方法文章

通过蓝色天然PAGE和蛋白质相关性分析解析亲和纯化蛋白质复合物

14.7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/55498

⸱

2017年4月1日

 ,  ,  , 
1Proteomic Mass Spectrometry, Wellcome Trust Sanger Institute

本文内容

摘要

本文介绍了蛋白质复合物的亲和纯化及其通过蓝色天然PAGE分离的实验方案，随后采用无标记定量质谱技术进行蛋白质相关性分析。该方法有助于将相互作用组解析为不同的蛋白质复合物。

摘要

大多数蛋白质通过与其他蛋白质相互作用发挥功能，因此，为了全面理解生物学过程，明确这些功能单元至关重要。亲和纯化结合质谱技术（AP-MS）已成为鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的首选方法。然而，传统的AP-MS研究虽能提供蛋白质相互作用的信息，却丢失了其结构组织信息。为解决这一问题，我们开发了一种策略，可在质谱分析之前，对亲和纯化获得的蛋白质复合物进行分离，从而揭示目标蛋白可能参与的不同功能组装体。该方法首先利用表位标签对诱饵蛋白进行亲和纯化，并通过竞争性洗脱获得蛋白质复合物，随后采用蓝色天然电泳对这些复合物进行分离。通过定量质谱技术进行相关性分析，比较蛋白质的迁移模式，可将相互作用的蛋白质分配至不同的分子实体中。该方法能够分辨分子量相近的蛋白质复合物，而此类复合物可能无法通过凝胶过滤等传统层析技术有效分离。相较于常规的AP-geLC-MS/MS方法，本策略仅需额外少量操作，即可在鉴定蛋白质相互作用的同时，获得蛋白质复合物的拓扑结构信息，在许多情况下已足够满足研究需求。

引言

在细胞中，大多数蛋白质通过短暂的蛋白质-蛋白质相互作用或形成稳定的蛋白质复合物来发挥其功能。解析蛋白质相互作用对于全面理解细胞过程至关重要。亲和纯化结合质谱技术（AP-MS）是鉴定天然蛋白质相互作用最常用的方法之一。过去十年间仪器性能的显著提升使该方法变得极为强大。需要指出的是，AP-MS实验所鉴定到的相互作用包含了诱饵蛋白与猎物蛋白之间的直接和间接关联。此外，蛋白质常常在同一细胞环境中参与多个不同的复合物，而这些复合物可能具有不同的生物学功能，因此AP-MS所鉴定到的互作蛋白可能代表了多种不同的蛋白质复合物或功能实体的混合。此类拓扑学信息无法通过AP-MS直接获得 先验的 从简单的AP-MS实验产生的单一维度蛋白质列表中获取信息。然而，该技术可进一步结合一种或多种方法用于解析这些复合物，从而界定蛋白质复合体的结构架构。

为了确定通过AP-MS鉴定出的蛋白质相互作用的拓扑结构，已采用多种策略。一种方法是利用前一轮实验中鉴定出的捕获蛋白作为诱饵，进行迭代式的AP-MS实验1。尽管该方法信息量丰富，但在实验和分析上均非常耗时耗力。蛋白质交联结合质谱技术正越来越多地用于获取蛋白质复合物的拓扑信息2,3,4,5。然而，交联肽段的计算分析仍是一项具有挑战性的任务，因此成为整个流程中的瓶颈。MS可裂解交联试剂的出现应有助于绘制相互作用蛋白中空间上邻近的氨基酸残基6,7。另一种替代策略是将亲和纯化与先前的正交分离技术相结合8,9。近年来，凝胶过滤或离子交换色谱分离，以及蔗糖梯度分离，也已与定量质谱联用，用于在全系统水平上描述多蛋白复合物，从而绕过复杂的分离步骤10,11,12,13。蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）已被广泛应用于研究天然状态下的蛋白质相互作用，通常用于线粒体膜蛋白复合物的相关研究14。该分离技术最近还与非标记蛋白质定量和相关性分析相结合，不仅应用于线粒体复合物的研究15,16,17，也用于解析来自全细胞的其他蛋白复合物18,19。我们推测，将亲和纯化与后续的天然状态分离方法及定量质谱相结合，应能为解析包含特定蛋白质的多个蛋白组装体提供一种有效的策略。

