我们描述了一种方法，用于鉴定人源或鼠源单克隆抗体结合甲型流感病毒血凝素所必需的关键残基。该方案可适用于其他病毒表面糖蛋白及其相应的中和抗体。
本文内容
摘要
摘要
流感病毒具有显著的适应性和逃避免疫应答的能力。其中一种方式是通过病毒表面糖蛋白发生抗原性改变。逃逸突变株的产生是阐明病毒如何逃避免疫识别以及鉴定抗体结合所必需的关键残基的有力方法。本文介绍了一种利用靶向病毒血凝素（HA）的人源或鼠源单克隆抗体（mAbs）来生成甲型流感病毒逃逸突变株的实验方案。通过应用本技术，我们先前已鉴定了针对新型禽源H7N9 HA头部或茎部的抗体结合所必需的关键残基。该方案可轻松适用于其他病毒系统。对逃逸突变株的分析对于模拟抗原漂移、确定赋予耐药性和病毒适应性的单核苷酸多态性（SNPs），以及疫苗和/或治疗药物的设计具有重要意义。
引言
与其他RNA病毒类似，甲型流感病毒具有易出错的聚合酶，可在每轮复制过程中产生大量抗原变异体1,2,3。甲型流感病毒可通过抗原漂移机制惊人地适应并逃逸人体免疫应答，该过程由表面糖蛋白上的突变累积引起，导致抗体结合能力丧失。病毒表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原漂移使得每年必须重新配制并接种流感疫苗。
抗原特异性抗体分离与制备技术的进步，已成功获得大量疫苗诱导的单克隆抗体（mAb）4,5,6,7,8。反过来，对广泛中和甲型流感病毒的单克隆抗体表位进行表征，极大地推动了多种通用流感疫苗候选物的研发9,10,11,12,13,14。阐明单克隆抗体的抗原足迹，有助于揭示中和作用的结构决定因素，并为疫苗设计提供科学依据。然而，通过X射线晶体学或冷冻电子显微镜对大量单克隆抗体进行结构表征以绘制病毒抗原上的表位图谱，对于实验室而言既不现实，也不具备成本效益15,16,17,18。
X射线晶体学或冷冻电子显微镜技术需要昂贵的设备、专门的技术，且可能耗费大量时间才能获得数据。一种替代且更快速的方法是利用易错的RNA依赖性RNA聚合酶快速产生多样化的病毒群体，从而生成逃逸突变体，以确定单克隆抗体（mAbs）的表位19,20,21,22,23。逃逸变异体的生成无需任何特殊设备或技术，仅使用常规实验室试剂和设备即可完成。
本文介绍一种方法，可用于绘制识别流感病毒HA的单克隆抗体（mAb）结合所必需的关键残基图谱。
方案
警告：在人类群体中传播的多种流感病毒（例如，H1、H3）属于生物安全等级2级的病原体，必须谨慎操作并使用适当的个人防护装备。病毒操作必须经机构审查委员会批准。以下方案已获西奈山机构审查委员会批准。
注意：特异性针对血凝素（HA）且能抑制病毒复制的抗体通常可分为两类：i）结合于球状头部顶端受体结合位点上或其邻近区域的抗体；ii）结合于远离受体结合域的区域，包括球状头部侧面及HA茎部区域的抗体。靶向受体结合位点的抗体可阻止靶细胞表面唾液酸基序的结合，其活性可通过血凝抑制（HI）实验进行检测。而诸如靶向茎部的HI阴性抗体，尽管仍可抑制病毒复制，但只能通过中和实验进行评估。
1. 基于 HI 和中和活性对抗体进行分类
- 血凝抑制试验
- 在96孔V型底板中，加入 25 µL 在第2至第12列上加入1x PBS。
- 稀释单克隆抗体 7B2（头部特异性）和 6F12（茎部特异性）23 同型对照 100 µg/mL 在1x PBS中分装 50 µL 将稀释后的抗体溶液加入第1列。同时通过添加不含单克隆抗体的对照组 50 µL 1× PBS 溶液图1A).
- 对抗体进行2倍系列稀释，通过转移 25 µL 从第1列到第2列，依此类推。弃去最后的 25 µL 从第12列（图1A).
