本文介绍了一种对传统电压钳荧光法（VCF）的改进，该方法使用荧光非天然氨基酸（fUAA）替代马来酰亚胺染料，以探测离子通道中的结构重排。实验流程包括Xenopus卵母细胞的DNA显微注射、RNA与fUAA的共注射，以及电流和荧光信号的同步测量。
本文内容
摘要
摘要
电压钳荧光法（Voltage-Clamp Fluorometry, VCF）一直是研究生电性膜蛋白结构与功能的首选技术，该方法可同时实时测量荧光信号和电流，分别反映蛋白的局部构象变化和整体功能1。尽管高分辨率结构技术（如冷冻电子显微镜或X射线晶体学）能够提供目标蛋白的静态结构图像，VCF则能提供动态结构信息，使我们能够将结构重排（荧光）与动态功能数据（电生理学）关联起来。直到最近，蛋白质位点特异性荧光标记所依赖的巯基反应化学仍限制了该方法的应用范围，因为所有可接近的半胱氨酸（包括内源性半胱氨酸）都会被标记，因此必须构建不含内源性半胱氨酸的蛋白。此外，标记仅限于细胞外侧可接近的位点。这一局限性随着荧光非天然氨基酸（Fluorescent Unnatural Amino Acids, fUAA）的应用而得到改变：通过正交tRNA和氨酰-tRNA合成酶配对介导的终止密码子抑制，可将小型荧光探针特异性地插入目标蛋白中2。VCF技术的这一改进仅需两步注射操作：首先注射DNA（编码tRNA/合成酶配对），随后共注射RNA与fUAA。如今，不仅可标记细胞内位点，还可标记埋藏于蛋白内部的位点，VCF的应用范围因此显著扩展。该技术因而对研究多种多样的蛋白质——更重要的是，对探究众多胞质调控机制——变得极具吸引力。
引言
已有超过200种具有不同化学和物理性质的非天然氨基酸被通过遗传学方法整合到大肠杆菌（E. coli）、酵母和哺乳动物细胞的蛋白质中3。这些非天然氨基酸通过正交工程化的tRNA/合成酶对，响应特定的终止密码子而被引入蛋白质。这种通过遗传学手段修饰蛋白质的方法，为研究蛋白质的结构与功能提供了重要的见解。本文中，我们介绍了一种将电压钳荧光法（Voltage-Clamp Fluorometry, VCF）与荧光非天然氨基酸（UAA）相结合的实验方案。
在VCF中，通过同时观测功能数据和荧光探针周围（约5 Å）的结构重排，可以获得毫秒级分辨率的动态信息1。当蛋白质发生局部运动时，荧光探针的猝灭状态会随之改变。仅1–2 Å的位移就足以引起荧光强度的显著变化4。在确定目标蛋白中的感兴趣位点后，通过定点突变对该位点进行突变。传统上，该残基被突变为半胱氨酸；而现在则引入琥珀终止密码子（TAG），以实现遗传编码非天然氨基酸（fUAA）的插入。随后，该蛋白进行in vitro转录。
虽然其他表达系统（例如， 哺乳动物细胞）可用于5,6,7, 非洲爪蟾 卵母细胞因其体积较大，更适用于结构-功能研究，可实现更简便的操作以及更高的荧光强度（含更多荧光基团），从而获得更优的信噪比。此外， 非洲爪蟾 卵母细胞中内源性蛋白的背景信号较低2,8，且动物极的深色色素可屏蔽细胞质荧光背景。 非洲爪蟾 卵母细胞通过手术取出后，将编码正交tRNA/tRNA合成酶对（特异性识别fUAA）的DNA注入卵母细胞核内。经过6–24小时孵育后，将目标蛋白的RNA与fUAA共同注射到卵母细胞的细胞质中，随后继续孵育2–3天。为防止fUAA受到损伤（如光漂白），所有涉及Anap的操作均需在红光条件下进行，以避免荧光团被激发。
采用切开式卵母细胞电压钳装置对卵母细胞进行研究，该装置安装在直立式荧光显微镜上，可同时记录电生理电流和荧光信号的变化9,10。也可选用双电极电压钳1或膜片钳配置11。荧光激发使用适当波长的光源，具有较低的均方根噪声，发射光信号通过连接至高增益放大器的光电二极管进行记录。