本文介绍一种方法，该方法结合通用表位亲和纯化与分离复合物的蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后进行定量质谱分析和蛋白质相关性分析，以解析蛋白质可能参与的多种复合物结构。我们采用小鼠胚胎干细胞，其中目标蛋白与表位标签融合，并在内源性位点表达，以实现接近生理水平的表达量，并确保高效地分离天然复合物。该方法能够揭示蛋白质所参与的多种相互作用，并根据其相关性图谱将这些相互作用解析为不同的复合物组装形式，同时所需工作量不高于传统的凝胶电泳-质谱联用技术20。

方案

1. 通过FLAG亲和纯化分离天然蛋白质复合物

  1. 准备工作
    1. 设置一个 37 °C 水浴用于解冻细胞沉淀。
    2. 将微量离心机预冷至 4 °C。
    3. 将若干不同规格的微量离心管（1.5 mL、15 mL）和匀浆器置于冰上。
    4. 配制 10 mL 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8，150 mM NaCl，0.1% Nonidet P-40，1 mM EDTA），并置于冰上保存。使用前立即向缓冲液中加入 10 μL 1 M DTT 和一片压碎的无 EDTA 蛋白酶抑制剂片剂。
  2. 抗体偶联磁珠的制备
    注意：抗体包被的磁珠可提前一周制备，并保存在冰箱中备用。除兔 IgG 外，蛋白 G 对大多数物种的免疫球蛋白亚型的亲和力高于蛋白 A；对于兔 IgG，蛋白 A 的亲和力更高。
    1. 洗涤 50 μL 蛋白 G 包被的磁珠：将 50 μL 磁珠悬液转移至微量离心管中，将管子置于磁力架上使磁珠吸附于管壁一侧，弃去上清液。用 0.5 mL PBS-0.01% Tween-20 重悬磁珠。
    2. 将管子置于磁力架上使磁珠吸附于管壁一侧，弃去上清液。用 40 μL PBS-0.01% Tween-20 重悬磁珠，加入 10 μg（10 μL 的 1 mg/mL 储存液）M2 抗 FLAG 抗体。室温下旋转孵育 20 分钟。
    3. 将管子置于磁力架上使磁珠吸附于管壁一侧，弃去上清液。用 0.5 mL PBS-0.01% Tween-20 洗涤磁珠一次。
    4. 为将抗体交联至磁珠，用 1 mL 0.2 M 三乙醇胺（pH 8.2）洗涤磁珠两次。然后将磁珠重悬于 1 mL 含 20 mM DMP（二甲基戊二咪酯）的 0.2 M 三乙醇胺缓冲液（pH 8.2）中（DMP 溶液需在使用前新鲜配制）。室温下旋转孵育 30 分钟。
    5. 将管子置于磁力架上，弃去上清液，将磁珠重悬于 0.5 mL 50 mM Tris-HCl（pH 7.5）中。室温下旋转孵育 15 分钟。
    6. 用 0.5 mL PBS-0.1% Tween-20 洗涤磁珠三次。最后一次洗涤后，将磁珠保留在洗涤液中，待用。
  3. 基于 FLAG 标签的亲和纯化
    注意：避免磁珠长时间处于无缓冲液状态。所有缓冲液和离心管应始终置于冰上。以下方案适用于从表达内源水平 FLAG 标签蛋白的 2–5 × 108 个细胞（10–20 mg 蛋白裂解物）中纯化蛋白复合物20。
    1. 将细胞沉淀置于 37 °C 水浴中解冻，直至开始融化。取出离心管，轻轻涡旋至沉淀完全解冻，并立即将含有细胞悬液的离心管置于冰上。
    2. 向细胞悬液中加入 5 mL 冰冷的裂解缓冲液（含 DTT 和蛋白酶抑制剂），轻轻混匀。冰上孵育 10 分钟。
    3. 将裂解物转移至预冷的 Dounce 匀浆器中，使用紧配研杵匀浆 20–30 次（直至无明显黏稠感）。将匀浆液转移至预冷的微量离心管中。
    4. 在 4 °C 下以 18,000 × g 离心 15 分钟。
    5. 将上清裂解物转移至洁净的预冷离心管中，保留 50 μL 裂解物。取 35 μL 裂解物用于测定蛋白浓度并监测纯化过程。
    6. 弃去磁珠中的 PBS-0.1% Tween-20。用 1 mL 裂解物重悬磁珠，并与剩余裂解物混合。4 °C 下旋转孵育 1–2 小时。
    7. 将磁珠置于磁力架上吸附于管壁一侧。取 30 μL 上清液保存，其余上清液弃去。用移液器反复吹打 4–6 次，以 0.5 mL IPP150 缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8，150 mM NaCl，1 mM EDTA，0.1% NP-40）重悬磁珠。转移至 1.5 mL 预冷离心管中。
    8. 再用 0.5 mL IPP150 缓冲液洗涤磁珠两次。
    9. 用 0.5 mL FLAG 天然洗脱缓冲液（20 mM Bis-Tris pH 7，20 mM NaCl，0.02% Nonidet P-40，1 mM EDTA，200 mM ε-氨基己酸）洗涤磁珠三次。最后一次洗涤时，将磁珠转移至新的预冷离心管中，并彻底去除缓冲液。
    10. 用 100 μL 含 200 μg/mL 3x FLAG 肽的天然洗脱缓冲液重悬磁珠。4 °C 下轻柔旋转孵育 10 分钟。
    11. 将磁珠置于磁力架上吸附，将上清液转移至新的预冷离心管中。
    12. 重复步骤 1.3.10–1.3.11 两次，合并所有洗脱液。
    13. 将洗脱液在离心过滤装置（10 kDa 分子量截留值，PES 材质）中于 4 °C、10,000 × g 离心浓缩至 25 μL。将浓缩后的洗脱液转移至新的预冷离心管中，并加入 50% 甘油，使其终浓度为 5%。如需，浓缩洗脱液可在 4 °C 短期保存过夜。

