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方法文章

建立小鼠原代小脑颗粒神经元的神经元死亡与变性模型

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DOI：

10.3791/55871

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2017年11月6日

 ,  ,  , 
1Lady Davis Institute for Medical Research, Jewish General Hospital, 2Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 4Department of Oncology, Faculty of Medicine, McGill University

本文内容

摘要

本方案描述了一种从6-7日龄幼鼠中分离和培养原代小鼠大脑颗粒神经元（CGNs）的简单方法，可高效转导CGNs以进行功能缺失和功能获得研究，并利用同一培养模型模拟NMDA诱导的神经元兴奋性毒性、低钾诱导的细胞死亡、DNA损伤以及氧化应激。

摘要

小脑颗粒神经元（CGNs）是一种常用的神经元模型，在小脑中形成大量且均一的细胞群体。由于其出生后的发育特性、数量丰富且易于获取，CGNs 是研究多种神经元过程的理想模型，包括神经元发育、神经元迁移以及生理性神经元活动的刺激。此外，CGN 培养体系也是研究不同细胞死亡模式的优良模型，如兴奋性毒性及凋亡。在体外培养一周内，CGNs 即可表达 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体——一种具有多种重要功能的离子型谷氨酸受体，参与神经元健康与疾病过程。在啮齿类动物原代 CGN 培养中，联合使用低浓度 NMDA 与膜去极化可模拟生理性神经元活动的刺激，而高浓度 NMDA 则可用于模拟兴奋性毒性所致的神经元损伤。本文介绍从出生6天的幼鼠中分离与培养 CGNs 的方法，以及利用腺病毒和慢病毒对 CGNs 进行基因操作的技术。同时，我们还提供了优化后的实验方案，用于在这些神经元转导后诱导 NMDA 介导的兴奋性毒性、低钾诱导的凋亡、氧化应激及 DNA 损伤。

引言

小脑颗粒神经元（CGNs）在体外培养中已有充分表征，是研究神经元死亡与发育的常用模型 1,2,3,4,5,6小脑颗粒神经元培养中N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体的早期表达 体外 使其成为研究NMDA诱导信号传导的优选模型。通过NMDA激活这些受体并结合膜去极化，可模拟生理性神经元活动的刺激，从而推动了突触可塑性机制的研究。 7,8相反，通过NMDA配体过度激活这些受体可用于模拟兴奋性毒性，这是急性脑损伤和神经退行性疾病中神经元丢失的主要机制。 9一种诱导兴奋性毒性的机制是通过缺氧导致的ATP耗竭，这在急性神经元损伤中可见。这会引起膜去极化以及突触处谷氨酸释放水平升高。升高的谷氨酸过度刺激NMDA受体，导致细胞内钙离子过度 influx2+ 通过这些受体的内流，进而激活包括Ca在内的多条信号通路2+-激活的蛋白酶、磷脂酶和内切核酸酶，导致关键细胞成分的不受控降解及细胞死亡。此外，细胞内高浓度 Ca2+ 导致氧自由基的产生和线粒体损伤 10,11.

尽管NMDA诱导的神经元兴奋性毒性所导致的大多数神经元丢失是由于钙离子内流引起，并且不依赖于Bax/Bak，但仍不能排除该模型中存在其他细胞死亡机制。兴奋性毒性引起坏死样和凋亡样细胞死亡的表现，部分归因于细胞内Ca2+水平升高所导致的活性氧（ROS）生成以及DNA损伤12。DNA损伤通过凋亡机制引发神经元死亡，并与凋亡性细胞死亡的典型特征相关，例如染色质团块的形成和凋亡小体的出现。凋亡的启动由线粒体释放细胞色素c介导，并已被证明依赖于Bax/Bak的寡聚化13。Bax/Bak寡聚化促进线粒体外膜孔道的形成，导致细胞色素c释放以及促凋亡调节因子的激活，这一过程在轻度缺血性损伤中亦有观察到14。

