGNs）对多种神经毒素敏感，包括1-甲基-4-苯基吡啶离子、过氧化氢和谷氨酸1,2。因此，CGN培养物可作为神经科学领域的体外模型。in vitro培养的CGN可能包含多种细胞类型，包括神经元和胶质细胞，其中胶质细胞约占CGN培养物总细胞数的1%。然而，胶质细胞对神经毒素的反应与神经元不同，这会导致比色法检测所测得的神经元活力出现偏差3。

在活细胞中，荧光素二乙酸酯（FDA）可被酯酶转化为荧光素。碘化丙啶（PI）能够穿透死细胞并与DNA结合，可用于指示培养物中的细胞凋亡。因此，FDA-PI双染色可同时评估活细胞与死细胞，表明结合两种比色方法可更准确地测量细胞活力。此外，通过加入用于细胞核染色的蓝色荧光染料Hoechst，可进一步提高细胞活力检测的准确性。本文所述方案介绍了FDA-PI双染色及FDA-PI-Hoechst三重染色方法，可用于准确分析原代培养颗粒神经元（CGNs）的细胞活力。

本实验方案利用颗粒神经元（CGNs）和胶质细胞在大小和形态上的差异，通过显微观察进行识别和区分。染色后，通过荧光显微镜拍摄代表性图像，并据此计数活神经元和死神经元的数量。通过比较荧光模式下与相差模式下拍摄的典型CGNs图像，可排除大尺寸的胶质细胞。该类似策略也可用于检测含有神经元和胶质细胞的混合细胞培养体系中的神经元存活率，例如原代皮层神经元培养和海马神经元培养。

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方案

所有操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物第80-23号，1996年修订版），并经宁波大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准（SYXK-2008-0110）。

1. 溶液与培养基的制备

注意：试剂和储备液需在无菌条件下配制。使用孔径为 0.22 µm 的滤器过滤除菌。

  1. 通过加入 5 mg 的聚-L-赖氨酸（PLL）制备 PLL 储存液  至10 mL的双蒸水（ddH₂O）2O). 过滤除菌。分装后于 -20 ℃ 保存 PLL 储存液 °可保存数月。
  2. 通过加入 7.25 g NaCl、0.4 g KCl、0.14 g NaH₂PO₄、0.37 g MgSO₄·7H₂O、0.294 g CaCl₂、2.1 g NaHCO₃ 和 1.7 g 葡萄糖，用去离子水定容至 1 L，配制 Krebs 缓冲液。2PO4，2.6 g D-葡萄糖和5.94 g 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸加入100 mL ddH2O. 过滤除菌。将 Krebs 缓冲液于 4 ℃ 保存 °C，最长可达一个月。
  3. 制备 3.82% Mg2SO4 通过加入 3.82 g Mg 溶液2SO4 至 100 mL 的 ddH2O. 过滤除菌。储存 Mg2SO4 4 ℃ 的溶液 °可保存数月。
  4. 制备 1.2% CaCl₂ 溶液2 通过加入 1.2 g CaCl₂ 制备溶液2 至 100 mL 的 ddH2O. 过滤除菌。将 CaCl₂ 储存于2 4 ℃ 的溶液 °可保存数月。
  5. 将15 g KCl加入100 mL ddH₂O中，配制2 M KCl溶液。2O. 过滤除菌。将 KCl 溶液在 4 ℃ 保存 °可保存数月。
  6. 将1.8 g D-葡萄糖加入100 mL ddH₂O中，配制D-葡萄糖储存液。2O. 过滤除菌。分装后于 4 ℃ 保存 D-葡萄糖溶液 °C 下最多可保存一个月。
  7. 制备胞嘧啶 β将 0.24 g 的阿糖胞苷（Ara-C）加入 10 mL 去离子水（ddH₂O）中，配制 Ara-C 储存液2O. 过滤除菌。分装后于 4 ℃ 保存阿糖胞苷（Ara-C）储备液 °数月
  8. 使用25 mL胎牛血清（FBS）、2.5 mL 100倍谷氨酰胺、2.78 mL 2 M KCl溶液和2.5 mL 100倍抗生素，在基础伊格尔培养基（BME）中配制250 mL培养基（适用于25–30只新生鼠）。加水至终体积250 mL，并通过过滤除菌。
  9. 在 BME 中加入 2.5 mL 100× 谷氨酰胺、2.78 mL 2 M KCl 溶液和 2.5 mL 100× 抗生素，配制 25K 培养基。定容至 250 mL，过滤除菌。
  10. 在BME中加入2.5 mL 100倍谷氨酰胺和2.5 mL 100倍抗生素配制5K培养基。加水定容至250 mL，过滤除菌。
    注意：培养基、25K 培养基和 5K 培养基需新鲜配制
  11. 将 5 mg FDA 溶于 1 mL 丙酮中，配制 FDA 储存液。将 FDA 储存液于 4 ℃ 保存。 °C 用于长期保存。
  12. 将 1 mg PI 加入 1 mL ddH₂O 中，配制 PI 储存液。2O. 将 PI 储存液在 4 ℃ 保存 °数月
  13. 将 5 mg Hoechst 33342 加入 1 mL ddH₂O 中，配制 Hoechst 储存液。2O. 将Hoechst储存液于4℃保存 °可保存数月。