2. 蓝色天然PAGE

  1. 准备工作
    1. 配制 1 L 的 1× 天然 PAGE 阳极缓冲液、1× 天然 PAGE 深蓝色阴极缓冲液和 1× 天然 PAGE 浅蓝色阴极缓冲液。
    2. 取下预铸 3-12% 天然 PAGE 胶的梳子，用 1× 天然 PAGE 深蓝色阴极缓冲液冲洗加样孔两次，并在加样孔中充满该缓冲液。将凝胶安装至电泳槽中，但不要向阴极（内槽）腔室中加入深蓝色阴极缓冲液。
  2. 电泳运行
    1. 样品制备：向 25 μL 浓缩洗脱液中加入适量 4× 天然上样缓冲液和 0.5% G-250 样品添加剂，使终浓度分别为 1× 和 0.005%。
    2. 上样，将样品与天然分子量标准品之间留出一个空孔，其余所有空孔中各加入 10–20 μL 的 1× 天然上样缓冲液。
    3. 小心地向阴极（内槽）腔室中加入 200 mL 的 1× 天然 PAGE 深蓝色阴极缓冲液，避免扰动样品；向阳极（外槽）腔室中加入 550 mL 的 1× 天然 PAGE 阳极缓冲液。
    4. 以 150 V 电压运行 30 分钟后暂停电泳，用移液管吸除深蓝色阴极缓冲液并更换为 1× 浅蓝色阴极缓冲液，继续电泳 60 分钟。电泳可在室温或 4 °C 条件下进行；温度可能影响蛋白质复合物的结构。
  3. 凝胶染色
    1. 打开凝胶夹板，弃去其中一块板。凝胶将保留在另一块板上。将凝胶连同板一起转移至盛有足量固定液（40% 甲醇，2% 乙酸）的托盘或容器中，确保液体覆盖凝胶，于轻度摇动条件下孵育 30 分钟。
    2. 移除固定液，加入足量水覆盖凝胶。此时可对凝胶进行扫描以供后续参考。