由于大脑内源性抗氧化剂水平较低，同时神经元功能活动对氧气需求量大，因此活性氧（ROS）的生成在脑组织中是一个重要问题 15缺血事件发生时，一氧化氮合酶表达上调，产生一氧化氮并增加活性氧物质 14氧自由基浓度升高可导致DNA损伤，并间接引发能量耗竭。大量DNA双链断裂会激活聚ADP-核糖聚合酶-1（PARP-1），该酶是一种真核生物染色质结合蛋白，负责催化将ADP-核糖基团从NAD⁺转移至靶蛋白+，这一过程在DNA修复中至关重要 16然而，当氧化应激导致过度损伤时，PARP-1的激活会因大量消耗NAD而引起能量耗竭+，是通过氧化磷酸化产生ATP所必需的底物。最终，氧化应激将以Bax/Bak依赖的方式触发细胞凋亡，导致线粒体细胞色素c的释放，并已被证明可诱导小脑颗粒神经元（CGNs）中的线粒体重塑 17.

最后，通过改变小脑颗粒神经元（CGN）培养物中氯化钾（KCl）的浓度，可用于模拟低钾/去极化介导的细胞凋亡18,19,20。当暴露于低浓度K+时，CGN会发生明显的生理变化，导致线粒体呼吸和糖酵解均下降，这归因于细胞能量需求的降低21，同时核因子-κB（NFκB）水平也下降，而NFκB参与调控炎症反应和突触传递等活动22。该模型对于研究神经元发育过程中的细胞死亡尤为有意义。低K+环境更接近生理状态，并可引发神经元发育过程中典型的细胞死亡特征23。

总之，颗粒神经元（CGNs）为研究神经元死亡和变性的潜在分子机制提供了一个长期有效的模型。以下方案将介绍如何分离和培养CGNs，利用病毒表达或抑制特定的遗传通路，并通过不同机制诱导神经元死亡，以模拟神经元损伤和变性过程。