2. 解剖溶液的制备

注意：在解剖前 1 天进行此操作。

  1. 通过将15 mL Krebs缓冲液、1.2 mL 3.82% Mg2SO4溶液和0.45 g牛血清白蛋白（BSA） 加入150 mL ddH2O中来配制解离溶液。用NaOH调节pH至7.4。
  2. 将5个50 mL离心管分别标记为：1、2、3、4和5。
  3. 将40 mL解离溶液装入带滤器的50 mL注射器中。将30 mL解离溶液过滤至1号管中，再将2 mL分别加入若干个35 mm细胞培养皿中，用于组织处理。
  4. 向2号管中加入12.5 mg胰蛋白酶和50 mL解离溶液。充分涡旋混匀。通过过滤灭菌。
  5. 向3号管中加入1.2 mg DNA酶I、7.8 mg大豆胰蛋白酶抑制剂以及15 mL解离溶液中的150 µL 3.82% Mg2SO4溶液。充分涡旋混匀。通过过滤灭菌。
  6. 向4号管中加入3号管溶液5 mL，并加入10.5 mL解离溶液。通过过滤灭菌。
  7. 向5号管中加入12.5 mL解离溶液中的100 µL 3.82% Mg2SO4溶液和15 µL 1.2% CaCl2溶液。充分涡旋混匀。通过过滤灭菌。
  8. 所有离心管于使用前保存在4 °C。

3. 包被细胞培养板

注意：在解剖前 1 天进行此操作。

  1. 将1 mL PLL储存液加入100 mL ddH2O中（终浓度：5 µg/mL）。向塑料6孔或12孔细胞培养板中加入5 µg/mL的聚-L-赖氨酸溶液进行包被（6孔板每孔2 mL，12孔板每孔1 mL）。
  2. 室温孵育1天（或37 °C孵育2 h）。在解剖前1-2 h，用移液器吸除溶液，用ddH2O洗涤一次，并在细胞培养超净台中干燥。

4. 处理8日龄Sprague-Dawley大鼠的组织。

  1. 将一个100 mm培养皿置于冰上。使用已灭菌的剪刀将新生大鼠幼崽断头并放入培养皿中。
  2. 将剪刀插入枕骨大孔，从耳部向眼部方向剪开颅骨两侧。用镊子提起颅骨，确保整个脑组织保留在颅骨内。用镊子分离小脑，并将其放入上述35 mm培养皿中。
  3. 在解剖显微镜下操作，使用两把镊子去除脑膜和血管。
  4. 用刀片将组织切碎，将切碎的组织放入1号管中。在室温下以1,500 × g离心5分钟。
  5. 吸除上清液，保留沉淀。
  6. 向沉淀中加入2号管中的溶液，轻轻振荡重悬。
  7. 将试管置于37 °C水浴中孵育15分钟，每3分钟轻轻振荡一次。
  8. 向该溶液中加入4号管中的溶液，振荡混匀后在室温下以1,500 × g离心5分钟。
  9. 吸除上清液，保留沉淀。
  10. 加入3号管中的溶液以重悬沉淀。
  11. 准备两个15 mL离心管，将细胞均分为两份，分别加入两个管中。使用带棉塞的巴斯德移液管反复吹打60–70次，以均质化细胞悬液。
  12. 向每个15 mL管中加入3 mL 5号管中的溶液，在室温下静置10分钟后，用带棉塞的巴斯德移液管小心吸出上清液，将上清液转移至新的15 mL管中，并在室温下以1,500 × g离心5分钟。
  13. 吸除上清液，保留沉淀。
  14. 向沉淀中加入培养基，调整细胞密度至约1.5 × 106 个细胞/mL（每10只幼鼠约需100 mL）。
  15. 将细胞接种至培养板中，置于37 °C、5% CO2的培养箱中进行培养。