3. 质谱分析

注意：所有后续步骤应尽可能在层流罩内进行，以确保样品的洁净。所有溶液均应使用高效液相色谱级水配制。请与将进行质谱分析的实验室讨论本方案。

  1. 准备工作
    1. 将一个锥底96孔板放置在另一个96孔板之上，用于收集废液。使用21 G针头刺穿锥底96孔板各孔的底部。
    2. 清洗穿孔后的96孔板的孔。
      1. 向穿孔板的各孔中加入200 μL的50%乙腈-0.25%甲酸溶液。将叠放的板置于摇床上孵育10分钟。
      2. 以500 × g离心1分钟，使液体通过小孔流入废液收集板中。弃去废液。
      3. 重复步骤3.1.2.1–3.1.2.2两次。
      4. 向穿孔96孔板的各孔中加入150 μL新鲜配制的50 mM碳酸氢铵溶液。
    3. 清洗离心过滤式96孔板的孔。
      1. 在离心过滤板下方放置一个普通96孔板以收集废液。向离心过滤板的每个孔中加入200 μL的50%乙腈-0.25%甲酸溶液。
      2. 将板叠以200 × g离心1分钟。弃去废液。
      3. 重复步骤3.1.3.1–3.1.3.2两次。
  2. 凝胶切取与原位酶解
    注意：在切取凝胶时，应识别并记录每个蛋白标准品所对应的凝胶条带位置。蛋白标准品可用于估算所有凝胶条带的大致分子量。
    1. 将带有玻璃板的凝胶放置于洁净表面上。将含有样品的泳道切成48个相同大小的条带（1.5 mm × 5 mm）。将每个条带进一步切成2–3个小块（凝胶顶部最后五个条带除外），并按顺序依次放入已穿孔并清洗过的96孔板的各个孔中。
    2. 向每个孔中加入50 μL乙腈。在摇床上孵育30–60分钟。通过离心（同步骤3.1.2.2）去除液体。
    3. 向每个孔中加入200 μL含2 mM TCEP的50 mM碳酸氢铵溶液。在室温下摇床孵育30分钟。通过离心（同步骤3.1.2.2）去除液体。
    4. 向每个孔中加入200 μL含4 mM碘乙酰胺的50 mM碳酸氢铵溶液。在37 °C避光条件下摇床孵育30分钟。通过离心（同步骤3.1.2.2）去除液体。
    5. 向每个孔中加入150 μL 50 mM碳酸氢铵溶液和50 μL乙腈，室温下摇床孵育30分钟。重复此洗涤步骤，直至凝胶小块中的蓝色完全去除。
    6. 通过加入200 μL纯乙腈使凝胶小块脱水，在室温下摇床孵育20分钟，直至凝胶小块变为白色且不透明。去除乙腈。
    7. 向每个孔中加入150 μL冷的50 mM碳酸氢铵溶液，其中含有0.001 mg/mL胰蛋白酶（测序级）。在37 °C摇床孵育2小时。1小时后检查凝胶小块是否被液体覆盖；如未覆盖，可额外加入50–100 μL 50 mM碳酸氢铵溶液。2小时后，在37 °C继续于25 °C过夜消化。
    8. 在含凝胶的板下方放置一个洁净的锥底板，确保两板方向正确对齐。以200 × g离心1分钟，收集含有肽段的液体。
    9. 将含有肽段的板置于离心浓缩仪中，在进行下一步操作的同时蒸发液体。
    10. 向凝胶小块中加入150 μL 50%乙腈-0.25%甲酸溶液。在37 °C摇床孵育30分钟。
    11. 通过200 × g离心1分钟，将液体收集至步骤3.2.9中部分干燥的板中。在进行下一步操作的同时继续蒸发含有肽段的板。
    12. 重复步骤3.2.10–3.2.11。
    13. 向含有凝胶小块的板的每个孔中加入200 μL纯乙腈。在室温下摇床孵育15分钟。
    14. 通过200 × g离心1分钟，将液体收集至含有肽段的板中。
    15. 确保所有孔中乙腈的最终浓度高于55%。如有需要，可额外加入纯乙腈。
    16. 将肽段溶液转移至已清洗的离心过滤96孔板中。在其下方放置一个洁净的锥底板以收集肽段。将板叠以200 × g离心1分钟。
    17. 将锥底板中的液体蒸发至完全干燥。此时可用硅胶盖密封板，并于-20 °C保存。
    18. 用32 μL 0.5%甲酸剧烈振荡15分钟重新溶解肽段。加入8 μL 400 mM碳酸氢铵，剧烈振荡孵育15分钟。以200 × g离心1分钟。盖上硅胶盖，将板于-20 °C保存，直至进行质谱分析。
  3. 质谱分析
    注意：使用适用于鸟枪法蛋白质组学的高分辨质谱仪分析肽段。数据依赖性采集（DDA）是此类分析中最常用的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）模式，应优化以实现高效的肽段鉴定，减少冗余测序和背景噪声下的候选选择。第一级质谱扫描（MS1）应以轮廓模式记录。建议优先选择双电荷和三电荷离子进行第二级质谱分析（MS2）。m/z 400–1,600的质量范围适用于鉴定大多数长度为8–30个氨基酸的肽段。以下提供使用Orbitrap质谱仪进行分析的实验方案。
    1. 使用纳米液相-质谱联用系统（nanoLC-MS/MS）的自动进样器，每次分析进样20 μL样品。在反相C18柱（内径100 μm，长度2 cm）上对肽段进行脱盐和富集。
    2. 使用分析型C18柱（内径75 μm，长度15 cm），以300 nL/min流速进行30分钟线性梯度洗脱（4–28%乙腈/0.1%甲酸）分离肽段。
    3. 采用top 10数据依赖性采集模式在质谱仪中分析肽段，参数如下：m/z范围380–1,600，m/z 400处分辨率为30,000，隔离宽度2 Th，动态排斥±10 ppm持续45秒，自动增益控制目标值MS为1 × 106，MS/MS为5,000，最大注入时间MS为150 ms，MS/MS为100 ms。

