Summary
Hier beschrijven we een roman diabetische lymfkliertest model met behulp van haarloze muizen voor real-time, niet-invasieve, bewaking van biofilm wond infecties van bioluminescente Pseudomonas aeruginosa. Deze methode kan worden aangepast aan de infectie van andere bacteriesoorten en genetisch gemodificeerde micro-organismen, met inbegrip van meerdere soorten biofilms, evalueren en testen van de werkzaamheid van antibiofilm strategieën.
Abstract
De aanwezigheid van bacteriën als gestructureerde biofilms in chronische wonden, vooral bij diabetische patiënten, wordt verondersteld om te voorkomen dat de wondgenezing en resolutie. Chronische wonden Muismodellen werden gebruikt om te begrijpen van de onderliggende interacties tussen de micro-organismen en de host. De modellen tot nu toe ontwikkeld, is afhankelijk van het gebruik van harige dieren en terminal collectie van wond weefsel voor bepaling van levensvatbare bacteriën. Terwijl belangrijke inzicht heeft opgedaan met deze modellen, dit experimentele procedure vereist een groot aantal dieren en bemonstering is tijdrovend. We hebben een nieuwe lymfkliertest model waarin verschillende optimale vernieuwingen om te evalueren van biofilm progressie in chronische wonden ontwikkeld: een) maakt gebruik van haarloze muizen, eliminerend de behoefte aan de verwijdering van het laserhaar; b) geldt pre-gevormde biofilms aan de wonden waardoor de onmiddellijke evaluatie van de persistentie en het effect van deze gemeenschappen op host; c) controleert de biofilm progressie door het kwantificeren van lichte productie door een genetisch gemanipuleerde bioluminescente stam van Pseudomonas aeruginosa, waardoor real-time bewaking van de infectie, waardoor het aantal dieren per studie vereist. In dit model is een enkele full-diepte wond geproduceerd op de achterkant van de STZ-geïnduceerde haarloze diabetesmuizen en geënt met biofilms van de P. aeruginosa bioluminescente stam Xen 41. Lichtopbrengst van de wonden wordt dagelijks geregistreerd in een in vivo imaging systeem, waardoor in vivo en in situ snelle biofilm visualisatie en localisatie van biofilm bacteriën binnen de wonden. Deze nieuwe methode is flexibel als het kan worden gebruikt voor andere micro-organismen, met inbegrip van genetisch gemodificeerde soorten en multispecifieke biofilms, studeren en van bijzondere waarde in anti-biofilm teststrategieën met inbegrip van antimicrobiële occlusieve verbanden kan zijn.
Introduction
Biofilms zijn complexe gemeenschappen van micro-organismen ingesloten in een matrix van polymere stoffen die zijn gemarkeerd als een bijdragende factor voor de slechte oplossing van chronische wonden1. De studie van deze zeer georganiseerd, persistente microbiële populaties is bijzonder belangrijk voor diabetici, waar slechte circulatie van de ledematen en veranderde perifere sensoriële mechanismen leiden tot onopgemerkt laesies2. In de Verenigde Staten, wordt geschat dat 15% van de diabetespatiënten ten minste één Ulcus in de loop van hun leven ontwikkelt. Dit vertaalt zich naar een economische uitgaven van ongeveer 28 miljard dollar in behandeling3,4, niet te vergeten de immensurable emotionele en sociale lasten. Inzicht in de factoren die het mogelijk maken van microbiële gemeenschappen te volharden in het bed van de wond en de impact van deze biofilms in de helende evenementen is noodzakelijk om te rijden van betere zorg voor de betrokken patiënten en het voortbewegen van de ontwikkeling van nieuwe benaderingen van de behandeling. De oprichting van reproduceerbaar zijn en worden omgezet in vivo modellen voor het verkennen van bacteriële-gastheer interacties staat daarom voorop.
Lymfkliertest modellen hebben met succes ontwikkeld om te bestuderen van de impact van biofilms in chronische wonden. Deze modellen, echter vaak gebruiken haired soorten en evalueren van biofilm goedkeuring door plaat graven voor levensvatbare bacteriële cellen van het verwijderde weefsel van geofferde dieren, waardoor ze tijdrovend en kostbaar.