使用荧光非天然氨基酸（fUAAs）进行电压钳荧光测定具有多项优势。其一是能够获取膜蛋白胞质侧的信息；许多调控过程均位于此处（例如， 钙2+- 或核苷酸结合位点、电压门控离子通道的快速闭合态失活、孔道开放、模块耦合）。所有这些过程现在均可进行荧光标记。
另一个优势是探针体积较小，因而对蛋白质的干扰更小。迄今为止，已有两种用于编码非天然氨基酸（fUAA）的正交tRNA/tRNA合成酶对被成功构建12,13，其中仅3-(6-乙酰萘-2-氨基)-2-氨基丙酸（Anap）被应用于爪蟾（Xenopus）卵母细胞的研究中2,8。Anap是一种环境敏感型荧光探针，分子量为272.3 g/mol，体积仅略大于色氨酸12（图1A、1B）。由于其分子尺寸较小，与通常通过连接臂偶联的传统荧光探针（分子量通常超过500 g/mol）相比，Anap引入的空间位阻效应更小。此外，Anap的荧光基团位置比连接在半胱氨酸上的探针更靠近蛋白质主链，因此能够探测到更局部的构象变化。最后，在传统的电压钳荧光检测技术（VCF）中，为确保位点特异性标记，通常需要去除内源性半胱氨酸；而在非天然氨基酸介导的VCF（UAA-VCF）中这一要求不再必要，因此（i）可使蛋白质保持在（几乎）天然状态，（ii）使得VCF技术能够应用于更广泛蛋白质的研究，特别是那些功能会因半胱氨酸替换而发生改变的蛋白质。
图 1：Anap 及其荧光光谱。（A）Anap 的化学结构。（B）1 nM Anap 的归一化吸收光谱和发射光谱，显示 Anap 荧光对溶剂疏水性的敏感性。发射光谱通过在 350 nm 激发获得。请点击此处查看该图的放大版本。
使用荧光非天然氨基酸（UAA）的一个缺点是，当氨酰化tRNA数量不足时，可能会因终止密码子通读、翻译重新起始、C端截短蛋白或与内源性氨酰化过程发生串扰，导致产生蛋白质的异质性群体。此类渗漏表达应始终在不存在荧光非天然氨基酸（fUAA）以及tRNA/tRNA合成酶配对的情况下进行检测。我们此前已探讨过翻译重新起始的问题，并提出了针对N端插入位点的规避策略14。然而，当fUAA、tRNA和tRNA合成酶均以饱和量存在时，渗漏表达的概率极低。
fUAA-VCF 与传统 VCF 之间的关键操作差异在于卵母细胞的注射与处理；首先注射编码 tRNA 和 tRNA 合成酶的 DNA（pAnap），随后引入 Anap，Anap 可与蛋白 mRNA 共同注射，或以乙酰氧基甲基（AM）酯形式加入孵育溶液中。
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方案
青蛙操作遵循加拿大指南，并已获得蒙特利尔大学伦理委员会（CDEA，方案编号 #15-042）的批准。
1. 用于非天然氨基酸掺入的 mRNA 制备
- 选择蛋白质中预期会发生构象变化的感兴趣位点。在该区域选择一个氨基酸，用于替换为非天然氨基酸（fUAA）。
注意：位置的选择应基于预期的结构重排。若存在高分辨率结构及对预期运动的假设，则应将anap置于其化学环境会发生改变的位置；这种改变可能表现为介电常数的变化（疏水与亲水环境之间），但更可能是被其他氨基酸淬灭。最佳淬灭剂为色氨酸（Trp）。anap应在一种状态下与淬灭剂接触（范德华半径重叠），而在另一种状态下则无接触。若缺乏高分辨率结构或模型，则需对目标区域进行扫描。无论何种情况，建议选择多个邻近位点，以提高获得表达和荧光信号的概率。为尽量减少在蛋白质成熟和/或功能过程中可能产生的空间位阻效应，可考虑替换较大的芳香族氨基酸（Phe、Trp、Tyr）。然而，作者经验表明，无论被替换的氨基酸种类如何，对目标区域系统性扫描以插入fUAA通常更具成效。 - 使用定点突变在选定位置插入一个琥珀色终止密码子（TAG）15确保目标蛋白的终止密码子不是琥珀终止密码子（TAG）。如果是，应将其突变为其他终止密码子（赭石或乳白终止密码子）。扩增、分离并测序该DNA。获取蛋白的mRNA 体外 转录16 并将 mRNA 储存于 20 °C 或 80 °C.