5. 培养过程中添加Ara-C和D-葡萄糖

  1. 24 小时后，加入阿糖胞苷（Ara-C）储备液（12 孔细胞培养板每孔 10 µL，6 孔细胞培养板每孔 20 µL；终浓度：1 mM），以抑制胶质细胞的生长。
  2. 第 7 天，向 12 孔细胞培养板每孔加入 50 µL D-葡萄糖储备液，或向 6 孔细胞培养板每孔加入 100 µL，使终浓度为 1 mM。

6. CGN 培养中的 FDA-PI 双重染色与 FDA-PI-Hoechst 三重染色

  1. 在10 mL PBS中加入20 µL FDA储备液（终浓度：10 µg/mL）和50 µL PI储备液（终浓度：50 µg/mL），配制FDA-PI工作液。涡旋混匀后置于冰上。
    1. 对于FDA-PI-Hoechst工作液，在10 mL PBS中加入20 µL FDA储备液（终浓度：10 µg/mL）、50 µL PI储备液（终浓度：50 µg/mL）和10 µL Hoechst储备液（终浓度：5 µg/mL）。涡旋混匀后置于冰上。
      注意：FDA-PI工作液和FDA-PI-Hoechst工作液需在使用前新鲜配制。
  2. 将细胞培养板从培养箱中取出，放置在冰上。
  3. 吸除培养基，更换为冷PBS。
    注意：更换溶液时操作应缓慢且小心，避免移液枪头接触细胞。
  4. 吸除冷PBS，加入冷的FDA-PI或FDA-PI-Hoechst工作液（12孔板每孔500 µL，6孔板每孔1 mL），冰上孵育5分钟。
  5. 吸除FDA-PI或FDA-PI-Hoechst工作液，加入冷PBS（12孔板每孔100 µL，6孔板每孔50 µL）。
    注意：成像过程中细胞不得干燥。
  6. 使用荧光显微镜拍摄图像。激发滤光片通带为450 - 490 nm，分别在520 nm、620 nm和460 nm检测FDA、PI和Hoechst的荧光发射信号。在相同条件下，使用荧光显微镜的相差模式在明场下拍摄一张图像。
    注意：FDA-PI或FDA-PI-Hoechst染色后应在15分钟内完成成像。曝光时间为100–300 ms，模拟增益为2.8倍。

7. 神经元活力的评估

  1. 进行 FDA-PI 双染色时，在图形编辑软件中通过将 FDA 阳性层叠加到 PI 阳性层上，对使用不同荧光滤光片检测到的细胞图像进行叠加。
    1. 通过输入调整 FDA 阳性层的不透明度 "50%" 在 "不透明度" 视野的 "层" 面板。通过单击合并两个图层 "合并可见" 按钮中的 "层" 菜单。通过输入调整叠加图像的对比度 "50" 在 "对比" 视野下 "图像"| "优化方案" | "亮度/对比度" 确保在叠加图像中不存在荧光素二乙酸酯（FDA）和碘化丙啶（PI）双阳性细胞。
  2. 对于 FDA-PI-Hoechst 三重染色，通过在图像编辑软件中将 FDA 阳性层拖动至 PI 阳性层上，叠加经不同荧光滤光片检测的细胞图像。通过输入数值调整 FDA 阳性层的不透明度 "50%" 在 "不透明度" 视野的 "层" 面板。
    1. 通过点击合并两个图层 "合并可见" 按钮在 "层" 菜单。将Hoechst阳性层拖动至合并层上。通过输入数值调整Hoechst阳性层的不透明度 "50%" 在 "不透明度" 视野的 "层" 面板。通过点击合并两个图层 "合并可见图像" 按钮在 "层" 菜单
  3. 通过比较荧光模式与相差模式下拍摄的图像，从形态上区分体积较大且不规则的胶质细胞与小脑颗粒神经元—直径为CGNs三倍以上的细胞被视为胶质细胞，应予以排除。
  4. 分别使用图像处理程序中的细胞计数插件对活神经元和死神经元的数量进行计数例如， ImageJ4.
    1. 对于 FDA-PI 双重染色，手动标记呈 FDA 阳性的小细胞为存活神经元，手动标记呈 PI 阳性的细胞为死亡神经元。对于 FDA-PI-Hoechst 三重染色，手动标记同时呈 FDA 阳性和 Hoechst 阳性的小细胞为存活神经元，手动标记同时呈 PI 阳性和 Hoechst 阳性的细胞为死亡神经元。
  5. 使用以下公式计算神经元存活率百分比：%神经元存活率 = [存活神经元数量 / (死亡神经元数量 + 存活神经元数量)] × 100%。对每个孔选取五个随机视野，计算神经元存活率百分比的平均值。

