结合拉曼成像和多变量分析可视化植物细胞壁中的木质素，纤维素和半纤维素

摘要

该方案旨在提出使用拉曼成像和多变量分析在植物细胞壁中可视化木质素，纤维素和半纤维素的一般方法。

摘要

拉曼成像对植物生物量的应用正在增加，因为它可以提供水溶液的空间和组成信息。分析通常不需要大量样品制备;结构和化学信息可以在没有标记的情况下获得。然而，每个拉曼图像包含数千个光谱;这在提取隐藏信息时尤其是具有类似化学结构的组件提出了困难。这项工作引入了一个多变量分析来解决这个问题。该方案建立了可视化植物细胞壁内主要成分（包括木质素，纤维素和半纤维素）的一般方法。在该协议中，描述了样品制备，光谱采集和数据处理的过程。它在样品制备和数据分析方面高度依赖操作员的技能。通过使用这种方法，可以由非专业用户执行拉曼调查以获得high质量数据和植物细胞壁分析的有意义的结果。

引言

植物生物质是地球上最丰富的可再生资源;主要由木质素、纤维素和半纤维素组成;被认为是生物能源和生物基化学品的有吸引力的来源¹.不幸的是，它可以抵抗降解并赋予植物细胞壁水解稳定性或结构稳健性。这种阻力归因于可接近的表面积、生物质粒径、聚合度、纤维素结晶度和保护性木质素²。因此，从植物生物学和化学以及商业利用的角度来看，全面了解植物细胞壁的结构和化学性质具有重要意义。常用的湿化学分析，如色谱、质谱和核磁共振波谱，仅提供被测样品的平均成分数据。此外，这些方法是侵入性的，会破坏植物组织的原始结构³。

拉曼成像技术是非破坏性可视化空间分辨化学信息的强大工具⁴.它使用激光与光子产生非弹性散射，并依赖于分子振动引起的偏振率变化。在这种情况下，水会导致微弱的拉曼散射，这使得这种方法适用于生物样品的原位研究⁵。将拉曼成像技术应用于植物细胞壁可以阐明植物细胞壁在其天然状态下的结构和组成，其分辨率与单个细胞甚至细胞壁层的尺度相同⁶。植物细胞壁的典型拉曼成像分析通常包括三个步骤：1） 样品制备，2） 光谱采集，以及 3） 数据处理。

尽管拉曼成像的主要优势之一是能够以最少的样品制备获得无标记和非破坏性光谱，但仍然需要物理样品切片来曝光感兴趣的表面。应仔细执行此过程以获得平坦的表面，因为该技术依赖于保持光学焦点⁷。光谱采集需要在图像质量和较长的采集时间之间取得平衡⁸。数据处理旨在有效地从图像数据中提取化学信息，特别是对于化学结构相似的成分，如纤维素和半纤维素。由于光谱重叠强烈，因此很难辨别确切的光谱。在这种情况下，多元分析是一种有效的方法，可以有效地发现隐藏的结构和化学信息⁹。这项工作提出了一个通用方案，描述了使用拉曼成像来可视化植物细胞壁中的主要成分，包括木质素、纤维素和半纤维素。

方案

样品制备

1. 从植物样品（ 例如，杨树茎）切下一个小的组织块（约3 mm x 3 mm x 5 mm）。
2. 将组织浸入沸腾的去离子水中30分钟。立即将其在室温（RT）下转移到去离子水中30分钟。重复此步骤，直到组织沉入容器的底部，表明组织中的空气已经被去除并且组织已经软化。
   注意:对于在此步骤之前沉入底部的样品，通常重复此循环3-5次。
3. 在去离子水中制备20，50，70，90％（v / v）等分的聚乙二醇（PEG），以及纯PEG，并将溶液保持在65℃。
4. 在一系列分级的PEG浴中孵育组织以置换水并允许PEG渗透。
   注意:通常，分子量为2,000（PEG2000）的PEG用于嵌入。
   1. 用g处理组织如下:（a）20％PEG 1小时，（b）50％PEG 1.5小时，（c）70％PEG 2小时，（d）90％PEG 2小时，和（e）100％PEG 10小时。
5. 在烤箱中预热65℃的盒子。将含有块的PEG倒入盒中，然后使用预热的镊子或针将组织块放置在所需位置。
6. 慢慢冷却盒子并将组织储存在室温下直至使用。
7. 使用锋利的剃须刀将含有目标组织的PEG块解剖成小块（约1cm×1cm×2cm），并将其安装在切片机上。
8. 从PEG块切割薄片（通常为3-10μm）。
9. 用手表玻璃中的去离子水冲洗该部分10次以从组织中去除PEG。
10. 将各部分用甲苯/乙醇（2:1，v / v）浸泡6小时以除去提取物。通过混合65mL去离子水，0.5mL乙酸和0.6g氯化钠来制备反应液在烧杯中举行仪式将一个部分和3 mL反应液加入到5 mL小瓶中。拧上小瓶的顶部。
11. 将小瓶在75℃的水浴中加热2小时以除去组织的木质素。用去离子水冲洗表面10次。
12. 将未处理/脱木质部分转移到玻璃显微镜载玻片上。用刷子或针头小心地打开部分。用薄纸去除额外的去离子水。
13. 将部分浸入D ₂ O.用玻璃盖板盖住样品。用指甲油密封盖子，防止D ₂ O蒸发。

