结合拉曼成像与多元分析可视化植物细胞壁中的木质素、纤维素和半纤维素

摘要

本实验方案旨在介绍一种利用拉曼成像结合多元分析方法，对植物细胞壁中的木质素、纤维素和半纤维素进行可视化的一般性方法。

摘要

拉曼成像在植物生物质研究中的应用日益增多，因为它能够提供水溶液的空间和组成信息。该分析通常不需要复杂的样品制备过程，无需标记即可获得结构和化学信息。然而，每幅拉曼图像包含数千个光谱，在提取隐藏信息时会带来困难，特别是对于化学结构相似的组分。本研究引入了一种多变量分析方法以解决这一问题。该方案建立了一种通用方法，用于可视化植物细胞壁中的主要组分，包括木质素、纤维素和半纤维素。本文描述了样品制备、光谱采集和数据处理的各个步骤。该方法在很大程度上依赖于操作人员在样品制备和数据分析方面的技能。通过采用该方法，非专业用户也能开展拉曼检测，获得高质量的数据和具有科学意义的植物细胞壁分析结果。

引言

植物生物质是地球上最丰富的可再生资源，主要由木质素、纤维素和半纤维素组成，被认为是生物能源和生物基化学品的有吸引力的来源¹。然而，它具有抗降解性，可赋予植物细胞壁水解稳定性和结构坚固性。这种抗性归因于可及表面积、生物质颗粒大小、聚合度、纤维素结晶度以及起保护作用的木质素²。因此，从植物生物学与化学的角度以及商业利用的角度来看，全面理解植物细胞壁的结构和化学特性具有重要意义。常用的湿化学分析方法，如色谱法、质谱法和核磁共振波谱法，仅能提供被测样品的平均组成数据。此外，这些方法具有侵入性，会破坏植物组织的原始结构³。

拉曼成像技术是一种强大的工具，可用于无损可视化具有空间分辨的化学信息⁴它利用激光照射引发光子的非弹性散射，并依赖分子振动引起的极化率变化。在这种情况下，水产生的拉曼散射较弱，使得该方法适用于 原位 生物样本的检测与分析⁵拉曼成像技术在植物细胞壁中的应用能够揭示植物细胞壁在天然状态下的结构与组成，其分辨率可达到单个细胞水平，甚至能够分辨细胞壁的各层结构。⁶植物细胞壁的典型拉曼成像分析通常包括三个步骤：1）样品制备，2）光谱采集，3）数据处理。

尽管拉曼成像的主要优势之一是能够在几乎无需样品制备的情况下实现无标记、非破坏性的光谱检测，但仍需对样品进行物理切片以暴露目标表面。该过程需谨慎操作以获得平整的表面，因为该技术依赖于保持光学聚焦⁷。光谱采集需要在图像质量与较长的采集时间之间取得平衡⁸。数据处理旨在从图像数据中有效提取化学信息，特别是对于化学结构相似的组分，如纤维素和半纤维素。由于光谱重叠严重，精确分辨各自的特征光谱较为困难。在此情况下，多元分析是一种直接而有效的方法，可用于揭示隐藏的结构与化学信息⁹。本研究提供了一项通用实验方案，用于描述如何利用拉曼成像对植物细胞壁中的主要组分（包括木质素、纤维素和半纤维素）进行可视化分析。

方案

1. 样品制备

1. 从植物样品中切取一小块组织（约 3 mm × 3 mm × 5 mm）例如， 杨树茎干
2. 将组织浸入沸腾的去离子水中 30 分钟。立即转移至室温（RT）去离子水中继续孵育 30 分钟。重复此步骤，直至组织沉入容器底部，表明组织内的空气已被去除且组织已软化。
   注意：对于在此步骤之前已沉降至底部的样品，通常重复此循环3-5次。
3. 配制20%、50%、70%、90%（v/v）的聚乙二醇（PEG）水溶液，以及纯PEG，将各溶液置于65 °C下保温。
4. 将组织置于浓度梯度递增的聚乙二醇（PEG）溶液中孵育，以置换水分并使PEG渗透入组织。
   注意：通常使用分子量为2,000的聚乙二醇（PEG2000）进行包埋。
   1. 在干燥烘箱中用梯度浓度的聚乙二醇（PEG）处理组织，步骤如下：（a）20% PEG 处理 1 小时，（b）50% PEG 处理 1.5 小时，（c）70% PEG 处理 2 小时，（d）90% PEG 处理 2 小时，（e）100% PEG 处理 10 小时。
5. 将包埋盒在65 °C的烘箱中预热。将含有组织块的石蜡倒入包埋盒中，然后使用预热的镊子或针将组织块置于理想位置。
6. 缓慢冷却胶带盒，并将组织在室温下保存至使用。
7. 使用锋利的剃刀将含有目标组织的 PEG 区块切割成小块（约 1 cm × 1 cm × 2 cm），并安装到切片机上。
8. 从聚乙二醇（PEG）包埋块上切下薄片（通常为3-10 µm）。
9. 在表玻璃中用去离子水冲洗切片10次，以去除组织中的聚乙二醇（PEG）。
10. 将切片浸入甲苯/乙醇（2:1，v/v）中 6 小时，以去除抽提物。在烧杯中混合 65 mL 去离子水、0.5 mL 乙酸和 0.6 g 亚氯酸钠，制备反应液。取一个切片与 3 mL 反应液加入 5 mL 小瓶中。拧紧瓶盖。
11. 将样品管置于75 °C水浴中加热2 h，以去除组织中的木质素。在表玻璃中用去离子水冲洗切片10次。
12. 将未经处理/脱木质素的切片转移至玻璃载玻片上。使用毛笔或针头小心展开切片。用纸巾吸去多余的去离子水。
13. 将切片浸入 D₂O. 用盖玻片覆盖样品，用指甲油密封盖玻片边缘，防止 D 的蒸发₂O.