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结果

通过GAP43（红色）和GFAP（绿色）的双重免疫染色，分别分析神经元和胶质细胞的形态2,5。小脑颗粒神经元（CGN）培养物中同时存在神经元和胶质细胞。GFAP阳性的胶质细胞体积较大，形态不规则，如图中箭头所示（图1）。传统的细胞活力检测方法在测定神经元存活率时，无法区分胶质细胞与神经元。因此，FDA-PI染色及FDA-PI-Hoechst染色因能够区分胶质细胞与神经元，更有利于在CGN培养中准确评估神经元的存活情况。

采用低钾刺激诱导小脑颗粒神经元（CGN）培养物中的神经元死亡。代表性图像显示了经低钾培养基（5K）、正常培养基（25K）或原始培养基处理的CGN培养物，通过FDA-PI双染色法（图2A）或FDA-PI-Hoechst三染色法（图2B

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讨论

本方案经修改自先前已描述过的方法6,7研究人员花费了大量时间，通过优化原代神经元培养条件来减少非神经元细胞的生长。 体外8然而，即使在培养条件得到改善的情况下，仍会残留一些胶质细胞。此外，在原代神经元培养中，非神经元细胞是必需的，因为它们有助于神经元的生长和成熟。9在本研究中，使用阿糖胞苷（Ara-C）以抑制胶质细胞的生长，尽管在小脑颗粒神经元（CGN）培养中仍存在约1–5%的胶质细胞。该问题同样存在于其他研究团队的研究中。10在CGN培养中，胶质细胞的大小和形态与神经元存在显著差异。CGN的直径约为10 µm，成熟的CGN具有丰富的突起，用于连接其他神经元。然而，培养中的胶质细胞直径相对较大，约为30–100 µm，因此在图像中易于将胶质细胞与神经元区分开来。因此，FDA-PI和FDA-PI-Hoechst染色的一个优势在于，能够在未通过培养技术抑制非神经元细...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了浙江省自然科学基金（LY15H310007）、浙江省公益性技术应用研究项目（2016C37110）、国家自然科学基金（U1503223，81673407）、宁波市国际科技合作项目（2014D10019）、宁波市生命科学与健康创新团队项目（2015C110026）、广东省科技计划国际合作项目（No. 2013B051000038）、深圳市基础研究计划（JCYJ20160331141459373）、粤港科技合作资助计划（GHP/012/16GD）、香港研究资助局（15101014）、香港理工大学（G-YBGQ）以及宁波大学“王宽诚”基金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚-L-赖氨酸（PLL）SigmaP2636
D-葡萄糖SigmaG8270
胞嘧啶 β-D-阿拉伯呋喃糖苷SigmaC1768
胎牛血清（FBS）Gibco10099141高质量FBS对培养至关重要
100倍谷氨酰胺Gibco25030081
100倍抗生素Gibco15240062
基础伊格尔培养基（BME）Gibco21010046
荧光素二乙酸酯（FDA）SigmaF7378
碘化丙啶（PI）SigmaP4170
Hoechst 33342Yesen40731ES10
兔抗GAP43抗体Abcamab75810
小鼠抗GFAP抗体细胞信号传导3670
牛血清白蛋白（BSA）Sangon BiotechA602440
胰蛋白酶SigmaT4665
DNA酶SigmaD5025
大豆胰蛋白酶抑制剂SigmaT9003
巴斯德吸管VolacZ310727使用前将尖端烧圆
12孔细胞培养板TPPZ707783
6孔细胞培养板TPPZ707759高质量的细胞培养板对于培养至关重要
过滤MilliporeSLGP033RB
移液5 mLExcell BioCS017-0003
移液10 mLExcell BioCS017-0004
解剖显微镜上海凯康XTL2400
CO2 培养箱赛默飞世尔科技311
荧光显微镜尼康TI-S
荧光滤光片和发射立方体尼康B-2A，G-2A，UV-2A
图像处理软件尼康NIS-Elements
图形编辑软件AdobePhotoshop CS
图像处理软件美国国立卫生研究院ImageJ

参考文献

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标签

FDA PI Hoechst DNA

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