4. 数据分析

  1. 使用 MaxQuant 进行蛋白质鉴定与定量
    1. 使用免费的 MaxQuant 软件，基于质谱原始数据对每个凝胶组分中的蛋白质进行鉴定和定量。
      注意：MaxQuant 适用于基于数据依赖性采集（data-dependent acquisition）的鸟枪法蛋白质组学方法所产生的数据。蓝色天然凝胶各组分的质谱数据应作为独立实验进行批量分析，而非作为合并所有凝胶条带的单一实验中的不同组分。勾选 iBAQ 值选项框以进行化学计量学计算。有关使用 MaxQuant 进行数据库搜索和蛋白质定量的详细方案见文献21,22。
  2. 使用 Perseus 进行蛋白质谱型分析
    1. 使用免费软件 Perseus 显示已鉴定蛋白质的迁移谱型，并通过统计分析进行比较。
      注意：Perseus 的使用方法通用文档请访问 http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:tutorials。示例数据集可作为补充数据获取。
    2. 上传 MaxQuant 分析生成的 proteingroups.txt 文件，该文件包含所有凝胶组分的蛋白质鉴定结果和定量值。将强度值填入主数据框中（图 1）。随后将显示一个矩阵，其中行为所有鉴定到的蛋白质，列为各凝胶组分。
    3. 在“按分类列筛选行”下拉菜单中选择“基于分类列筛选行”，以去除反向匹配项、仅由位点鉴定的蛋白质以及潜在污染物（图 2）。
    4. 在“归一化”下拉菜单中选择“除法”，然后选择“总和”，以各蛋白质在整个谱型中相对于总蛋白强度的方式对各组分强度进行归一化处理（图 3）。新的矩阵将随之生成。
    5. 在“可视化”下拉菜单中选择“谱型图”（Profile Plot），以显示所有蛋白质的迁移谱型图（图 4）。
    6. 在“筛选行”下拉菜单中选择“基于有效值筛选行”，并输入所需有效值数量为 1。
    7. 在“聚类/PCA”下拉菜单中选择“层次聚类”，对所有蓝色天然凝胶组分中的已鉴定蛋白质进行层次聚类分析。取消勾选“列树”选项框（图 5）。聚类结果将以热图形式显示在矩阵旁边的“聚类”标签页中（图 6）。
    8. 在系统发育树图中定位包含诱饵蛋白的聚类群。该聚类中的其他组分代表与诱饵蛋白共迁移的蛋白质，因此可能是与之相互作用的蛋白或同一复合物的亚基。

软件界面中的数据上传过程；矩阵选择和强度数据输入；操作指南。
图1. Perseus 数据上传窗口的截图。 该图展示了将蛋白质鉴定和定量数据载入 Perseus 的操作步骤。请点击此处查看该图的放大版本。

软件界面中的数据过滤过程；选择过滤器，应用分类标准。
图 2. Perseus 窗口中过滤对应于污染物、反向匹配以及仅由位点鉴定出的蛋白质条目的截图。 选择“按分类列过滤行”将打开一个新窗口，用于选择要从数据集中剔除的蛋白质条目类型。 请点击此处查看该图的放大版本。

电子表格软件中的数据标准化流程，包含求和选择与分析的Σ方程。
图3. Perseus标准化窗口的截图。 在“标准化”菜单中选择“Divide”会打开一个新窗口，提供多种选项。选择“Sum”可将每种蛋白质在各个组分中的强度值除以该蛋白质在所有组分中的总强度值。 请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质组学数据分析，包含迁移谱图和定量迁移谱的矩阵设置示意图。
图 4. Perseus 软件界面截图，显示迁移谱图。 可在谱图下方的矩阵中选择蛋白质，以高亮显示其对应的谱图。可使用工具栏对谱图进行编辑和导出。请点击此处查看该图的放大版本。

层次聚类设置示意图；显示L1距离、树状图、热图生成步骤。
图5. Perseus层次聚类窗口的截图。该图显示了使用曼哈顿（L1）距离度量进行蛋白质层次聚类的设置。请点击此处查看此图的放大版本。