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方案

本方案基于先前已描述过的实验步骤的改进18,24,25,26,27。本方案已获得麦吉尔大学动物护理委员会的批准。

1. 实验准备

注意：以下贮存液可预先配制并保存至使用。

  1. 解剖液
    1. 将 3.62 g 氯化钠（NaCl）、0.2 g 氯化钾（KCl）、0.069 g 磷酸二氢钠（NaH2PO4 ∙ H2O）和 1.306 g D-(+)-葡萄糖溶于 500 mL 蒸馏水（H2O）中。然后向溶液中加入 12.5 mL HEPES 缓冲液、450 µL 酚红溶液和 20 mL 牛血清白蛋白（BSA）第 V 组分。用 1 N 氢氧化钠（NaOH）调节 pH 至 7.4。
    2. 使用 0.22 µm 滤器灭菌，并于 4 °C 保存。该溶液可稳定保存 1 至 10 天。
  2. 胰蛋白酶
    1. 将胰蛋白酶以 25 g/L 的浓度溶于 0.9% 氯化钠溶液中，配制储备液。将溶液于 -20 °C 保存。
  3. 胰蛋白酶抑制剂
    1. 将 1 g 鸡蛋清胰蛋白酶抑制剂溶于 100 mL 1 mM 盐酸（HCl）中，配制成浓度为 10 mg/mL 的储备液。将该溶液于 -20 °C 保存。
  4. 脱氧核糖核酸酶（DNase）
    1. 将 100 mg DNase 1 溶于 10 mL 无菌水中，配制成浓度为 10 mg/mL 的储备液。将溶液于 -20 °C 保存。
  5. MgSO4
    1. 将 6.02 g 硫酸镁（MgSO4）加入 50 mL 蒸馏水（H2O）中，配制成 1 M 储备液。将溶液于 4 °C 保存。
  6. CaCl2
    1. 将 0.735 g 氯化钙（CaCl2∙ 2H2O）溶于 50 mL 蒸馏水（H2O）中，配制成 100 mM 储备液。将溶液于 4 °C 保存。
  7. KCl
    1. 将 3.7275 g KCl 溶于 50 mL 蒸馏水（H2O）中，配制成 1 M 储备液。将溶液于 4 °C 保存。
  8. D-(+)-葡萄糖
    1. 将 1.802 g D-(+)-葡萄糖溶于 50 mL 蒸馏水（H2O）中，配制成 100 mM 储备液。将溶液于 4 °C 保存。
  9. 细胞培养基
    1. 按如下方法配制细胞培养基：向 45 mL 经滤膜灭菌并补充了 1.125 g/L D-葡萄糖的 Eagle 最低必需培养基（E-MEM）中加入 5 mL 热灭活透析胎牛血清、500 µL 200 mM L-谷氨酰胺、100 µL 50 mg/mL 庆大霉素和 1 mL 1.0 M KCl，以制备 50 mL 小脑颗粒神经元培养基。将培养基于 4 °C 保存。
  10. 阿糖胞苷（Cytosine Beta-D- Arabino Furanoside）
    1. 将 48 mg 阿糖胞苷溶于 10 mL 生长培养基中，配制成 20 mM 储备液。将溶液于 -20 °C 保存。
  11. 多聚赖氨酸（Poly-D-Lysine）
    1. 为配制 2 mg/mL 的多聚赖氨酸储备液，将 20 mg 多聚赖氨酸溶于 10 mL 无菌水（H2O）中。多聚赖氨酸储备液应分装为 100 µL 每份，于 -80 °C 保存。
  12. 注意：以下溶液应在解剖前配制，并在使用前保持于 4 °C。
  13. 添加 MgSO4 的解剖液
    1. 向 250 mL 解剖液中加入 300 µL MgSO4 储备液。
  14. 含胰蛋白酶的解剖液
    1. 向 10 mL 解剖液中加入 100 µL 胰蛋白酶储备液和 12 µL MgSO4 储备液。
  15. 胰蛋白酶抑制剂溶液 1
    1. 向 10 mL 解剖液中加入 164 µL 胰蛋白酶抑制剂储备液、250 µL DNase 1 储备液和 12 µL MgSO4 储备液。
  16. 胰蛋白酶抑制剂溶液 2
    1. 向 10 mL 解剖液中加入 1040 µL 胰蛋白酶抑制剂储备液、750 µL DNase 1 储备液和 12 µL MgSO4 储备液。
  17. 添加 CaCl2 的解剖液
    1. 向 10 mL 解剖液中加入 10 µL CaCl2 储备液和 25 µL MgSO4 储备液。
  18. 多聚赖氨酸包被的培养皿
    1. 为包被培养皿，将 100 µL 多聚赖氨酸储备液用 40 mL 无菌水（H2O）稀释。对于 35 mm Nunc 培养皿，每皿加入 2 mL 稀释后的多聚赖氨酸溶液；对于 4 孔板，每孔加入 300 µL 稀释后的多聚赖氨酸溶液。
    2. 室温孵育 1 小时后，吸除液体，并分别用 4 mL（35 mm 培养皿）或 600 µL（4 孔板）无菌水（H2O）洗涤各孔。吸除水后，将培养皿在空气中干燥 1 小时。

2. 脑组织提取与小脑分离

  1. 使用剪头剪将一只6-7日龄的幼鼠断头。在无菌组织培养罩内进行脑组织的解剖。
  2. 取出脑组织时，用镊子夹住头部，用显微解剖剪沿头部前方向剪开皮肤，如图1所示。然后换用一把新的剪刀剪开颅骨，以尽量降低污染风险。用镊子移除覆盖脑组织的颅骨，并用镊子或刮匙小心分离并取出脑组织。
    1. 必要时可剪断视神经，以便完整取出脑组织。
  3. 将脑组织放入含有MgSO4的解剖液中，并将溶液和脑组织置于冰上保存。
  4. 取出脑组织后，在解剖显微镜下，于含MgSO4的解剖液中分离小脑，并用精细镊子去除脑膜。将小脑翻转至腹侧，确保彻底清除脉络丛。
  5. 将分离的小脑组织收集至一个直径35 mm的培养皿中，内含约1 mL添加MgSO4的解剖液。
  6. 将组织切成小块，转移至含有30 mL含MgSO4缓冲解剖液的50 mL离心管中。