Een biofotonische alternatief voor de bemonstering van het eindpunt van dieren bij het evalueren van de infectie was voor het eerst voorgesteld door Contag et al. (1995) 5 , die ontwikkelde een methode om vast te leggen van de luminescentie van constitutively bioluminescente Salmonella typhimurium te meten van de effectiviteit van behandeling met antibiotica. Andere studies die profiteren van bioluminescentie uitstotende bacteriën gevolgd. Bijvoorbeeld, Rochetta et al. (2001) 6 gevalideerd een model van de infectie te bestuderen van Escherichia coli dij infecties in muizen door het meten van luminescentie met behulp van een intensievere charge - coupled apparaat en later, Kadurugamuwa et al. (2003) 7 profiteerde van het foton uitstoten van eigenschappen van een gemanipuleerde soort Staphylococcus aureus te onderzoeken van de werkzaamheid van verschillende antibiotica in een katheter wond model in muizen.
De methode die hier gekarakteriseerd presenteert een eenvoudig protocol om te induceren van diabetes in haarloze muizen, produceren en wonden met pre-gevormde bioluminescente biofilms van P. aeruginosa, enten en de uitvoering biofotonische monitoring van de infectie met behulp van een in vivo imaging systeem. Het biedt een directe, snelle, in situ, niet-invasieve en kwantitatieve proces te evalueren van biofilms in chronische wonden en daarnaast staat voor aanvullende analyse zoals microscopische beeldvorming van de genezende wonden, intermitterende bloedinzameling voor cytokine metingen en terminal weefsel collectie voor histologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
dierproeven werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Michigan State University.
1. voorbereiding van occlusieve Dressings en siliconen Spacers
- de transparante occlusief verband knippen om vierkanten ongeveer 1 x 1 cm met een schaar.
- Knippen 10 mm cirkels op een 0,5 mm dikke siliconen blad met een 10 mm biopsy punch. Center een biopsie 5 mm stoot in het midden van de cirkel met een 10 mm en druk op stevig om een gat te formulier maken een " donut "-als de schijf die wordt gebruikt als een splint.
2. proefdieren
- gebruik 8 week oud (22-26 g) mannelijke SKH-1 muizen van een commerciële kweker. Muizen houden in normale omstandigheden van 21 ° C en een 12 h licht-donker cyclus met vrije toegang tot voedsel en water.
- Om diabetes, injecteren muizen intraperitonially met een 13 mg/ml streptozotocin (STZ) solutionand 25% Glucose (250 µl per / mouse) op 5 opeenvolgende dagen.
- De STZ-oplossing maken door verdunnen 65 µg STZ in 5 µL van 100 mM citroenzuur, pH 4.5.
- Het geïnjecteerde volume voor elke muis tot een definitieve massa van 65 mg STZ per 1 kg lichaamsgewicht van de muis aanpassen. Injecteren van controle muizen met 100 mM citroenzuur oplossing pH 4.5 op dezelfde dagen.
- Hyperglykemie door bloed glucose monitoring met een glucometer 14 dagen na de laatste injectie van de STZ bevestigen. Diabetesmuizen wellicht polyurie en zo hun beddengoed wellicht vaker worden veranderd om te elimineren nattigheid en hun gewichten 3 keer per week moeten worden gecontroleerd.
3. Biofilms
- Biofilm voorbereiding
- Grow kolonie biofilms 8 om te enten van de wonden. Twee dagen vóór aanvang van de operatie een overnachting cultuur van bioluminescente P. aeruginosa Xen 41 in al soja Bouillon (TSB) bij 37 ° C geïncubeerd en schudden bij 200 t/min en polycarbonaat membraanfilters met 0,2 µm poriegrootte steriliseren door blootstelling aan UV licht in een biologische veiligheid kap voor 15 min per kant.
- Een dag vóór de ingreep na centrifugeren overnachting cultuur bij 20.000 x g gedurende 2 min en was 3 keer met 1 mL Dulbelcco ' s met fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) door omhoog en omlaag pipetteren.
- Verdund suspensie in DPBS om een extinctie van 0,05 op 600 nm.