用于数据可视化和导出的聚类分析软件界面，包含树状图和热图。
图 6. Perseus 软件界面截图，显示树状图和蛋白质强度热图。 主面板右侧的工作流程展示了所执行的每一步操作及其生成的矩阵，可用于撤销任意步骤。工作流程还可从任意中间矩阵分支进行。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 计算相对化学计量比
    1. 根据蛋白亚基与诱饵蛋白的共聚类情况，选择蛋白复合物的亚基，并界定其出现的谱图峰区域。
    2. 分别使用 MaxQuant 分析为每条组分在各分馏组中提供的 iBAQ 值，并以该分馏组中对应诱饵蛋白的 iBAQ 值进行归一化处理。
    3. 绘制诱饵蛋白及蛋白复合物亚基在所选峰对应各分馏组中的归一化 iBAQ 值，并进行线性回归分析。通过比较其归一化 iBAQ 值的变化趋势，计算复合物亚基相对于诱饵蛋白的相对含量。
  2. 蛋白复合物大小的估算
    1. 利用蛋白标准品，计算样品泳道中与蓝色天然凝胶切片相对应的预测分子量。通过将凝胶切片区段作为 x 轴，分子量作为 y 轴，建立线性回归模型。
    2. 利用该模型，根据鉴定到蛋白复合物的蓝色天然凝胶切片区段，估算其观测到的分子量范围。

结果

亲和纯化蓝非变性蛋白质质谱相关性分析（ABC-MS）策略的工作流程如图7所示。通过使用针对表位标签（本例中为FLAG）的抗体进行亲和纯化，并结合竞争性洗脱，分离目标蛋白周围的天然蛋白质复合物。复合物通过BN-PAGE分离后，将整个凝胶泳道切割为48个区段，并用于鸟枪法LC-MS/MS分析。利用定量质谱信息，为每种鉴定出的蛋白质在蓝非变性分离过程中的迁移行为生成迁移谱。形成特定复合物的相互作用蛋白表现出相似的迁移谱，其峰形可重叠。当目标蛋白参与多个不同组装体时，若这些亚复合物在蓝非变性凝胶的分辨能力范围内，则其迁移谱中会出现多个峰。通过层级聚类进行蛋白质相关性分析，可系统比较各迁移谱。所有组分的树状图及峰强度以热图形式可视化，有助于识别属于不同蛋白质复合物的相互作用蛋白（图8）。

我们采用该策略分析了Mta2的相互作用蛋白伙伴，Mta2是NuRD染色质重塑复合物的核心亚基20。如图9所示，Mta2的迁移谱在700 kDa至1.2 MDa之间显示出两个不同强度的峰，其中较低分子质量峰的丰度更高。其他NuRD核心亚基，包括Mta1/3、Hdac1/2和Mbd3，也表现出相同的分离模式，尽管某些亚基（即Chd4、Gatad2a/b和Rbbp4/7）的峰丰度分布相反（图9A, B）。相比之下，Cdk2ap1（一种将NuRD复合物招募至Wnt基因启动子的调控因子）23的谱图仅显示较高分子质量的峰（图9C），转录抑制因子Sall4也是如此，已有研究证明Sall4也可结合NuRD复合物20,24,25。因此，通过蓝色天然PAGE对亲和纯化的Mta2相关蛋白进行分级分离，能够分辨出两种不同形式的NuRD复合物。

ABC-MS 还能够在将新相互作用蛋白分配至特定蛋白质实体的同时实现其鉴定。通过分析热图中呈现的蛋白质簇及组分信号强度，我们检测到 NuRD 亚基与 MLL 甲基转移酶复合物的调控亚基 Wdr5 之间存在强烈的相关性 26，其中Wdr5显示出两个迁移峰，与NuRD的两个峰位置重合（图8)，表明Wdr5与NuRD之间存在一种新的相互作用。我们通过共免疫沉淀和凝胶过滤层析中的共迁移实验验证了这一相互作用。 20.

层次聚类中距离度量方法的选择会影响聚类的形状，从而影响相关性。我们建议尝试不同的度量方法，以使结果与目标蛋白或复合物已知的相互作用信息达到最佳匹配。通常情况下，我们发现使用曼哈顿（L1）距离度量可获得最佳结果。 20皮尔逊相关性或欧氏距离度量方法也已被用于基于其他分级分离技术鉴定复合物 10,11,12.