3. 小鼠小脑颗粒神经元的分离与培养

  1. 将含有切碎的脑组织的50 mL离心管在644 × g、4 °C条件下离心5分钟。
  2. 弃去上清液，加入10 mL胰蛋白酶消化液，然后在37 °C下高速振荡15分钟。
  3. 向离心管中加入10 mL胰蛋白酶抑制剂溶液1，轻轻摇动2分钟。
  4. 将离心管在644 × g、4 °C条件下离心5分钟。
  5. 弃去上清液，加入2 mL胰蛋白酶抑制剂溶液2，然后转移至15 mL离心管中。
  6. 在15 mL离心管中吹打组织，直至溶液变浑浊，静置5分钟。
  7. 弃去澄清的上清液，将上清液转移至另一新离心管中，该管内含有1 mL添加了CaCl2的消化液。
  8. 向步骤3.6中沉淀物所在的离心管底部再加入1 mL胰蛋白酶抑制剂溶液2，再次吹打并静置5分钟。弃去上清液，并将其加入步骤3.7中含上清液的离心管中（即重复步骤3.6–3.7）。重复此过程，直至大部分组织被机械解离。
  9. 每1 mL上清液中加入0.3 mL添加了CaCl2的消化液至收集的上清液中。
  10. 混匀管内内容物，然后在644 × g条件下离心5分钟。
  11. 弃去上清液，向沉淀物中加入10 mL新鲜培养基并混匀。
  12. 随后可对细胞进行计数，并稀释至浓度为1.5 × 106 个细胞/mL。请注意，通常每个解剖得到的脑组织可获得约1000万个细胞，具体数量取决于胰蛋白酶消化时间和解剖效率。将细胞接种至预先制备的多聚D-赖氨酸包被的培养板中。对于4孔板，每孔接种0.5 mL，即每孔7.5 × 105 个细胞；对于35 mm培养皿，每皿接种4 mL，即每皿6 × 106 个细胞。
  13. 24小时后，向培养板中加入胞嘧啶-β-阿拉伯糖苷（AraC）以减少胶质细胞污染。每1 mL培养基需加入0.5 µL的20 mM AraC。添加AraC时无需更换培养基。若细胞需维持培养7–8天，则应在第3天重复此处理。
  14. 将培养物置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养，并在培养5天后每隔2天向每2 mL培养基中补充100 µL的100 mM葡萄糖溶液。无需进行完全换液。

4. 慢病毒包装、纯化与滴定

注意：先前已有详细描述无需使用试剂盒的慢病毒包装、浓缩、纯化及滴度测定方案28，其中包括流式细胞术等替代滴度测定方法29。本文简要介绍本实验室采用快速病毒纯化溶液和qPCR慢病毒滴度测定试剂盒制备慢病毒，用于研究神经元损伤的实验方案。