2. 光谱采集

1. 打开共聚焦拉曼显微镜的仪器操作软件。开启激光器（波长 = 532 nm），使用100倍物镜聚焦于单晶硅表面，然后点击校准按钮对仪器进行校准。
2. 切换仪器至光学显微镜模式，并打开显微镜光源。将显微镜载玻片放置于载物台上，盖玻片朝向物镜。
3. 使用20倍物镜观察样品，找到目标区域。在盖玻片上滴加浸油，切换至浸油物镜（60倍，数值孔径NA = 1.35）。聚焦于样品表面。
4. 将仪器切换至拉曼测试模式，并关闭显微镜光源。
5. 使用矩形工具选择映射区域。调整步长以确定获得的光谱数量。
   注意：需注意步长（通常大于由物镜数值孔径计算出的光斑直径；理论值为1.22λ/NA）。低于此尺寸将导致过度采样。
6. 设置最佳光谱参数，以在适当的采集时间（通常 < 8 小时），具体取决于样本的适用性。通常，在仪器软件中输入以下成像参数：激光（532 nm）、滤光片（100%）、针孔（300）、狭缝（100）、光谱仪（1,840 cm⁻¹）^-1），沟槽（1200t）、物镜（60X 油镜）和采集时间（2 s）。
7. 在数据处理前保存光谱数据，并将其转换为通用格式（例如， TXT 文件）

3. 数据分析

1. 将光谱数据（TXT 文件）载入数据分析软件（例如， Matlab）。对数据集应用降噪技术以提高信噪比（SNR）例如， Savitzsky-Golay 算法或小波算法
2. 使用未经处理的样品生成木质素和多糖的成像图像。对于木质素成像，考虑约1,600 cm⁻¹处的光谱峰^-1 由于芳香环对称伸缩振动所致。对于多糖成像（包括纤维素和半纤维素），使用约 2,889 cm⁻¹ 处的谱峰^-1 由于CH和CH₂ 拉伸。
3. 使用脱木质素样品获取纤维素和半纤维素的图像。对获得的光谱进行自建模曲线分辨（SMCR），以区分纤维素和半纤维素的光谱，并成像其分布情况。
4. 对获得的数据进行主成分分析（PCA）和聚类分析，以区分来自不同细胞壁层的拉曼光谱。

结果

图1展示了一个典型的微区拉曼系统，用于植物细胞壁的拉曼成像。以杨树（Populus nigra L.）为例，其原始拉曼光谱存在明显的基线漂移和尖峰（图2a）。在对拉曼成像数据集执行自动预处理方法（APRI）后，这两种光谱干扰被成功去除（图2b）。典型的杨树拉曼光谱如图3所示，其谱带归属列于表1中。木质素的拉曼图像通过积分1,550–1,650 cm^-1的光谱区域生成，该区域归属于芳香环结构（图4a）。图4d展示了多糖的拉曼图像，该图像是通过积分2,889 cm^-1处的峰获得的。为了成像纤维素和半纤维素，对脱木质素样品的拉曼成...

讨论

植物细胞壁是一种复合结构，由多个层次组成，包括胞间角（CC）、次生壁（SW，包含S1、S2和S3层）以及复合中层（CML，即中层及其相邻的初生壁），这使得在样品制备过程中难以获得平整的表面。因此，植物样品尤其是结构比木材更复杂的草本植物，通常需要进行固化处理，以便实现精细切片。聚乙二醇（PEG）是一种理想的切割和拉曼检测用硬质基质，因其可溶于水，可通过去离子水冲洗轻松去除。用于包埋的PEG具有不同的分子量，范围从1,000至20,000。PEG分子量越高，其渗透能力越低¹⁰。重水（D₂O）有助于降低木质素的荧光干扰，并在2,490 cm^-1处产生明显的峰信号，但无法完全消除荧光干扰。在检测过程中，有两种主要噪声信号会与真实信号一同进入通道：1）样品和背景荧光以及CCD的热波动可能导致基线漂移；2）宇宙射线会显著影响灵敏探测器，在光谱中表现为窄带尖峰。为解决这些问题，研究人员开发了自适应光谱去噪方法（APRI）¹¹。APRI结合了自适应迭代重加权惩罚最小二乘法（airPLS）和主成分分析（PCA），利...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
切片机	Thermo Scientific	Microm HM430
共聚焦拉曼显微镜	Horiba Jobin Yvon	Xplora
烘箱	Shanghai ZHICHENG	ZXFD-A5040