从蓝色天然电泳组分中获得的定量质谱数据还可用于确定蛋白质复合物的化学计量比。iBAQ（基于强度的绝对定量）值可用来衡量已鉴定蛋白质的相对丰度27,28。将迁移谱图峰内各组分中蛋白质复合物成员的iBAQ值相对于诱饵蛋白进行归一化，以获得各组分的相对含量。对于某一特定蛋白质复合物成员，在谱图峰范围内的归一化iBAQ值应呈现水平趋势，该趋势的数值反映了相互作用蛋白相对于诱饵蛋白的化学计量比。有关化学计量比计算的更详细说明，请参见20。

BN-PAGE 和 LC-MS/MS 流程图；蛋白质分离与鉴定分析。
图 7：总结 ABC-MS 策略的示意图工作流程。 本图修改自20。请点击此处查看此图的放大版本。

显示强度梯度的蛋白质相互作用热图；kDa 标记；BN 组分数据分析。
图 8. Mta2 相互作用蛋白的 BN-PAGE 迁移谱的层次聚类分析。 根据迁移谱的相似性对与 Mta2 相关的蛋白质进行聚类。仅显示包含 NuRD 复合物的热图子集（由蓝色框标出）。黄色框突出显示 Wdr5 与 NuRD 复合物之间的强相关性。标注的分子量是根据在同一凝胶中运行的蛋白质标准品的迁移距离估算得出。本研究最初发表于《分子与细胞蛋白质组学》，由美国生物化学与分子生物学学会出版 20。请点击此处查看此图的放大版本。

显示Mta2在BN组分中相互作用的蛋白质强度图；图A、B、C比较了数据。
图9. NuRD亚基及相关蛋白的BN-PAGE迁移图谱。A) Mta2与NuRD亚基呈现相似的强度模式。B) Mta2与NuRD亚基呈现相反的强度模式。C) Mta2与仅存在于较高分子量NuRD复合物中的Cdk2ap1。标注的分子量是根据蛋白质标准品的迁移图谱估算得出。本研究最初发表于《分子与细胞蛋白质组学》20，由美国生物化学与分子生物学学会出版。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质序列比对，表格数据分析，生物信息学比较，序列保守性。
补充数据：示例数据集。 来自ABC-MS实验的MaxQuant生成的proteingroups.txt文件，包含蛋白质鉴定结果和定量数值。本研究最初发表于《分子与细胞蛋白质组学》20，美国生物化学与分子生物学学会。 请点击此处下载该文件。

讨论

本文介绍了亲和纯化结合蓝色天然凝胶电泳及定量质谱技术用于解析蛋白质复合物的方法。该方法能够将一维的蛋白质相互作用列表解析为具有功能的蛋白质组装体。

我们展示的方法基于使用表位标签蛋白。然而，如果无法获得表达标签蛋白的细胞系，则可考虑使用针对目标蛋白的抗体作为替代方案，前提是存在可用于实现天然竞争性洗脱的肽段。起始材料的用量以及磁珠的数量可能需要根据目标蛋白的表达水平进行调整。我们通常使用 2-5 × 108 个细胞作为起始材料，即使对于低表达水平的蛋白也足够。裂解缓冲液的组成应通过实验经验确定，以实现对目标蛋白近乎完全的溶解。对于某些类型的蛋白，特别是染色质结合蛋白或膜蛋白，这可能具有挑战性。其他可选方案包括增加盐浓度（前提是所研究的蛋白复合物在高盐条件下稳定），或对染色质结合蛋白采用超声处理和/或核酸酶处理20,29。对于膜蛋白，建议更换去垢剂为 DDM 或皂苷30。对于DNA结合蛋白，在纯化步骤中加入核酸酶（如苯甲酸酶）是有益的20。彻底去除核酸可确保检测到的相互作用是蛋白质之间的直接相互作用，而非由DNA介导。

使用该方法时需要考虑的一个关键因素是所研究复合物的稳定性。该实验流程较长，可能涉及将蛋白质复合物保存过夜。我们已成功应用于两种染色质重塑复合物（D. Bode 和 M. Pardo，数据未展示），但此步骤仍需根据具体情况评估。如有需要，可缩短亲和纯化步骤的时间。