2. 卵母细胞准备与显微注射
- 从 Xenopus laevis 青蛙中手术获取 V 或 VI 期卵母细胞，并按先前所述方法用胶原酶去滤泡17。
- 根据批准的动物实验方案使用适当的麻醉剂对青蛙进行麻醉（此处使用：3-氨基苯甲酸乙酯）。当其脚趾尖受到轻捏时不再出现回缩反射（即失去回缩反射），则表明已达到适合手术的麻醉深度。
- 立即将青蛙从麻醉液中取出，并用新鲜水彻底冲洗其皮肤。此冲洗步骤可清除皮肤表面未吸收的化学物质，防止动物进入更深的麻醉状态。
- 通过手术切除一侧卵巢组织块，用两把镊子小心打开组织块。将卵母细胞置于含1% (w/v) 胶原酶的“标准卵母细胞溶液”（SOS）中孵育并振荡20–30分钟以去除滤泡细胞。随后用SOS溶液洗涤三次。
- 单独挑选出体积大且健康的卵母细胞，转移至含有抗生素（100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素、10 mg/100 mL 卡那霉素）和5% 马血清的Barth溶液中，在18 ͦC 下孵育至少4小时，再进行注射。
注：在间隔4个月进行2至4次手术后，通过长时间（>1小时）孵育于3-氨基苯甲酸乙酯溶液中对 Xenopus laevis 实施安乐死。
- 为进行DNA的核内注射，需制备细长的注射针头，以便能够到达细胞核并避免损伤卵母细胞。用油填充注射针头，并将其安装到纳米注射仪设备上。
- 将纳米注射仪置于体视显微镜下，使用镊子折断针尖末端。推出油液直至针尖内部无残留气泡。
- 在解剖显微镜下，将1 µL含NaOH（1%的1 N NaOH）的无核酸酶水中溶解的0.1 µg/µL pAnap滴加于一片Parafilm膜上，并用该DNA溶液填充注射针头。
- 将40个卵母细胞转移至底部覆盖尼龙网的注射培养皿中，培养皿内盛有添加了抗生素的Barth溶液。
注：制备网状涂层注射培养皿时，裁剪适当大小的800 µm尼龙网以覆盖聚苯乙烯培养皿。在培养皿中央加入氯仿，然后将尼龙网平铺其上。保持网片平整直至塑料固化。 - 由于卵母细胞的细胞核位于动物极（深色一端），应将注射针头对准动物极中心刺入，深度达到动物半球中心附近（约为RNA注射深度的2–3倍）。向每个卵母细胞的细胞核内注射9.2 nL的pAnap。由于针头较细且注射体积小，可能出现注射不规则或针头堵塞现象。可定期通过向空气中注射来检查注射是否正常。
注：DNA是否准确注入细胞核尚不确定。因此，预计有10–40%的卵母细胞无法表达tRNA/合成酶配对。详见讨论部分的进一步说明。
图 2：将 DNA 和 RNA 注射到 Xenopus 卵母细胞以实现 Anap 掺入的示意图。
首先，将 pAnap 注射到 Xenopus 卵母细胞的细胞核中（1）。6–24 小时后，将 Anap 与通道 RNA 共同注射到植物极（2）。Anap 会被由 pAnap 编码的氨酰-tRNA 合成酶特异性地与带有琥珀终止密码子反密码子的 tRNA 进行正交氨酰化。这样，氨酰化的 Anap-tRNA 可在核糖体上被识别，并在通道 RNA 中插入的琥珀终止密码子处实现终止密码子的抑制，从而将 Anap 掺入蛋白质中。请点击此处查看该图的放大版本。
