结合拉曼成像与多元分析可视化植物细胞壁中的木质素、纤维素和半纤维素

本实验的总体目标是介绍一种通过拉曼成像结合多元分析方法，对植物细胞壁中的木质素、纤维素和半纤维素进行可视化的一般性方法。该方法有助于回答植物生物质领域中的关键问题，例如主要化学组分在植物细胞壁中的分布情况。该技术的主要优势在于，仅需极少的样品前处理，即可获得无需人工干预且非破坏性的样品信息。

首先，从植物样品中切取一小块组织。将组织浸入沸腾的去离子水中，持续 30 分钟。随后，立即转移至室温的去离子水中，继续处理 30 分钟。

重复此步骤，直至组织沉入容器底部，表明组织中的空气已被去除且组织已软化。配制20%、50%、70%和90%的PEG与去离子水混合溶液，以及纯PEG溶液。将上述溶液置于65°C条件下保温。

将组织置于浓度梯度递增的聚乙二醇（PEG）溶液中孵育，以置换水分并使PEG渗透。依次在20% PEG中干燥1小时，50% PEG中干燥1.5小时，70% PEG中干燥2小时，90% PEG中干燥2小时，以及100% PEG中干燥10小时。随后，将包埋盒置于65摄氏度的烘箱中预热。

将含有 PEG 的组织块倒入包埋盒中，然后使用预热的镊子或针将其放置在理想位置。缓慢冷却包埋盒，并将组织在室温下保存备用。使用锋利的刀片将含有目标组织的 PEG 块切割成小块。

将小块聚乙二醇（PEG）固定在切片机上，从PEG块中切下薄片。然后，用去离子水在表玻璃皿中冲洗切片10次，以去除组织中的PEG。接着，将切片浸入甲苯和乙醇中6小时，以去除提取物。

在烧杯中加入65 mL去离子水、0.5 mL乙酸和0.6 g氯化钠，混合均匀以配制反应液。取一段样品和3 mL反应液加入5 mL小瓶中。拧紧瓶盖。

然后，将小瓶置于75摄氏度的水浴中加热两小时，以去除组织中的木质素。在表玻璃中用去离子水冲洗切片10次。接着，将未经处理和去木质素的切片转移至玻璃显微镜载玻片上。

使用刷子或针小心地展开切片。用纸巾吸去多余的去离子水。然后将切片浸入重水（deuterium oxide）中。

用玻璃盖玻片覆盖样品。用指甲油密封盖玻片，以防止氘代氧化物蒸发。打开共聚焦拉曼显微镜的仪器操作软件。

打开激光器，使用100倍显微物镜对准晶体和硅的表面进行聚焦。点击校准按钮以校准仪器。将仪器切换至光学显微镜模式，并打开显微镜光源。

将显微镜载玻片放置在载物台上，使盖玻片朝向物镜。使用20倍物镜观察样本，并找到目标区域。切换至浸油物镜。

在盖玻片上滴加浸油，然后聚焦到样品表面。接着将仪器切换至拉曼测试模式，并关闭显微镜光源。使用矩形工具选择映射区域。

调整步长以确定获得光谱的数量。注意，步长应大于物镜数值孔径计算出的光斑直径。小于该值会导致过采样。

根据样本的适用性，设置最佳光谱参数以获得最佳的信噪比和光谱质量，并选择适当的采集时间。通常，在仪器软件中输入以下成像参数：激光波长为532纳米，滤光片为100%a孔径300，狭缝宽度为100，光谱仪为1840 cm⁻¹，刻线为1200T，使用60倍油镜物镜，采集时间为2秒。在进行数据处理前保存光谱数据，并按照文本方案所述，将数据转换为通用格式后再进行数据分析。

此处展示了杨树细胞壁的原始拉曼光谱。两种主要的噪声信号，包括基线漂移和宇宙射线尖峰，与真实信号一同混入了通道中。在进行数据分析之前，应去除这些噪声信号。

可以采用诸如Savitzky-Golay算法或小波算法等降噪技术来消除这些噪声信号。对于木质素成像，应考虑约1600 cm⁻¹处的光谱峰，该峰源于芳香环的对称伸缩振动。对于多糖成像，应使用约2889 cm⁻¹处的光谱峰，该峰由CH和CH₂的伸缩振动引起。

然而，纤维素和半纤维素的拉曼图像无法直接生成。脱木质素是暴露其光谱特征的必要步骤。通常，我们对该方法尚不熟悉。

我们面临困难，因为这需要在样品切片的操作与外观处理以及数据分析方面进行专门训练。观看本视频后，您应能充分理解如何利用原位方法获取有关植物细胞壁的化学信息。在遵循本操作流程的基础上，还可进一步采用其他方法，如化学预处理，以回答更多科学问题，例如植物细胞壁的抗降解性。

尽管该方法可揭示植物细胞壁内部的结构特征及拓扑化学性质，也可应用于其他生物样品。