- Pipetteer 10 µL van de verdunde cultuur op elk membraan rustend op een al soja agar (TSA) plaat. Na toe te staan om te drogen, Incubeer de membranen bij 35 ° C gedurende 72 uur te groeien biofilms overbrengen naar verse TSA platen elke 24 h.
- Standaard curve
- vóór de aanvang van het experiment maken een standaard curve te correleren bioluminescentie en bacteriële graven.
- Biofilms bereiden zoals beschreven in 3.1.
- Maken seriële verdunningen van biofilms variërend van ½ tot 1/24 door het mengen van biofilm met DPBS en vortexing tot een visueel homogene oplossing wordt geproduceerd. Pipetteer 200µL van de verdunde oplossingen in een zwarte 96-wells-plaat en de afbeelding met de in vivo imaging systeem.
- Verspreiden van plaat verdunningen op TSA platen en Incubeer bij 35 ° C voor 24 h.
- Kolonievormende eenheden (kve) rekenen op platen en maakt een standaard curve te correleren bioluminescentie en bacteriële graven.
4. Operatie wond
- narcose Isofluraan met 95% oxygen/5% CO 2 (ter voorkoming van dood van ketoacidose) op een debiet van 1 L/min induceren en onderhouden van anesthesie met 1-3% Isofluraan. Houden van dieren op warmte matten tijdens chirurgie.
- Zorgen de diep pedaal reflexen van de muis worden onderdrukt door het knijpen van de voet met een pincet en plaatst u de muisaanwijzer in de vatbaar positie.
- Meloxicam (0,2 mg/kg) beheren via sub cutane injectie (30 μl) voor pijnbehandeling.
- Veeg de huid van de rug met 10% Povidon-jodium driemaal en een pad van isopropanol.
- Gebruiken een steriele 4 mm biopsy punch te schetsen van een circulaire patroon voor de wond aan de ene kant van de muis ' s middellijn op het niveau van de schouders. Overzicht van het patroon met een permanent marker.
- Getand pincet gebruiken om te heffen van de huid in het midden van de overzichts- en iris schaar voor het maken van een full-dikte wond die door het subcutane weefsel loopt, met inbegrip van de panniculus carnosus en accijnzen van de circulaire stukje weefsel.
- Een medische waterdichte huid Lijm lijm van toepassing op de huid van de muizen en plaatsen de silicone splint lichte druk uit te oefenen. Dekking van de wond met een transparante occlusief verband. Na de operatie, individueel cage dieren.
5. Postoperatieve Management
- meloxicam (0,2 mg/kg) eenmaal daags via sub cutane injectie voor verlichting van postoperatieve pijn voor de komende 2 dagen beheren.
- Monitor dieren dagelijks voor uitingen van pijn en gewichtsverlies. Diabetische dieren nodig insuline-injecties, toen ze hebben verloren 15% of meer van het lichaamsgewicht.
6. Biofilm entmateriaal voorbereiding en infectie
- beënten muizen 48 h na de operatie zoals beschreven in de volgende stappen.
- Schrapen 72 h biofilms van de membranen met behulp van een steriele spatel, plaatst u deze in een microcentrifuge buis en verdunnen 1:2 in DPBS. Meng door kort op en neer pipetteren.
- Verspreiding plaat entmateriaal op platen van de TSA voor het berekenen van de totale CFU. Om ervoor te zorgen dat de aantallen kloppen, breken de biofilm entmateriaal verder door een reeks van twee 1 min vortexing stappen door een 2 min ultrasoonapparaat stap op 40 kHz in een ultrasone reiniger tussenliggende.
- Verwijderen van de dressing voor de wond en siliconen splint en neem een opname van de wond met een microscoop met bijgevoegde camera met behulp van een liniaal voor referentie.
- Knippen van de toppen van 200 µL Pipetteer tips en Pipetteer 10 µL van het entmateriaal biofilm op elke wond.
- Afbeelding muis met de in vivo imaging systeem met behulp van de automatische instellingen: blootstelling tijd 5-300 s, met middellange weggooien, 1 f/stop open filter en gezichtsveld C (12.9 x 12.9 cm).
- Cover wond met frisse dressing.
7. Opgerolde meting en Imaging
- evaluatie van de klinische symptomen van dieren dagelijks 9.