- 将卵母细胞在含有抗生素和5%马血清（HS）的2 mL Barth溶液中于18 °C孵育6–24小时，以实现Anap特异性tRNA及tRNA合成酶的高效表达。
注意：DNA孵育时间可在RNA注射前持续数天，但不会提高表达水平。 - 准备用于RNA注射的纳米注射仪（步骤同2.2，但注射针尖无需像DNA注射时那样细）。从此步骤开始仅在红光下操作，以防止Anap发生光漂白。
- 在一片Parafilm上直接混合1 µL 1 mM Anap与1 µL 1–2 µg/µL mRNA，并用该混合溶液填充注射针尖。在植物极（明亮端）膜下方稍作穿刺，向每个注射了pAnap的卵母细胞中注入46 nL溶液。
注意：所需mRNA浓度取决于目标蛋白。 - 将卵母细胞置于盒子中或用铝箔包裹以避光，在添加了抗生素和5%马血清的Barth溶液中于18 °C孵育2–3天。每天更换新鲜的Barth溶液，并移除死亡的卵母细胞以避免污染。
3. VCF 设置
- 安装切开式卵母细胞电压钳设备，方法如前所述18.
- 将电生理记录系统安装在直立式荧光显微镜上，通过将记录室置于滑轨上，使其可在用于放置卵母细胞的标准体视显微镜和用于进行荧光检测的显微镜之间移动（图 2c).
注意：切开式卵母细胞所用腔室的几何结构不适合在操作过程中使用常规透射光照明。因此，需采用带红色滤光片的“鹅颈”卤素灯从上方侧面进行照明。可将显微镜的聚光镜移除，以便降低载物台，为电生理记录腔室腾出空间。 - 将光电二极管检测系统连接至荧光显微镜的C型接口输出端图2a将光电流读出信号连接至数字信号处理器（DSP，模拟/数字-数字/模拟转换器）的第二个输入通道。
- 使用100 W、12 V的卤素灯作为荧光激发的光源。
注意：也可使用汞灯，但必须降低其强度，以防止记录过程中荧光过快淬灭。仅当相应LED在激发波长范围内具有显著强度时，才推荐使用LED照明例如， 约350 nm（Anap）。大多数白光LED无法深入紫外光谱范围。 - 在激发光源与显微镜之间插入一个电控快门，并将其控制信号（通常为TTL脉冲）连接至DSP的数字输出端。在记录软件中设置TTL脉冲的时间（参见制造商文档），使快门在记录开始前约100毫秒打开。这样可确保快门开启过程中产生的任何振动不会干扰记录过程。具体时间取决于快门的速度与振动特性。如图所示，在记录结束前5毫秒终止脉冲。 图4这样，总荧光值也被记录下来。
- 在滤光片转轮中插入合适的滤光片组（包括激发滤光片、二向色镜和发射滤光片）。对于Anap，使用以下参数：激发光滤光片：377/50 nm带通，二向色镜：409 nm长通，发射光滤光片：470/40 nm带通。
图 3：VCF 装置示意图。（A）VCF 装置的侧视图，显示显微镜内部的光路。滤光镜组包含激发滤光片、二向色镜和发射滤光片。（B）选定的卵母细胞记录室尺寸：上室半径为 3.4 cm（1），底室长度为 5.5 cm（2），底室宽度为 1.4 cm（3），中室宽度为 1.7 cm（4）。（C）VCF 装置的前视图。左侧第一个目镜用于将卵母细胞安装在切开式电压钳记录室中并进行透化处理。随后，将记录室滑动至右侧第二个目镜下方的显微镜位置。在此处，使用 4X 物镜插入 V1 电极，并使用水浸 40X 物镜记录荧光信号。请点击此处查看该图的放大版本。
4. VCF 记录