  1. 将 Hek293T 细胞接种于 10 cm 培养皿中，使用添加 10% FBS 的杜尔贝科改良伊格尔最低必需培养基（DMEM）。为获得高病毒滴度，每次转染至少准备 5 个培养皿的 Hek293T 细胞。确保转染当天细胞融合度达到 70%。转染前 3 小时更换培养基。
  2. 每次转染准备两个离心管。在 1 号管中加入 1.5 mL MEM 低血清培养基和 41 µL 转染试剂，充分混匀。在 2 号管中加入 1.5 mL MEM 低血清培养基、6 µg 转移质粒、6 µg pCMV-dR8.2 载体（包装质粒）、3 µg pCMV-VSV-G 载体（包膜质粒）以及 35 µL p3000 增强试剂（随脂质体转染试剂提供）。充分混匀后，将 1 号管与 2 号管内容物合并，涡旋混匀，室温孵育 15 分钟。
  3. 从 Hek293T 培养皿中移除 50% 培养基，加入 DNA-脂质复合物。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 6 小时。移除培养基，每皿加入 5 mL 新鲜 DMEM，继续孵育过夜。
  4. 转染后 24 小时，从每个培养皿收集第一批次病毒上清液。将病毒培养基置于 4 °C 保存，并向每个 Hek293T 培养皿中加入 5 mL 新鲜培养基，继续孵育过夜。
  5. 转染后 48 小时，收集第二批次病毒上清液，与第一批次合并，于 600 × g 离心 10 分钟。
  6. 使用孔径为 45 µm 的滤器过滤上清液。
  7. 使用快速病毒纯化溶液进行病毒纯化。每 45 mL 病毒上清液加入 5 mL 慢病毒结合溶液，混匀后于 4 °C、>5,000 × g 离心 10 分钟。
  8. 小心移除上清液，避免扰动沉淀。
  9. 加入 20–40 µL 培养基重悬沉淀。分装后于 -80 °C 保存。
  10. 为测定慢病毒滴度，使用 qPCR 慢病毒滴定试剂盒。将 2 µL 纯化病毒加入 500 µL PBS 中稀释。取 2 µL 稀释后的病毒加入 18 µL 病毒裂解缓冲液（试剂盒提供）中。
  11. 设置三组不同的 RT-qPCR 反应，每组设三个重复，分别标记为病毒裂解液、阳性对照 1（STD1）和阳性对照 2（STD2）。每个反应体系中加入 12.5 µL 2× qPCR MasterMix、2.5 µL 病毒裂解液或 STD1（试剂盒提供）或 STD2（试剂盒提供），以及 10 µL 试剂混合液（试剂盒提供），加入 0.2 mL PCR 管中。
  12. 设置 PCR 程序如下：42 °C 反转录 20 分钟，95 °C 酶活化 10 分钟，随后进行 40 个循环（每个循环包括 95 °C 变性 15 秒，60 °C 退火/延伸 1 分钟）。
  13. 使用以下公式计算病毒滴度：
    病毒裂解液滴度 = 5 × 107/23(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1)。
    Ctx = 未知样品的平均 Ct 值，Ct1 = STD1 的平均 Ct 值，Ct2 = STD2 的平均 Ct 值。
    注：根据所研究的损伤模式，CGN 细胞可优先采用慢病毒感染或腺病毒感染。在铺板时向细胞培养液中加入 MOI 为 2–3 的慢病毒，可用于在培养第 7 天研究 NMDA 诱导的信号通路。该条件可实现超过 80% 的转导效率，适用于对这些神经元进行生化分析（图 2）。在培养第 5 天以 MOI 50 加入腺病毒，并在第 7–8 天检测 NMDA 诱导的信号，适用于成像等其他技术。该处理导致神经元感染率低于 10%，非常适合用于蛋白的成像与共定位分析。也可在铺板时加入腺病毒，通过在第 2–3 天添加拓扑替康或过氧化氢，研究 DNA 损伤诱导的细胞死亡或氧化应激。目的基因标记的荧光蛋白（GFP、RFP、CFP 或 YFP）可用于评估转导效率及潜在毒性。在推荐的 MOI 条件下，我们观察到最小的细胞毒性及最高的转导效率（图 3）。

5. 神经元损伤建模

  1. 为了诱导NMDA介导的神经元兴奋性毒性，经过7天后 体外，用100 µM NMDA和10 µM甘氨酸处理CGNs 1小时。将所有培养基更换为来自未经处理的平行培养物的条件培养基。该浓度在处理后24小时导致50%的细胞死亡（图3C）。线粒体断裂在处理后6-8小时明显可见（参见 Jahani-Asl 等26,27).
  2. 为了诱导活性氧（ROS）引起的细胞死亡（氧化应激），用75–100 µM过氧化氢（H₂O₂）处理神经元。2O2）并换用平行培养物的条件培养基，该条件培养基经5分钟H处理后获得2O2注意，由于 H 的不稳定性2O2，将浓度优化至处理24小时后在培养物中诱导50-70%细胞死亡的水平。
  3. 为诱导DNA损伤导致的细胞死亡，用10 µM喜树碱处理CGNs。该浓度在24小时内可诱导超过50%的细胞死亡。在此浓度下，添加喜树碱后2-3小时即可观察到线粒体断裂及早期凋亡信号（参见Jahani-Asl）。 等18)
  4. 为诱导小脑颗粒神经元（CGNs）中低钾诱导的神经元凋亡，更换培养基为含25 mM K+的培养基+ 含5 mM K的低钾培养基+ 7天后 体外.

