结合拉曼成像和多变量分析可视化植物细胞壁中的木质素，纤维素和半纤维素
2017年6月10日
该方案旨在提出使用拉曼成像和多变量分析在植物细胞壁中可视化木质素，纤维素和半纤维素的一般方法。
本实验的总体目标是提出一种通过拉曼成像和多变量分析可视化植物细胞壁中木质素、纤维素和半纤维素的通用方法。这种方法可以帮助回答植物生物质领域的关键问题，例如主要化学成分如何在植物细胞壁中分布。该技术的主要优点是，只需最少的样品制备即可获得有关样品的免人工和非破坏性信息。
首先，从植物样品中切下一小组织块。将组织浸入沸腾的去离子水中 30 分钟。然后，立即将其转移到室温下的去离子水中 30 分钟。
重复此步骤，直到组织沉到容器底部，表明组织中的空气已被去除，组织已软化。制备 20%、50%、70% 和 90% 等分试样的 PEG 和去离子水，以及纯 PEG。将溶液保持在 65 摄氏度。
在一系列分级 PEG 浴中孵育组织以置换水，并让 PEG 浸润。在 20% PEG 中干燥 1 小时，在 50% PEG 中干燥 1 小时半，在 70% PEG 中干燥 2 小时，在 90% PEG 中干燥 2 小时，在 100% PEG 中干燥 10 小时。接下来，在烤箱中以 65 摄氏度预热磁带。
将含有 PEG 的组织块倒入盒中，然后使用预热的镊子或针头将组织块放置在所需位置。慢慢冷却盒，并将组织储存在室温下直至使用。使用锋利的剃须刀片将包含目标组织的 PEG 块解剖成一个小块。
将小 PEG 块安装到切片机上，并从 PEG 块上切下薄片。然后，在手表类中用去离子水冲洗切片 10 次，以从组织中去除 PEG。接下来，用甲苯和乙醇浸泡切片 6 小时以去除提取物。
通过在烧杯中混合 65 mL 去离子水、0.5 mL 乙酸和 0.6 g 氯化钠来制备反应液。向 5 mL 样品瓶中加入一个切片和 3 mL 反应液。拧上样品瓶顶部。
然后，将样品瓶放入 75 摄氏度的水浴中加热 2 小时，以去除组织的木质素。在手表玻璃杯中用去离子水冲洗该部分 10 次。接下来，将未处理和去木质化的部分转移到玻璃显微镜载玻片上。
使用刷子或针小心展开该部分。用薄纸去除多余的去离子水。然后，将切片浸入氧化氘中。
用玻璃盖玻片盖住样品。用指甲油密封盖玻片，以防止氧化氘蒸发。打开共焦拉曼显微镜的仪器作软件。
打开激光器，并使用 100 倍显微镜物镜专注于晶体和硅的服务。单击校准按钮以校准仪器。将仪器切换到光学显微镜模式并打开显微镜灯。
将显微镜载玻片安装在载物台上，使盖玻片面向物镜。使用 20 倍显微镜物镜观察样品并找到感兴趣区域。切换到浸入式显微镜物镜。
将浸油涂抹在盖玻片上，然后聚焦在样品表面。接下来，将仪器切换到拉曼测试模式并关闭显微镜灯。使用矩形工具选择映射区域。
更改步长以确定获得的光谱数。请注意，步长应大于光斑直径，光斑直径由物镜的数值孔径计算得出。小于此值的大小将导致过度采样。
设置最佳光谱参数以获得最佳信噪比和光谱质量，并根据样品适用性设置适当的采集时间。一般在仪器软件中输入成像参数，使用激光波长为 532 纳米，滤光片为 100%a 孔为 300，狭缝为 100，光谱仪为1840 反厘米，凹槽为 1200T，60 倍油物镜，采集时间为 2 秒。在数据处理之前保存光谱数据，并在继续进行数据分析之前将数据转换为通用格式，如文本协议中所述。
杨细胞壁的原始拉曼光谱如下所示。两个主要的噪声信号，包括基线漂移和宇宙尖峰，与实际信号一起溢出到通道中。在数据分析之前，应将其删除。
可以应用诸如 Savitzky-Golay 算法或小波算法之类的降噪技术来消除这些噪声信号。对于木质素成像，考虑由于芳香环对称拉伸振动而导致的 1600 倒厘米左右的光谱峰值。对于多糖成像，由于 CH 和 CH2 拉伸，请使用 2889 倒厘米附近的光谱峰值。
但是，纤维素和半纤维素的拉曼图像不能直接生成。脱木素是揭示它们的光谱特征的必要程序。一般来说，我们是这种方法的新手。
我们很挣扎，因为它需要接受样品切片和数据分析的处理和外观方面的培训。观看此视频后，您应该对如何使用原位方法获取有关植物细胞壁的化学信息有很好的了解。按照此程序，可以执行其他方法，如化学预处理，以回答其他问题，例如植物细胞壁的顽固性。
虽然这种方法可以深入了解植物细胞壁内的内部结构性质和拓扑化学，但它也可以应用于其他生物样品。
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概述
本协议介绍了一种使用拉曼成像和多变量分析来可视化植物细胞壁中的木质素、纤维素和半纤维素的方法。该技术提供了对植物生物质化学成分的非破坏性洞察。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物生物学
- 生物质研究
- 分析化学
背景
- 了解植物细胞壁成分对于生物质利用至关重要。
- 拉曼成像允许对植物组织进行详细的化学映射。
- 多变量分析有助于解释成像的复杂数据。
- 该方法最小化样品制备且是非破坏性的。
研究目的
- 可视化植物细胞壁中主要化学成分的分布。
- 提供一种无需人工分析植物生物质的方法。
- 增强对植物细胞壁结构和成分的理解。
使用的方法
- 从植物样本中切取小块组织。
- 将组织浸入沸腾的去离子水中30分钟。
- 将组织转移到室温的去离子水中30分钟。
- 利用拉曼成像进行可视化，并使用多变量分析进行数据解释。
主要结果
- 成功可视化木质素、纤维素和半纤维素。
- 展示了细胞壁中化学成分的分布模式。
- 提供了一种非破坏性的分析植物组织的方法。
- 促进了植物生物质应用方面的进一步研究。
结论
- 该方法有效用于研究植物细胞壁成分。
- 拉曼成像结合多变量分析提供了宝贵的洞察。
- 这种方法可以推进植物生物学和生物质利用的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables non-destructive, label-free visualization of lignin, cellulose, and hemicellulose in plant cell walls, supporting mechanistic de-risking in biomass conversion and bio-based material development. By providing spatially resolved chemical composition data, it aids in target validation for enzyme engineering and pretreatment optimization. The approach reduces reliance on destructive assays and enhances predictive confidence in early-stage biomass screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of plant cell wall architecture to inform hypotheses about biomass recalcitrance and enzyme accessibility.