- 按照先前所述并已图示的切开式卵母细胞电压钳制备步骤进行操作18（琼脂桥制备、卵母细胞固定、皂苷透化）。然而，全程需在红光下操作，以避免记录前荧光染料被漂白。放置卵母细胞时，确保动物极朝上。动物极膜下的色素可屏蔽来自细胞质的自发荧光，从而降低背景荧光。
- 将记录室移至显微镜下，使用4X物镜进行聚焦。
- 用电压感应电极V1（3 M KCl）刺入卵母细胞，切换至40X水浸物镜（NA 0.8 - 0.9），聚焦于朝上的动物极。
- 关闭红光。通过旋转滤光立方体转盘及连接至光电二极管的光学出口端口，选择合适的滤光立方体。将卤素灯调至最高强度，并短暂打开快门2-5秒，读取来自卵母细胞的背景荧光强度。在所述实验装置中，Anap的背景信号值应约为50-200 pA。
- 开启钳制，将浴液/保护电极开关拨至激活状态，并通过调节I端放大器上的旋钮，将膜电位（V1 - V2）调整至指令电位。
- 在记录软件中设置钳制电位、阶跃脉冲方案、脉冲次数与持续时间等参数，记录电压依赖性电流及Anap荧光强度。
5. 双色VCF
- 为了同时监测同一蛋白质中的两个位点，将一个细胞外且可及的氨基酸突变为半胱氨酸，并去除其他半胱氨酸，以确保通过巯基化学实现特异性标记。
- 执行步骤 2.1–2.5。
- 在进行 VCF 记录之前，将卵母细胞在含 5 µM TMR-马来酰亚胺的标记溶液中孵育 15 分钟（或使用与 Anap 光谱不重叠的其他染料）。
- 用标记溶液清洗卵母细胞三次，以去除过量染料。
- 执行步骤 4.1–4.6。
- 在滤光片转轮中插入适用于 TMR 的滤光片组（激发滤光片、二向色镜和发射滤光片）。通过旋转滤光片转轮切换至 TMR 滤光片组。
- 按照步骤 4.4 中对 Anap 的描述，读取 TMR 的背景荧光。
注意：巯基化学标记会导致膜内非特异性标记，从而产生较高的背景荧光。因此，TMR 的背景荧光可能会使放大器饱和（>2,000 pA）。在此情况下，不要降低光照强度，而应通过向光电二极管添加偏移电流来扣除背景荧光。在商用系统中，使用检测器系统的“采样-保持”功能。记录背景荧光值（使用 10X 中性密度滤光片）于实验记录本中，因为该值将不会被正常记录（已饱和）。 - 如同步骤 4.6 所述，同时记录电压依赖性电流和 TMR 荧光强度。
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结果
图4展示了从表达去除快速失活（IR）的Shaker通道（L382stop-W434F突变）的卵母细胞中获得的VCF记录示例，该细胞在pAnap和Anap存在下进行实验。W434F突变阻断了钾离子电流，从而可以测量瞬态门控电荷位移（门控电流）。在去极化过程中同时记录到的门控电流（上迹线）和Anap荧光强度变化（下迹线）表明Anap已成功掺入至L382位点。在此位置，Anap位于每个S4跨膜螺旋的底部（L382），而S4螺旋在通道激活过程中发生移动，因此Anap可报告细胞内局部构象重排。荧光变化可能由溶剂弛豫（环境极性变化）和/或邻近氨基酸的淬灭作用引起4。这两种机制均源于蛋白质相对构象的重排。
图5展示了使用步进方案从同一个卵母细胞获得的Anap和TMR荧光信号。通过在L382stop-W434F背景下引入A359C突变，并用TMR-马来酰...
