解决由蓝变性PAGE和蛋白质相关剖析亲和纯化的蛋白复合物
2017年4月1日
这里，我们提出使用无标记的定量质谱法对蛋白复合物的亲和纯化和由蓝色天然PAGE它们的分离协议，其次是蛋白相关性分析。这种方法是非常有用的解决相互作用组分成不同的蛋白复合物。
该实验策略的总体目标是通过蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳、亲和纯化蛋白质复合物的分级分离和质谱相关性分析来解析蛋白质可能参与的不同功能组装。该方法有助于将组织信息添加到亲和纯化质谱实验生成的蛋白质列表中。该程序的主要优点是作简单，分辨率好，并且比传统的凝胶 CMSMS 需要更多的工作。
该方案针对纯化 200 至 5 亿个表达 FLAG 标记蛋白内源水平的细胞中的蛋白质复合物进行了优化。如文本方案中所述，解冻细胞沉淀后，向细胞悬液中加入 5 毫升含有 DTT 和蛋白酶抑制剂的冰冷裂解缓冲液，然后旋转混合。将悬浮液在冰上孵育 10 分钟。
将细胞悬液转移到冷下均质器中。使用紧杵以 20 至 30 次冲程裂解细胞，直到没有明显的粘度，然后将匀浆转移到冷的微量离心管中。离心试管后，将澄清的裂解物转移到干净的冷管中，留下大约 50 μL 的裂解物。
保存 35 微升等分试样的裂解物以测量蛋白质浓度并监测纯化。接下来，从先前制备的珠子中取出缓冲液。用 1 毫升裂解物重悬磁珠，然后与其余裂解物混合。
将混合物在 4 摄氏度的旋转轮上孵育 1 到 2 小时。用磁铁收集管侧面的珠子。收集 30 微升等分试样的上清液，并丢弃其余部分。
通过移液 4 到 6 次，将珠子重悬于 0.5 mL IPP150 缓冲液中。然后，将悬浮液转移到 1.5 毫升冷管中。接下来，用 0.5 mL FLAG 洗脱天然缓冲液洗涤珠子 3 次。
最后一次洗涤后，将珠子转移到新的冷管中。彻底去除缓冲液。在天然洗脱缓冲液中，将微珠重悬于 100 μL 200 μg/mL 3X5 肽中。
然后，在 4 摄氏度下轻轻旋转孵育 10 分钟。用磁铁收集珠子，并将上清液转移到冷的新管中。在拉出所有洗脱液之前，重复此步骤两次。
在 4 摄氏度下以 10， 000 倍 G 离心，将洗脱液浓缩至 25 μL。向 25 μL 浓洗脱液中加入 4X 天然样品上样缓冲液和 0.5%G-250 样品添加剂，制备样品。加载样品和非变性分子量标准品，在它们之间留一个空孔。
然后，在所有空孔中上样 10 至 20 μL 1X 天然样品上样缓冲液。小心地用 200 mL 1X 非变性 PAGE 深蓝色阴极缓冲液填充阴极室，以免干扰样品。用 550 mL 1X 天然 PAGE 阳极缓冲液填充阳极室。
在 150 伏特下运行凝胶 30 分钟。停止运行后，用血清移液管去除深蓝色阴极缓冲液，并替换为 1X 浅蓝色阴极缓冲液。继续电泳 60 分钟后，打开凝胶盒并丢弃其中一个凝胶盒板。
凝胶仍附着在另一个凝胶盒板上。将凝胶放入装有足够固定液的托盘中，轻轻摇动孵育 30 分钟。然后，去除固定液并用水更换，然后再扫描凝胶。
为了准备质谱分析，首先将锥形底部 96 孔板放在另一个 96 孔板的顶部以收集废液。用 96 号针刺穿锥形底部 21 孔板的孔底部。然后，向穿孔板的孔中加入 200 微升 50% 乙腈、0.25% 甲酸。
将板组在摇床中孵育 10 分钟。接下来，将板以 500 倍 G 离心 1 分钟，使液体通过孔流入废液收集板。重复洗涤步骤两次后，用 150 微升 50 毫摩尔碳酸氢铵填充穿孔的 96 孔板的孔。
接下来，将凝胶放在干净的表面上。将包含样品的泳道切成 48 个相同的切片。将每片切成两到三小块，除了凝胶顶部的最后五片。
将每个切片依次放入经过洗涤的 96 孔板的刺穿端的一个孔中。向每个孔中加入 50 μL 乙腈，并在振荡下孵育板 30 至 60 分钟。离心除去液体后，向每个孔中加入 200 微升 2 毫米 TSEB 和 50 毫摩尔碳酸氢铵。
在室温下振荡孵育板 30 分钟，然后像以前一样通过离心去除液体。加入 200 μL 纯乙腈使凝胶块脱水，并在室温下振荡孵育 20 分钟，直到凝胶块呈白色和不透明。去除乙腈后，向每个孔中加入 150 μL 胰蛋白酶的冷碳酸氢铵溶液。
将板在 37 摄氏度下振荡孵育 2 小时。接下来，在含凝胶板下方放置一个干净的锥形底板，确保板的方向正确。然后，以 200 倍 G 离心 1 分钟，收集含有肽的液体。
将含有肽的板放入离心蒸发器中，并在执行下一步时蒸发液体。向凝胶块中加入 150 微升 50% 乙腈、0.25% 甲酸。在 37 摄氏度下振荡孵育 30 分钟。
将液体收集到部分干燥的板中，以 200 倍 G 离心 1 分钟。继续蒸发含有肽的板，同时执行下一步。将肽溶液转移到清洗过的离心过滤板上。
在其下方放置一个干净的锥形底板以收集肽并像以前一样离心板组。蒸发锥形底板中的液体，直到孔完全干燥。干燥后，可以用硅胶盖盖板并储存在零下 20 摄氏度，直到按照文本方案中的说明进行质谱和数据分析。
Mta2 和共纯化蛋白的蓝色天然 PAGE 迁移曲线的分层聚类的代表性结果在此处显示为树状图和代表蛋白质强度的热图。Mta2 的迁移曲线显示两个峰，指示两个不同的复合物。一些 NuRD 亚基显示出类似的模式，在较低分子量组装体中丰度最高。
相比之下，其他 NuRD 亚基在较高分子量的 NuRD 组装中更丰富。另一方面，Mta2 相互作用物 Cdk2ap1 仅存在于较高分子量的 NuRD 组装体中。一旦掌握，这项技术可以在两天半内完成。
在尝试此程序时，请务必记住将所有样品和试剂保存在冰上，以避免蛋白质复合物解离。该程序可应用于任何感兴趣的蛋白质，前提是可以在天然条件下通过竞争性洗脱从亲和培养基中观察它。按照此程序，可以执行其他方法（如反向或序贯免疫共沉淀）来验证已鉴定的亚复合物。
概述
本文介绍了用于蛋白质复合物亲和纯化，然后进行蓝色本态PAGE和质谱分析的协议。该方法有效地将相互作用组分解为不同的蛋白质复合物。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 蛋白质组学
背景
- 亲和纯化对于研究蛋白质相互作用至关重要。
- 蓝色本态PAGE允许分离蛋白质复合物。
- 质谱分析提供蛋白质的定量分析。
- 该方法增强了对蛋白质功能和相互作用的理解。
研究目的
- 开发蛋白质复合物纯化的简化协议。
- 提高蛋白质相互作用数据的分辨率和组织。
- 便于分析来自大量细胞群体的蛋白质复合物。
使用的方法
- 从细胞裂解物中通过FLAG标签对蛋白质进行亲和纯化。
- 使用蓝色本态PAGE分离蛋白质复合物。
- 使用无标记定量质谱分析进行蛋白质相关性分析。
- 针对从2亿至5亿个细胞的纯化进行优化。
主要结果
- 成功分辨出不同的蛋白质复合物。
- 通过质谱分析获得高质量数据。
- 协议展示了简单性和良好的分辨率。
- 增强了对蛋白质相互作用和功能的理解。
结论
- 开发的协议对于研究蛋白质复合物是有效的。
- 它为质谱分析提供了可靠的方法。
- 这种方法可以对蛋白质组学研究做出重大贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
Resolving protein complex topology enhances target validation by revealing functional assemblies beyond binary interactions. This method supports mechanistic de-risking in early discovery by distinguishing distinct complexes that may drive divergent signaling outcomes. It enables predictive confidence in target selection by linking interactome data to structural organization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by resolving whether a bait protein engages distinct functional complexes under native conditions.