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结果

通过精细解剖，应尽可能完整地取出脑组织，减少损伤，如图1A-B所示。在取出过程中应尽量避免脑组织受损，尤其是小脑的损伤。若小脑受损，将增加脑膜识别与完全去除的难度，并提高神经元培养污染的风险。脑膜去除后，可从小脑剩余组织中分离出小脑，如图1C所示，并进行后续的解离处理。

铺板前，可按照图2所述，用慢病毒感染颗粒转导或用腺病毒感染小脑颗粒神经元（CGNs）。我们发现，腺病毒感染时，MOI为50时效率最高且毒性最小；慢病毒转导则在铺板当天使用MOI为2-3可达到最佳效果（图3）。

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讨论

本文提供了一种简单的方法，用于原代小鼠小脑颗粒神经元（CGNs）的培养、功能缺失与功能获得研究，以及不同细胞死亡机制的建模。使用该方法时，多个因素会影响实验结果的可重复性，需密切监控。这些因素包括培养物的纯度（如清除培养物中的胶质细胞）、细胞融合度以及维持细胞的健康状态。上述因素的任何变异均可能导致结果偏差，并影响实验的可重复性。下文将介绍如何最大限度地减少这些对实验结果产生负面影响的因素。

为了从颗粒神经元（CGNs）培养物中去除胶质细胞并建立纯神经元群体，我们使用10 µM的阿糖胞苷（cytosine-β-arabino furanoside, AraC），这是一种嘧啶抗代谢物，可通过抑制DNA合成来杀死增殖中的细胞。如果仍有胶质细胞残留，可将AraC浓度提高至15 µM，这也与试剂批次有关。此外，对于维持培养达7-8天的细胞，可在第3天进行第二次AraC处理。为了获得纯化的神经元群体并避免细胞死亡，在将组织切成小块之前，必须彻底剥离小脑表面的所有脑膜，随后进行胰蛋白酶消化。此操作应控制在合理较短的时间内完成（每个小脑不超过7-10分钟）。若神经元培养物中残留脑膜，会导致培养状...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由加拿大自然科学与工程研究理事会以及加拿大卫生研究院向 A.J.-A. 提供的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
qPCR 慢病毒滴度测定试剂盒 ABM#LV900
快速病毒纯化溶液 ABM#LV999
pCMV-dR8.2Addgene#8455
pCMV-VS.VGAddgene#8454
蒸馏水 Gibco#15230162
200 mM L-谷氨酰胺 Gibco#25030081
35 mm Nunc 培养皿Gibco#174913
PowerUP SYBR Green 主混合液生命技术公司#A25742
BSA V 溶液Sigma Aldrich#A-8412
CaCl2 • 2H2OSigma Aldrich#C-7902 
喜树碱Sigma Aldrich#C-9911
鸡卵清胰蛋白酶抑制剂 Sigma Aldrich#10109878001
阿糖胞苷Sigma Aldrich#C-1768
D-(+)-葡萄糖 Sigma Aldrich#G-7528
DNase1 Sigma Aldrich#11284932001
Eagle最低必需培养基Sigma Aldrich#M-2279
甘氨酸Sigma Aldrich#G-5417
热灭活透析胎牛血清 Sigma Aldrich#F-0392
HEPES缓冲液 Sigma Aldrich#H-0887
过氧化氢Sigma Aldrich#216763
50 mg/mL 庆大霉素 Sigma Aldrich#G-1397
MgSO₄ Sigma Aldrich#M-2643
N-甲基-D-天冬氨酸Sigma Aldrich#M-3262
酚红溶液 Sigma Aldrich#P-0290
胰蛋白酶 Sigma Aldrich#T-4549
Lipofectamine 3000赛默飞世尔科技L3000-008
p3000 增强剂试剂赛默飞世尔科技L3000-008
Opti-MEM I 低血清培养基赛默飞世尔科技31985070
KCl VWR#CABDH9258
NaCl VWR#CABDH9286
NaH2PO4H2O VWR#CABDH9298
聚D-赖氨酸 VWR#89134-858
DMEMWisent#319-005-CL
FBSWisent#080-450

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