- Operational Value: Supports functional target validation by correlating chemical distribution with enzymatic digestibility outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative spectral outputs that can be standardized for high-throughput screening of biomass variants.
- Operational Value: Facilitates assay readiness through reproducible sample preparation and minimal operator-dependent variability after training.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system insights by linking cell wall composition to phenotypic traits in biomass yield and processing efficiency.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical scaling by delivering consistent, label-free compositional data across sample sets.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting early biomass characterization and enabling data-driven decisions in enzyme and pretreatment development pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on structural barriers to biomass deconstruction through direct visualization of lignin-polysaccharide networks.
- Screening: Delivers assay-ready, spatially resolved chemical maps that allow comparison of genetic or treatment-induced changes in cell wall composition.
- Analytics: Generates multivariate outputs that quantify component distribution and co-localization, enabling objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by providing compositional benchmarks for assessing biomass suitability in biofuel or bioproduct pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform applicable across multiple biomass feedstocks and project stages.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by reducing mechanistic ambiguity in biomass recalcitrance.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through defined spectral acquisition and data processing protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in biomass strain or pretreatment development by providing early compositional risk assessment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of biomass targets based on validated structural and compositional profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Raman spectroscopy, multivariate data analysis, and plant tissue handling.
- Dependent on access to confocal Raman microscopes with appropriate laser wavelengths and objectives.
- Necessitates cross-team standardization for sample preparation, sectioning, and data interpretation to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the method to diverse plant species or tissue types with varying cell wall complexity.
- Limited by the need for delignification to resolve cellulose and hemicellulose signals, adding procedural steps and potential variability.