- Operational Value: Adds organizational dimension to AP-MS data without requiring extensive re-engineering of existing workflows.
- Predictive Value: Enables discrimination between transient scaffolding interactions and stable effector complexes for target prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitatively resolvable complex migration profiles suitable for correlation-based profiling in screening cascades.
- Reproducibility: Blue native PAGE separation provides consistent electrophoretic behavior across replicates, supporting assay standardization.
- Scalability: Compatible with 200–500 million cell inputs, aligning with industrial-scale cell culture outputs for target validation campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Resolved complexes can be tracked across models to assess disease-relevant assembly shifts, supporting biomarker alignment.
- Mechanistic De-risking: Distinguishing complex isoforms reduces risk of misattributing phenotypic effects to incorrect interaction partners.
- Preclinical Modeling: Enables validation of complex-specific perturbations in disease models where subunit composition influences therapeutic response.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates affinity purification with orthogonal separation to enrich discovery-stage interactome maps with structural context before lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by resolving whether observed interactions occur within discrete molecular entities rather than promiscuous associations.
- Screening: Enables assay development based on complex-specific migration shifts as quantitative readouts for compound-induced remodeling.
- Analytics: Correlation profiling generates quantitative migration profiles that allow bioinformatic assignment of proteins to distinct complexes.
- Translational Research: Facilitates continuity from complex resolution to preclinical validation by preserving native-state organization.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform for complex topology analysis applicable across multiple targets and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in interactome data by assigning proteins to specific complex assemblies.
- Operational Value: Leverages existing AP-MS infrastructure with minimal added steps, improving throughput without major retooling.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing whether target engagement occurs in disease-relevant versus incidental complexes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on complex-specific functional evidence rather than interaction counts alone.
Implementation Considerations
- Requires expertise in native protein complex handling and blue native PAGE optimization.
- Dependent on access to high-resolution electrophoresis systems and quantitative mass spectrometry platforms.
- Necessitates standardized protocols for complex preservation during lysis and purification to avoid artifactual dissociation.
- Involves adaptation considerations for varying complex stability, detergent sensitivity, and epitope accessibility across target classes.
- Practical limitation: Resolution depends on complex mass differences; near-identical assemblies may require complementary methods.