- Zorgen voor voedsel, water en Wijzig voorzover nodig de kooien.
- Check integriteit van dressings dagelijks. Wanneer de dressing aanwezig is, kan alleen bioluminescentie worden gemeten als gevolg van occlusie van de wond. Op dag 8, dressings worden verwijderd en niet vervangen waardoor meting van wond sluiting.
- Wegen dieren om de andere dag.
- Voor alle dagen, plaatsen van muizen individueel in een isolatie-kamer uitgerust met een HEPA-filter en beeld met behulp van de in vivo imaging systeem dagelijks of om de andere dag tot luminescentie waarden onder achtergrondniveau vallen.
- Na dag 8, induceren van narcose en microfoto van de wond met een microscoop met bijgevoegde camera met behulp van een liniaal voor referentie om de andere dag totdat de wonden worden geheeld.
8. Histologische analyse
- euthanaseren de muizen met een stroom van 2 l/min voor CO 2 in een euthanasie kamer nadat luminescentie onder het niveau van de achtergrond valt en de wonden worden volledig geheeld. Bevestigen van dood door cervicale dislocatie als een tweede methode van euthanasie.
- Iris schaar gebruik te maken van een brede, volledige besnijdenis rond en onder het wond gebied (ongeveer 1 cm in diameter) en het behoud van het weefsel in 4% paraformaldehyde histologische p.a..
- Andere analyse: Cytokine detectie
- retro-orbitally verzamelen van bloed van dieren onder verdoving via een glazen capillaire buis en het overbrengen van EDTA-behandelde buizen.
- Centrifugeren van bloed van 2.000 toeren per minuut gedurende 20 minuten bij 4 ° C en bevriezen van plasma voor detectie van cytokine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bij de ontwikkeling van dit nieuwe model, zien we vele voordelen in gebruik te maken van haarloze SKH-1 over C57BL/6J muizen, die we in het verleden hebben gebruikt. Dieren onderworpen aan STZ injecties normaal ervaren geleidelijke weight loss met het begin van diabetes; echter in de wond o.l.v. genezing experimenten eerder onze laboratoria reproduceren het model gepresenteerd door Dunn et al. (2012) 9 met behulp van C57BL/6J, drastisch gewichtsverlies werd waargenomen (Figuur 1). In tegenstelling, wanneer using zulks wond model met SKH-1 muizen een statistisch significant lagere gewichtsverlies werd waargenomen (P < 0.0001, Mann-Whitney U test). Bovendien geen doden is opgetreden in de diabetische SKH-1 muizen cohort besmet met P. aeruginosa Xen 41 biofilms terwijl een sterftecijfer van 40% werd waargenomen voor C57BL/6J besmette muizen in eerdere experimenten (Figuur 2).
Een ander voordeel aan het hier gepresenteerde model is dat de experimentele procedure voor de haar verwijdering stap verplicht voor C57BL/6J muizen voor de SKH-1 muizen overbodig. Hoewel in onze eerdere experimenten met haired muizen werd speciale aandacht besteed aan het minimaliseren irritatie aan de huid, schade wat onvermijdelijk (Figuur 3). Met name echter is het grootste voordeel van met behulp van haarloze muizen in dit model de afschaffing van het probleem van haargroei waargenomen in de lange termijn wond genezing studies. In onze ervaring met C57BL/6J muizen, haargroei varieert van dier tot dier maar gezien het langetermijnkarakter van de studies, het altijd opgetreden en bemoeid met wond gebied metingen of ontwricht wond spalken en/of verbanden gebruikt ter dekking van besmet wonden, mogelijk resulterend in het drogen van de wond (Figuur 4).
In de SKH-1 wond genezing model, nadat de diabetes is bevestigd, kan chirurgie gemakkelijk worden uitgevoerd als u wilt maken een circulaire volledige-dikte wond op de achterkant van het dier. De siliconen splint is op zijn plaats gehouden door een medische waterdichte huid lijm en vermijdt direct contact van het occlusief verband met het zojuist gemaakte wond bed (Figuur 5).
