电压钳荧光法在 非洲爪蟾 利用荧光非天然氨基酸研究卵母细胞

摘要

本文介绍了一种对传统电压钳荧光法（VCF）的改进，该方法使用荧光非天然氨基酸（fUAA）替代马来酰亚胺染料，以探测离子通道中的结构重排。实验流程包括Xenopus卵母细胞的DNA显微注射、RNA与fUAA的共注射，以及电流和荧光信号的同步测量。

摘要

电压钳荧光法（Voltage-Clamp Fluorometry, VCF）一直是研究生电性膜蛋白结构与功能的首选技术，该方法可同时实时测量荧光信号和电流，分别反映蛋白的局部构象变化和整体功能¹。尽管高分辨率结构技术（如冷冻电子显微镜或X射线晶体学）能够提供目标蛋白的静态结构图像，VCF则能提供动态结构信息，使我们能够将结构重排（荧光）与动态功能数据（电生理学）关联起来。直到最近，蛋白质位点特异性荧光标记所依赖的巯基反应化学仍限制了该方法的应用范围，因为所有可接近的半胱氨酸（包括内源性半胱氨酸）都会被标记，因此必须构建不含内源性半胱氨酸的蛋白。此外，标记仅限于细胞外侧可接近的位点。这一局限性随着荧光非天然氨基酸（Fluorescent Unnatural Amino Acids, fUAA）的应用而得到改变：通过正交tRNA和氨酰-tRNA合成酶配对介导的终止密码子抑制，可将小型荧光探针特异性地插入目标蛋白中²。VCF技术的这一改进仅需两步注射操作：首先注射DNA（编码tRNA/合成酶配对），随后共注射RNA与fUAA。如今，不仅可标记细胞内位点，还可标记埋藏于蛋白内部的位点，VCF的应用范围因此显著扩展。该技术因而对研究多种多样的蛋白质——更重要的是，对探究众多胞质调控机制——变得极具吸引力。

引言

已有超过200种具有不同化学和物理性质的非天然氨基酸被通过遗传学方法整合到大肠杆菌（E. coli）、酵母和哺乳动物细胞的蛋白质中³。这些非天然氨基酸通过正交工程化的tRNA/合成酶对，响应特定的终止密码子而被引入蛋白质。这种通过遗传学手段修饰蛋白质的方法，为研究蛋白质的结构与功能提供了重要的见解。本文中，我们介绍了一种将电压钳荧光法（Voltage-Clamp Fluorometry, VCF）与荧光非天然氨基酸（UAA）相结合的实验方案。

在VCF中，通过同时观测功能数据和荧光探针周围（约5 Å）的结构重排，可以获得毫秒级分辨率的动态信息¹。当蛋白质发生局部运动时，荧光探针的猝灭状态会随之改变。仅1–2 Å的位移就足以引起荧光强度的显著变化⁴。在确定目标蛋白中的感兴趣位点后，通过定点突变对该位点进行突变。传统上，该残基被突变为半胱氨酸；而现在则引入琥珀终止密码子（TAG），以实现遗传编码非天然氨基酸（fUAA）的插入。随后，该蛋白进行in vitro转录。

虽然其他表达系统（例如， 哺乳动物细胞）可用于^5,6,....

方案

青蛙操作遵循加拿大指南，并已获得蒙特利尔大学伦理委员会（CDEA，方案编号 #15-042）的批准。

1. 用于非天然氨基酸掺入的 mRNA 制备

1. 选择蛋白质中预期会发生构象变化的感兴趣位点。在该区域选择一个氨基酸，用于替换为非天然氨基酸（fUAA）。
   注意：位置的选择应基于预期的结构重排。若存在高分辨率结构及对预期运动的假设，则应将anap置于其化学环境会发生改变的位置；这种改变可能表现为介电常数的变化（疏水与亲水环境之间），但更可能是被其他氨基酸淬灭。最佳淬灭剂为色氨酸（Trp）。anap应在一种状态下与淬灭剂接触（范德华半径重叠），而在另一种状态下则无接触。若缺乏高分辨率结构或模型，则需对目标区域进行扫描。无论何种情况，建议选择多个邻近位点，以提高获得表达和荧光信号的概率。为尽量减少在蛋白质成熟和/或功能过程中可能产生的空间位阻效应，可考虑替换较大的芳香族氨基酸（Phe、Trp、Tyr）。然而，作者经验表明，无论被替换的氨基酸种类如何，对目标区域系统性扫描以插入fUAA通常更具成效。
2. 使用定点突变在选定位置插入一个琥珀色终止密码子（TAG）¹⁵确保目标蛋白的终止密码子不是琥珀终止密码子（TAG）。如果是，应将其突变为其他终止密码子（赭石或乳白终止密码子）。扩增、分离并测序该DNA。获取蛋白的mRNA 体外 转录^16<....

