本实验方案旨在介绍一种利用拉曼成像结合多元分析方法，对植物细胞壁中的木质素、纤维素和半纤维素进行可视化的一般性方法。
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本文内容
摘要
摘要
拉曼成像在植物生物质研究中的应用日益增多，因为它能够提供水溶液的空间和组成信息。该分析通常不需要复杂的样品制备过程，无需标记即可获得结构和化学信息。然而，每幅拉曼图像包含数千个光谱，在提取隐藏信息时会带来困难，特别是对于化学结构相似的组分。本研究引入了一种多变量分析方法以解决这一问题。该方案建立了一种通用方法，用于可视化植物细胞壁中的主要组分，包括木质素、纤维素和半纤维素。本文描述了样品制备、光谱采集和数据处理的各个步骤。该方法在很大程度上依赖于操作人员在样品制备和数据分析方面的技能。通过采用该方法，非专业用户也能开展拉曼检测，获得高质量的数据和具有科学意义的植物细胞壁分析结果。
引言
植物生物质是地球上最丰富的可再生资源，主要由木质素、纤维素和半纤维素组成，被认为是生物能源和生物基化学品的有吸引力的来源1。然而，它具有抗降解性，可赋予植物细胞壁水解稳定性和结构坚固性。这种抗性归因于可及表面积、生物质颗粒大小、聚合度、纤维素结晶度以及起保护作用的木质素2。因此，从植物生物学与化学的角度以及商业利用的角度来看，全面理解植物细胞壁的结构和化学特性具有重要意义。常用的湿化学分析方法，如色谱法、质谱法和核磁共振波谱法，仅能提供被测样品的平均组成数据。此外，这些方法具有侵入性，会破坏植物组织的原始结构3。
拉曼成像技术是一种强大的工具，可用于无损可视化具有空间分辨的化学信息4它利用激光照射引发光子的非弹性散射，并依赖分子振动引起的极化率变化。在这种情况下，水产生的拉曼散射较弱，使得该方法适用于 原位 生物样本的检测与分析5拉曼成像技术在植物细胞壁中的应用能够揭示植物细胞壁在天然状态下的结构与组成，其分辨率可达到单个细胞水平，甚至能够分辨细胞壁的各层结构。6植物细胞壁的典型拉曼成像分析通常包括三个步骤：1）样品制备，2）光谱采集，3）数据处理。
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方案
1. 样品制备
- 从植物样品中切取一小块组织（约 3 mm × 3 mm × 5 mm）例如， 杨树茎干
- 将组织浸入沸腾的去离子水中 30 分钟。立即转移至室温（RT）去离子水中继续孵育 30 分钟。重复此步骤，直至组织沉入容器底部，表明组织内的空气已被去除且组织已软化。
注意：对于在此步骤之前已沉降至底部的样品，通常重复此循环3-5次。 - 配制20%、50%、70%、90%（v/v）的聚乙二醇（PEG）水溶液，以及纯PEG，将各溶液置于65 °C下保温。
- 将组织置于浓度梯度递增的聚乙二醇（PEG）溶液中孵育，以置换水分并使PEG渗透入组织。
注意：通常使用分子量为2,000的聚乙二醇（PEG2000）进行包埋。- 在干燥烘箱中用梯度浓度的聚乙二醇（PEG）处理组织，步骤如下：（a）20% PEG 处理 1 小时，（b）50% PEG 处理 1.5 小时，（c）70% PEG 处理 2 小时，（d）90% PEG 处理 2 小时，（e）100% PEG 处理 10 小时。
- 将包埋盒在65 °C的烘箱中预热。将含有组织块的石蜡倒入包埋盒中，然后使用预热的镊子或针将组织块置于理想位置。
- 缓慢冷却胶带盒，并将组织在室温下保存至使用。
- 使用锋利的剃刀将含有目标组织的 PEG....
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结果
图1展示了一个典型的用于植物细胞壁拉曼成像的微区拉曼系统的整体结构。以杨树（Populus nigra L.）为例，其原始拉曼光谱存在明显的基线漂移和尖峰（图2a）。在采用拉曼成像数据集自动预处理方法（APRI）处理后，这两种光谱干扰成分被成功去除（图2b）。杨树的典型拉曼光谱如图3所示，其谱带归属列于表1中。木质素的拉曼图像通过积分1,550–1,650 cm-1波数范围的光谱区域生成，该区域归属于芳香环结构（图4a）。图4d展示了多糖的拉曼图像，该图像是通过对2,889 cm-1处的峰进行积分获得的。为了对纤维素和半纤维.......
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讨论
植物细胞壁是一种复合结构，由多个层次组成，包括胞间角（CC）、次生壁（SW，包含S1、S2和S3层）以及复合中层（CML，即中层及其相邻的初生壁），这使得在样品制备过程中难以获得平整的表面。因此，植物样品尤其是结构比木材更复杂的草本植物，通常需要进行固化处理，以便实现精细切片。聚乙二醇（PEG）是一种理想的切割和拉曼检测用硬质基质，因其可溶于水，可通过去离子水冲洗轻松去除。用于包埋的PEG具有不同的分子量，范围从1,000至20,000。PEG分子量越高，其渗透能力越低10。重水（D2O）有助于降低木质素的荧光干扰，并在2,490 cm-1处产生明显的峰信号，但无法完全消除荧光干扰。在检测过程中，有两种主要噪声信号会与真实信号一同进入通道：1）样品和背景荧光以及CCD的热波动可能导致基线漂移；2）宇宙射线会显著影响灵敏探测器，在光谱中表现为窄带尖峰。为解决这些问题，研究人员开发了自适应光谱去噪方法（APRI）11。APRI结合了自适应迭代重加权惩罚最小二乘法（airPLS）和主成分分析（PCA），利.......
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披露
作者无任何利益冲突可披露。
致谢
感谢中国科学技术部（2016YDF0600803）提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 切片机 | Thermo Scientific | Microm HM430 | |
| 共聚焦拉曼显微镜 | Horiba Jobin Yvon | Xplora | |
| 烘箱 | Shanghai ZHICHENG | ZXFD-A5040 |
参考文献
- Gonzalo, G. D., et al. Bacterial Enzymes Involved in Lignin Degradation. J. Biotechnol. 236, 110-119 (2016).
- Rosatella, A. A., Afonso, C. A. M. Chapter 2. Ionic Liquids in the Biorefinery Concept: Challenges and Perspectives. , Wiley. 38-64 (2016).
- Sun, L., et al. <....
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重印与许可