P. aeruginosa Xen 41 bioluminescente biofilms geteeld op polycarbonaat membranen (Figuur 6) zijn gemakkelijk en aseptisch overgebracht naar een spuit voor levering aan de wonden worden voorbereid en de geënte muizen worden dagelijks gecontroleerd voor klinische tekenen van infectie (Figuur 7). Voor dit model, wij twee fasen uitgevoerd. In de eerste fase, na inoculatie van de biofilm was de wond omgeven door een spalk bedekt met een transparante occlusief verband. Dit resulteert in de accumulatie van pus die de wond geroteerd. Biofilm-bevattende wonden werden dagelijks beeld met de in vivo imaging systeem voor toezicht op ontwikkeling van infectie en beoordelen van de evolutie van de biofilm (Figuur 8 en Figuur 9). Bioluminescentie, geregistreerd als totale flux (p/s), kan worden gecorreleerd met bacteriële dichtheid met behulp van een standaard curve (Figuur 10).
Op dag 8, werden de splint en dressing verwijderd om visualisatie van de wondgenezing. Bioluminescentie daalt vervolgens als gevolg van het verlies van de pus rondom de wond; bacteriën bleef echter gekoppeld aan de wond die door de histologie. Deze aanpak van het verwijderen van de dressing voor het meten van de wondgenezing is gebruikt in andere chronische wonden helen studies (REFs). Wond genezing progressie kan worden bepaald door middel van microfoto met een camera die is aangesloten op een microscoop (Figuur 11).
Figuur 1: verlies van het gewicht van de vergelijkende percentage van SKH-1 en C57BL/6J diabetesmuizen. Dag nul komt overeen met het gewicht op de dag van de laatste (5th) STZ injectie. n = 10 muizen voor SKH-1 en n = 12 muizen voor C57BL/6J. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: percentage overlevingscijfers van SKH-1 en C57BL/6J diabetesmuizen na P. aeruginosa Xen 41 biofilm toepassing (dag 1). n = 5 muizen voor SKH-1 en n = 10 muizen voor C57BL/6J. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Huid snijwonden gewond in de toekomst ruimte na scheren en het gebruik van ontharende room op C57BL/6J muizen. (A): dag van de procedure; (B): 4 dagen na ingreep. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: (A) C57BL/6J muis met een spalk gedeeltelijk verwijderd wond. (B) tillen voor de splint bleek een genezen wond omringd door volwassen opnieuw haar. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: chirurgische procedure voor verwonding SKH-1 muizen. (A) afbakening met biopsie punch; (B) schets van de afbakening; (C) verwonding voltooid; (D) toepassing van medische waterdichte huid lijm; (E) verlijmen splint; (F) wond bedekt met occlusief verband. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: bereiding van het entmateriaal biofilm. (A) 72 h kolonie biofilms van Pseudomonas aeruginosa Xen 41 geteeld op polycarbonaat membranen; (B) meting van biofilm met behulp van een syringe. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: SKH-1 diabetische muis 6 dagen nadat de wond was geënt met de biofilm P. aeruginosa Xen 41. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: Monitoring van biofilm infectie door het bijhouden van bioluminescentie evolutie na verloop van tijd in de SKH-1 diabetesmuizen. (A) dag van de biofilm aanvraag; (B) 5 dagen post-biofilm; (C) 8 dagen post-biofilm; (D) 12 dagen post-biofilm; (E) 16 dagen post-biofilm; (F) 20 dagen post-biofilm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9: Total flux van wonden in de SKH-1 diabetesmuizen besmet met P. aeruginosa Xen 41 biofilms in de loop van het experiment. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 10: geschat KVE per wond met behulp van een standaard curve van bioluminescentie per CFU geproduceerd met P. aeruginosa Xen 41 biofilms. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 11: opname tijdlijn van wonden geïnfecteerd met P. aeruginosa Xen 41 biofilms in diabetische SKH-1 muis toont progressie van genezing. De dagen na de besmetting van de biofilm zijn aangegeven in de linkerbenedenhoek van elke afbeelding. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een nieuw muismodel voor de studie van biofilms in diabetische chronische wonden die heeft vele voordelen om een reproduceerbare, vertaalbare en flexibel model te maken.