允许天然状态分离的替代技术，例如尺寸排阻色谱法，已被广泛使用超过50年，用于表征蛋白质复合物。我们及其他研究者已证明，蓝色天然PAGE的分辨率优于尺寸排阻色谱法所达到的分辨率20,31,32,33。蓝色天然PAGE的另一优势在于，它无需使用昂贵的色谱系统，而是采用实验室中普遍配备的蛋白质电泳设备。就实际操作时间而言，该方法所需工作量并不超过传统的geLC-MS/MS方法或离线色谱分离。然而，与其他大多数分离技术一样，其分辨率也存在一定的局限性。对于高度均一或在质量和形状上极为相近的复合物，蓝色天然PAGE可能无法分辨，因此本文所报道的方案在解析具有共同亚基的不同复合物时可能并非普遍适用。值得鼓舞的是，我们已成功分离了两个共享三个亚基的、非常相似的四聚体复合物（M. Pardo，论文在准备中）。

由于质谱技术的灵敏度不断提高，即使在亲和纯化-质谱（AP-MS）样品中存在极微量的非特异性互作蛋白和污染物，也能够被检测到。本文提出的方法可能有助于区分真实的互作蛋白与背景污染，其原理是关注那些迁移峰与诱饵蛋白迁移峰在高于单体蛋白的分子量处重合的蛋白质。

多个研究团队已采用分级分离技术，结合蛋白质相关性分析，以在细胞尺度上界定蛋白质复合物，而无需预先进行分离10,11,12,34。然而，这种方法可能无法检测到亚化学计量比的相互作用。通过亲和纯化引入富集步骤有助于克服这一局限性。本文所述方法可广泛用于探索蛋白质复合物的拓扑结构，并解析特定蛋白质在相同细胞环境中参与的多种复合物。该策略简便易行，适用于那些可能不具备昂贵色谱分级设备以分离蛋白质复合物的实验室。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由惠康信托基金（WT098051）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Protein G DynabeadsLife Technologies10003D
FLAG 抗体 M2Sigma-AldrichF1804
Tween-20，蛋白质级，10% 溶液Millipore655206
戊二酰亚胺二甲酯Sigma-Aldrich80490
0.2 M 三乙醇胺缓冲液，pH 8.2Sigma-AldrichT0449
3x FLAG 肽Sigma-AldrichF4799
Vivaspin 5K NMWCO，PESSartoriusVS0112
NativePAGE 3-12% Bis-Tris 凝胶Life TechnologiesBN1001
20x NativePAGE 运行缓冲液Life TechnologiesBN2001
20x NativePAGE 阴极添加剂Life TechnologiesBN2002
4x NativePAGE 上样缓冲液Life TechnologiesBN2003
NativeMARKLife TechnologiesLC0725
NativePAGE 5% G-250 样品添加剂 Life TechnologiesBN2004
Nunc 圆底 96 孔板，聚丙烯材质Thermo249944
Multiscreen HTS 96 孔过滤系统ThermoMSDVN6550
Nunc 96 孔透明盖Thermo276002
TCEP（三(2-羧乙基)膦盐酸盐）Sigma-Aldrich646547
碘乙酰胺Sigma-AldrichI1149
乙腈，HPLC 级Fisher ScientificA/0627/17
胰蛋白酶，测序级Roche11418475001
MaxQuant（软件）N.A.N.A.http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant
Perseus（软件）N.A.N.A.http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus

参考文献

  1. Goudreault, M., et al. A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein. Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).
  2. Leitner, A., et al. Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics. Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).
  3. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
  4. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).
  5. Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. Mass spectrometry supported determination of protein complex structure. Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).
  6. Kaake, R. M., et al. A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).
  7. Kao, A., et al. Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes. Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).
  8. Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes. Methods. 61 (2), 98-104 (2013).
  9. Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase. J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).
  10. Havugimana, P. C., et al. A census of human soluble protein complexes. Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).
  11. Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).
  12. Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome. Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).
  13. Liu, F., Heck, A. J. Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry. Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).
  14. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  15. Heide, H., et al. Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex. Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).
  16. Wessels, H. J., et al. Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling. PLoS One. 8 (7), 68340(2013).
  17. Wessels, H. J., et al. LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes. Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).
  18. Remmerie, N., et al. Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods. J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).
  19. Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry. Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).
  20. Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells. Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).
  21. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  22. Cox, J., et al. A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics. Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).
  23. Kim, J. J., et al. A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells. J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).
  24. Lauberth, S. M., Rauchman, M. A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex. J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).
  25. Miller, A., et al. Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex. Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).
  26. Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases. J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).
  27. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  28. Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics. Nucleic Acids Res. 41 (1), 28(2013).
  29. Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners. J Proteomics. 100, 55-59 (2014).
  30. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  31. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  32. Schagger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).
  33. Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach. Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).
  34. Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry. Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).

重印与许可

标签

通过蓝色天然PAGE和蛋白质相关性分析解析亲和纯化蛋白质复合物
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。