光谱采集

1. 打开共焦拉曼显微镜的仪器操作软件。打开激光（波长= 532 nm），用100X显微镜物镜聚焦在晶体硅的表面，然后单击校准按钮校准仪器。
2. 切换仪器到光学显微镜模式并打开显微镜灯。将显微镜载玻片放在舞台上，盖子面对物镜。
3. 使用20X显微镜物镜查看样品，并找到感兴趣的区域。将浸油涂抹于盖玻片上并切换到浸没式显微镜物镜（60X，数值孔径NA = 1.35）。专注于样品表面。
4. 将仪器切换到拉曼测试模式，然后关闭显微镜灯。
5. 使用矩形工具选择一个映射区域。改变步长以确定获得的光谱数。
   注意:注意步长（通常大于由物镜的数值孔径计算的光点直径;理论上大于1.22λ/ NA）。以下尺寸将导致过采样。
6. 设置最佳光谱参数，以在适当的采集时间（通常<8 h）获得最佳信噪比（SNR）和光谱质量，了解样品适用性。通常，在仪器软件中输入激光（532 nm），滤光片（100％），孔（300），狭缝（100），光谱仪（1,840 cm ^-1 ），凹槽（1200t），物镜60X油），采集时间（2 s）。
7. 在数据处理之前保存光谱数据，并将其转换为通用格式（ 例如， TXT文件）。

3.数据分析

1. 将光谱数据（TXT文件）加载到数据分析软件（ 例如 Matlab）中。在数据集上应用降噪技术来提高SNR（ 例如， Savitzsky-Golay算法或小波算法）
2. 使用未处理的样品产生木质素和多糖的图像。对于木质素成像，由于芳环对称伸缩振动，考虑1,600cm ^-1附近的光谱峰。对于多糖成像（包括纤维素和半纤维素），使用光谱峰a圆2,889厘米^-1 ，因为CH和CH ₂伸展。
3. 使用脱木素样品产生纤维素和半纤维素的图像。对获取的光谱进行自我建模曲线分辨率（SMCR），以区分纤维素和半纤维素的光谱并对其分布进行成像。
4. 对获取的数据进行主成分分析（PCA）和聚类分析，以区分不同细胞壁层的拉曼光谱。

结果

图1给出了用于植物细胞壁的拉曼成像的典型的微拉曼系统的概述。例如，杨树（ Populus nigra L.）的原始拉曼光谱具有显着的基线漂移和峰值（ 图2a ）。在执行拉曼成像数据集（APRI）的自动预处理方法之后，这两个光谱污染物被成功地去除（ 图2b ）。 图3中显示了杨树的典型拉曼光谱，其波段分配列于表1 。木质素的拉曼图像通过归结于芳环结构的1,550-1,650cm ^-1的光谱区域的积分而产生（ 图4a ）。 图4d显示了多糖的拉曼图像，通过在2,889cm ^-1处整合峰来实现。为了成像纤维素和半纤维素，对脱木素...

讨论

植物细胞壁是组织成几层的复合材料，包括细胞角（CC），次生壁（SW，具有S1，S2和S3层）和复合中间片（CML，中间片加上相邻的原始细胞壁），这使得在样品制备期间难以获得平坦的表面。因此，具有比木材更复杂结构的植物样品，特别是草，通常需要被固化以允许精细切片。 PEG是一种用于切割和拉曼研究的理想硬质基质，因为它可溶于水。用去离子水漂洗可以很容易地去除。用于嵌入的PEG具有不同的分子量，从1,000-20,000变化。 PEG的分子量越高，穿透能力越低¹⁰ 。 D ₂ O有助于降低木质素的荧光，在2,490 cm ^-1处有明显的峰值，但不会消除荧光干扰。二主要噪声信号与实际信号一起溢出:1）样品和背景荧光以及CCD的热波动可能导致基线漂移，2）宇宙射线可以显着影响敏感探测器，这表现在光谱作为窄带宽尖峰。 APRI方法是为了解决这些问题而开发的。 APRI包括自适应迭代重新加权的惩罚最小二乘法（airPLS）和主成分分析（PCA），以通过使用光谱特征本身来消除基线漂移和宇宙尖峰。

为了实现分...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
切片机	Thermo Scientific	Microm HM430
共焦拉曼显微镜	Horiba Jobin Yvon	Xplora
Oven	上海志诚	ZXFD-A5040