De eerste vernieuwing is het gebruik van haarloze muizen. Andere Muismodellen zijn ontwikkeld om te bestuderen van diabetische chronische wond genezing10,11, maar allemaal hebben vertrouwd op het gebruik van haired muizen waarvoor de afschaffing van bont de processen die betrekking hebben op hetzij harsen of haren knippen in combinatie met ontharende crèmes. Deze stap is niet alleen tijdrovend en rommelig maar potentieel verwondt de huid van de dieren in het gebied waar de wond zal worden geplaatst. Terwijl haarloze muizen hebben gebruikt in een reeks van carcinogenese studies12,13, zijn deze muizen niet gebruikt om te evalueren van biofilm persistentie in chronische wonden. Een ander algemeen probleem opgelost door het gebruik van haarloze dieren, met name in lange termijn studies, is haargroei op het gebied van de wond, die kan evaluatie van wondgenezing in gevaar brengt en verstoren verbanden.
SKH-1 dieren bewees ook vatbaar voor STZ-geïnduceerde Type I diabetes en, in vergelijking met C57BL/6J muizen, had statistisch significant lager verlies van het gewicht in de loop van het experiment, toediening van insuline overbodig te maken. Dit is een bijzonder interessante eigenschap als behandeling met insuline kan het resultaat van de infectie zoals blijkt door Watters et al. (2014)14 , die een toename van de bacteriële telt in insuline behandelde diabetes met besmette dieren beschreef potentieel beïnvloeden P. aeruginosa biofilms in vergelijking met geen insuline tegenhangers. Bovendien, in ons model was er een drastische afname van de sterftecijfers in de haarloze cohort waaruit blijkt dat de dieren mogelijk veerkrachtiger bij de behandeling van de infectie.
Een tweede kenmerk van dit model is de toepassing van gemeten pre-gevormde biofilm entmateriaal drijfmest te infecteren de wonden in tegenstelling tot planktonische volwassen cellen. Door het leveren van een reeds metabolisch complexe en gestructureerde bacteriële Gemeenschap aan de wond, de bacteriële cellen kunnen onttrekken aan het immuunsysteem en de onmiddellijke effecten van de biofilms op de laesies kunnen worden bepaald.
Het derde voordeel van dit nieuwe model van de wond is het gebruik van een microbiële stam geschikt voor het produceren van bioluminescentie die kan worden gemeten met een in vivo imaging systeem om ruimtelijk lokaliseren en kwantificeren van de bacteriën. Hierdoor kan de real-time tracking van biofilm evolutie na verloop van tijd. De stam van de Xen 41 P. aeruginosa bezit één stabiele exemplaar van het operon P. luminescences luxCDABE op het bacteriële chromosoom die leidt tot de constitutieve uitstoot van luminescentie, die kan worden onderschept door de uiterst gevoelige camera in het imaging systeem. Met deze functie real-time, niet-invasieve, in situ kunt meten van biofilm door bioluminescentie, zelfs terwijl de splint en dekking in plaats. Deze functie vermindert drastisch het aantal dieren per studie nodig als er geen behoefte om te offeren van dieren op bepaalde tijdstippen is voor de controle van de biofilm. Echter de aanwezigheid van biofilm en pus geroteerd meten wondgenezing. In deze studie, wij verwijderd de dressing op dag 8 zodat de visualisatie van de wondgenezing, maar deze parameter kan worden aangepast afhankelijk van de vragen.