结果

图4展示了从表达去除快速失活（IR）的Shaker通道（L382stop-W434F突变）的卵母细胞中获得的VCF记录示例，该细胞在pAnap和Anap存在下进行实验。W434F突变阻断了钾离子电流，从而可以测量瞬态门控电荷位移（门控电流）。在去极化过程中同时记录到的门控电流（上迹线）和Anap荧光强度变化（下迹线）表明Anap已成功掺入至L382位点。在此位置，Anap位于每个S4跨膜螺旋的底部（L382），而S4螺旋在通道激活过程中发生移动，因此Anap可报告细胞内局部构象重排。荧光变化可能由溶剂弛豫（环境极性变化）和/或邻近氨基酸的淬灭作用引起⁴。这两种机制均源于蛋白质相对构象的重排。

图5展示了使用步进方案从同一个卵母细胞获得的Anap和TMR荧光信号。通过在L382stop-W434F背景下引入A359C突变，并用TMR-马来酰.......

讨论

该 体内 tRNA与其合成酶持续共转录，同时进行tRNA的氨酰化，从而实现荧光检测所需的高水平表达。为有效掺入非天然氨基酸fUAA，将pAnap准确注射至细胞核至关重要。由于细胞核的确切位置存在不确定性，预计10–40%的DNA注射会失败，导致卵母细胞不表达（或渗漏表达）。因此，必须在无Anap和pAnap的条件下检测表达情况，以识别渗漏通道的存在及其电流表型和幅值。通过这种方式，可区分DNA注射成功（高表达、Anap诱导的荧光变化dF、全长电流表型）与失败的卵母细胞（无或低表达、无Anap dF、若有电流则呈截短型表型）。若出现Anap存在时突然无表达的情况，应重新配制Anap分装液，因Anap在水溶液中长期不稳定（保存期最长一年）。

将fUAAs与VCF结合使用受到荧光团选择的限制，因为每种新的fUAA都需要设计出正交的tRNA/tRNA合成酶对。迄今为止，仅有Anap作为一种功能性fUAA可用于报告卵母细胞中蛋白质的动态变化。为检测Anap荧光信号的变化，需要实现较高的蛋白表达水平，我们估计最低蛋白密度需达到2 - 4000 µm⁻²。^-

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
溶液
Barth 溶液
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	90 mM
KCl	Fisher Scientific	BP366-500	3 mM
MgSO4	Sigma-Aldrich	M-9397	0.82 mM
CaCl2	Sigma-Aldrich	C-7902	0.41 mM
Ca(NO3)2	Sigma-Aldrich	C-1396	0.33 mM
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	5 mM
NaOH 水合物	BDH	BDH7225-4	pH 7.6
青霉素	Invitrogen	15140122	100 U/mL
链霉素	Invitrogen	15140122	100 µg/mL
卡那霉素	Invitrogen	15160054	10 mg/100mL
马血清 (HS)	Invitrogen	16050122	5%
SOS 标准卵母细胞溶液
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	102 mM
KCl	Sigma-Aldrich	746436	3 mM
MgCl2	Sigma-Aldrich	M9272	1 mM
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	5 mM
外部记录溶液
N-甲基-D-葡糖胺 (NMDG)	Alfa Aesar	L14282	115 mM
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	10 mM
氢氧化钙	Sigma-Aldrich	239232	2 mM
MES 水合物	Sigma-Aldrich	258105	pH 7.2
内部记录溶液
N-甲基-D-葡糖胺 (NMDG)	Alfa Aesar	L14282	115 mM
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	10 mM
乙二胺四乙酸 (EDTA)	Fisher Scientific	E478-500	2 mM
MES 水合物	Sigma-Aldrich	258105	pH 7.2
标记溶液
KOH	Fisher Scientific	P250-1	115 mM
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	10 mM
氢氧化钙	Sigma-Aldrich	239232	2 mM
MES 水合物	Sigma-Aldrich	258105	pH 7.2
TMR 储存液
四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺 (TMR)	Molcular Probes by Life Technologies	T6027	5 mM 溶于 DMSO
Anap 储存液
Anap	ABZENA (TCRS)	定制合成 TCRS-170	1 mM 溶于无核酸酶水并含 1% 1 N NaOH
名称	公司	目录编号	备注
材料/设备
pAnap	Addgene	48696
高性能卵母细胞钳	Dagan Corporation	CA-1B
Gpatch 采集软件	加利福尼亚大学洛杉矶分校麻醉学系
分析软件	加利福尼亚大学洛杉矶分校麻醉学系
记录室	定制加工
光电二极管检测系统	Dagan Corporation	PhotoMax-200/PIN
电控快门驱动器	UNIBLITZ	VCM-D1