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讨论
该 体内 tRNA与其合成酶持续共转录，同时进行tRNA的氨酰化，从而实现荧光检测所需的高水平表达。为有效掺入非天然氨基酸fUAA，将pAnap准确注射至细胞核至关重要。由于细胞核的确切位置存在不确定性，预计10–40%的DNA注射会失败，导致卵母细胞不表达（或渗漏表达）。因此，必须在无Anap和pAnap的条件下检测表达情况，以识别渗漏通道的存在及其电流表型和幅值。通过这种方式，可区分DNA注射成功（高表达、Anap诱导的荧光变化dF、全长电流表型）与失败的卵母细胞（无或低表达、无Anap dF、若有电流则呈截短型表型）。若出现Anap存在时突然无表达的情况，应重新配制Anap分装液，因Anap在水溶液中长期不稳定（保存期最长一年）。
将fUAAs与VCF结合使用受到荧光团选择的限制，因为每种新的fUAA都需要设计出正交的tRNA/tRNA合成酶对。迄今为止，仅有Anap作为一种功能性fUAA可用于报告卵母细胞中蛋白质的动态变化。为检测Anap荧光信号的变化，需要实现较高的蛋白表达水平，我们估计最低蛋白密度需达到2 - 4000 µm⁻²。-
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
pAnap由斯克里普斯研究所的Peter Schultz博士惠赠。本工作由加拿大卫生研究院基金MOP-102689和MOP-136894（授予R.B.）以及加拿大创新基金会基金950-225005资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 溶液 | |||
| Barth 溶液 | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | 90 mM |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | 3 mM |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-9397 | 0.82 mM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C-7902 | 0.41 mM |
| Ca(NO3)2 | Sigma-Aldrich | C-1396 | 0.33 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5 mM |
| NaOH 水合物 | BDH | BDH7225-4 | pH 7.6 |
| 青霉素 | Invitrogen | 15140122 | 100 U/mL |
| 链霉素 | Invitrogen | 15140122 | 100 µg/mL |
| 卡那霉素 | Invitrogen | 15160054 | 10 mg/100mL |
| 马血清 (HS) | Invitrogen | 16050122 | 5% |
| SOS 标准卵母细胞溶液 | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | 102 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | 3 mM |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | 1 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5 mM |
| 外部记录溶液 | |||
| N-甲基-D-葡糖胺 (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10 mM |
| 氢氧化钙 | Sigma-Aldrich | 239232 | 2 mM |
| MES 水合物 | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| 内部记录溶液 | |||
| N-甲基-D-葡糖胺 (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10 mM |
| 乙二胺四乙酸 (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | 2 mM |
| MES 水合物 | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| 标记溶液 | |||
| KOH | Fisher Scientific | P250-1 | 115 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10 mM |
| 氢氧化钙 | Sigma-Aldrich | 239232 | 2 mM |
| MES 水合物 | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| TMR 储存液 | |||
| 四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺 (TMR) | Molcular Probes by Life Technologies | T6027 | 5 mM 溶于 DMSO |
| Anap 储存液 | |||
| Anap | ABZENA (TCRS) | 定制合成 TCRS-170 | 1 mM 溶于无核酸酶水并含 1% 1 N NaOH |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 材料/设备 | |||
| pAnap | Addgene | 48696 | |
| 高性能卵母细胞钳 | Dagan Corporation | CA-1B | |
| Gpatch 采集软件 | 加利福尼亚大学洛杉矶分校麻醉学系 | ||
| 分析软件 | 加利福尼亚大学洛杉矶分校麻醉学系 | ||
| 记录室 | 定制加工 | ||
| 光电二极管检测系统 | Dagan Corporation | PhotoMax-200/PIN | |
| 电控快门驱动器 | UNIBLITZ | VCM-D1 |
参考文献
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