Tot slot, aangezien het imaging systeem voor het opsporen van bioluminescentie tot van 2.5 cm in de diepte, de onlangs voorgestelde model is vatbaar voor het testen van antimicrobiële therapie of in de vorm van oplossing of gels of opgenomen naar occlusieve verbanden. Een real-time infectie controle model biedt een veel grotere flexibiliteit voor het meten van de impact van verschillende doseren concentraties en de duur in tegenstelling tot een statische eindpunt assay. Dit model kan bijdragen tot de validatie van potentiële nieuwe behandelingen uit te roeien biofilms in chronische wonden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs bedank de American Diabetes Association voor de ondersteuning van dit werk (Grant # #7-13-BS-180), de Michigan State University onderzoek ondersteuning Technologiefaciliteit voor het verstrekken van opleidingen en toegang tot de in vivo imaging systeem en de Michigan State University Investigative histopathologisch onderzoek Lab voor de verwerking van de muis biopsieën voor histopathologisch onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Opsite | Smith & Nephew | Model 66000041 | Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards |
| SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr | Charles River Breeding Laboratories | SKH1 | Hairless mice, 8 weeks old |
| Streptozotocin (STZ) | Sigma Aldrich | S0130-1G | Streptozocin powder, 1g |
| AccuChek glucometer | Accu-Chek Roche | Art No. 05046025001 | ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit |
| Pseudomonas aeruginosa Xen 41 | Perkin Elmer | 119229 | Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa |
| Polycarbonate membrane filters | Sigma Aldrich | P9199 | Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size |
| Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D8537 | PBS |
| Tryptic soy agar | Sigma Aldrich | 22091 | Culture agar |
| Meloxicam | Henry Schein Animal Health | 49755 | Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Purdue Products LP | 301879-OA | Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | AAJ61899AK | Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS |
| Capillary glass tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes |
| Silicone to make splints | Invitrogen Life Technologies Corp | P-18178 | Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets |
| Tryptic soy broth | Sigma Aldrich | 22092 | Culture broth |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| IVIS Spectrum Isolation chamber | Perkin Elmer | 123997 | XIC-3 animal isolation chamber |
| HEPA filter | Teleflex | 28022 | Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022 |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-142 | Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50. |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-140 | Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50. |
| Glucose | J.T.Baker | 1916-01 | Dextrose, Anhydrous, Powder |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | Citric Acid |
| Mastisol | Eloquest Healthcare | HRI 0496-0523-48 | Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48 |
| Corning 96-well black plates | Fisher Scientific | 07-200-567 | 96-well clear bottom black polysterene microplates |
| 25 gauge 5/8 inch needle | BD | 305122 | Regular bevel needle |
| Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | N/A | Ultrasonic Cleaner |
References
- James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair Regen. 16 (1), 37-44 (2008).
- Gordois, A., Scuffham, P., Shearer, A., Oglesby, A., Tobian, J. A. The health care costs of diabetic peripheral neuropathy in the US. Diabetes Care. 26 (6), 1790-1795 (2003).
- Reiber, G. E., McDonell, M. B., Schleyer, A. M., Fihn, S. D., Reda, D. J. A comprehensive system for quality improvement in ambulatory care: assessing the quality of diabetes care. Patient Educ Couns. 26 (1-3), 337-341 (1995).
- Driver, V. R., Fabbi, M., Lavery, L. A., Gibbons, G. The costs of diabetic foot: The economic case for the limb salvage team. J Vasc Surg. 52 (Suppl 3), 17S-22S (2010).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
- Rocchetta, H. L., et al. Validation of a noninvasive, real-time imaging technology using bioluminescent Escherichia coli in the neutropenic mouse thigh model of infection. Antimicrob Agents Chemother. 45 (1), 129-137 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Rapid direct method for monitoring antibiotics in a mouse model of bacterial biofilm infection. Antimicrob Agents Chemother. 47 (0066-4804), 3130-3137 (2003).
- Anderl, J. N., Franklin, M. J., Stewart, P. S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 44 (7), 1818-1824 (2000).
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. ILAR J. 41 (2), 80-86 (2000).
- Dunn, L., et al.
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge - a model for the study of chronic wounds. Wound Repair Regen. 18 (5), 467-477 (2010).
- Holley, A. K., Xu, Y., Noel, T., Bakthavatchalu, V., Batinic-Haberle, I., St. Clair, D. K. Manganese superoxide dismutase-mediated inside-out signaling in HaCaT human keratinocytes and SKH-1 mouse skin. Antioxid Redox Signal. 20 (15), 2347-2360 (2014).
- Abbas, S., Alam, S., Pal, A., Kumar, M., Singh, D., Ansari, K. M. UVB exposure enhanced benzanthrone-induced inflammatory responses in SKH-1 mouse skin by activating the expression of COX-2 and iNOS through MAP kinases/NF-ĸB/AP-1 signalling pathways. Food Chem Toxicol. 96, 183-190 (2016).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infect Immun. 82 (1), 92-100 (2014).