注意：务必包含一排无抗体对照。 - 将病毒储备液（一种重配病毒，表达 A/California/04/09 的 HA 和 NA，以及 A/Puerto Rico/8/34 的内部基因片段）稀释至 8 血凝单位/25 µL 稀释的病毒原液。加入 25 µL 将稀释后的病毒原液（8个血凝单位）加入各孔（A至G行）。
注意：抗体与病毒混合物的终体积应为 50 µL 起始终浓度为 50 µg/mL. - 将培养板在室温（RT）下孵育 45 分钟。
- 对于返滴定行（H），添加 50 µL 向 H2 至 H12 孔中加入 1× PBS。添加 100 µL 8血凝单位的25 µL 至 H1 孔。通过转移进行两倍系列稀释 50 µL 从 H1 到 H2，依此类推。弃去最后一个 50 µL 来自 H12 孔。最后，加入 50 µL 向96孔V型底板的所有孔中加入0.5%鸡红细胞（RBC）。
注意：检测中的单克隆抗体样品最终体积应为 100 µL：单克隆抗体（mAb）25 µL），病毒（25 µL）和红细胞（RBC）50 µL）。无 mAb 对照的最终体积应包含 25 µL 1× PBS 溶液 25 µL 病毒的 50 µL 红细胞 - 将培养板置于恒温孵育 4 °C 1 小时。
- 目视读取血凝抑制（HI）活性的平板结果。若某特异性抗体呈阳性反应，则进入步骤2.1以生成逃逸突变株。若该抗体为HI阴性，则进入下述步骤1.2，通过细胞培养实验评估该抗体是否具有中和活性。
注意：HI 活性单克隆抗体的阳性读数表现为孔中心出现深红色的红细胞沉淀图1B；7B2）当96孔V型底板倾斜时将形成泪滴状液滴 45° 角度。阴性结果不会在孔中形成深红色的红细胞沉淀图1B6F12 且无单克隆抗体）。同型对照也不会形成深红色的红细胞沉淀，其外观应与茎特异性抗体6F12或无单克隆抗体对照样本相同（图1B)23.
- 微量中和试验
- 以 2 x 10 的密度接种Madin Darby犬肾（MDCK）细胞4 细胞/孔，置于经组织培养处理的96孔板中，于 37 °C 和5% CO2 17至19小时。
注意：细胞也可在使用前于孔板底部贴壁孵育至少4 h。 - 在另一个96孔板中，对人源单克隆抗体4D05进行7次3倍连续稀释5CR911417 或同型IgG对照，起始浓度为 200 µg/mL 在添加了经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）处理的胰蛋白酶的1倍最低必需培养基（MEM）中1 µg/mL) (图2).
注意：A 行应包含 75 µL 稀释抗体（起始浓度 200 µg/mL）。通过转移在孔板中进行连续稀释（3倍稀释） 25 µL 从 A 行到 B 行，依此类推。A 行至 H 行的最终体积应为 50 µL无需在稀释转移过程中更换吸头。 - 将病毒原液（含有A/Shanghai/1/13的HA和NA基因以及A/Puerto Rico/8/34的内部基因片段的重配病毒）稀释至100个50%组织培养感染剂量（TCID₅₀）50)/50 µL 在添加了TPCK处理的胰蛋白酶的1x MEM中1 µg/mL)24添加 50 µL/well 将稀释后的病毒加入抗体样本（步骤 1.2.2）。添加 50 µL 向未感染细胞的对照孔中加入1X MEM。
- 孵育病毒-抗体混合物 37 °C 培养箱（含5% CO₂）2）孵育1小时。
注意：病毒-抗体混合物的总体积应为 100 µL: 50 µL 抗体稀释（步骤1.1.2）及 50 µL 含100 TCID的病毒50 (步骤 1.2.3) - 吸出孔中的培养基，并加入全部 100 µL 将病毒-抗体混合物加入相应的孔中。
注意：使用连接真空泵的8通道吸液适配器进行吸液。 Alternatively，也可使用8通道或12通道多通道移液器手动吸液。在去除接种物或洗涤过程中，所有吸液操作均从抗体最高浓度向最低浓度方向进行，无需更换吸头。 - 用单层洗涤 200 µL 1×PBS。吸除 200 µL 用1×PBS（同1.2.5步骤）再重复洗涤一次，共洗涤两次。
- 感染MDCK细胞单层，加入全部 100 µL/well 将病毒-抗体混合物（来自步骤 1.2.4）加入单层细胞中，并进行感染/孵育 37 °C （含 5% CO₂）2) 孵育1小时。
- 在感染期间，在另一块96孔板中配制另一组抗体稀释液。加入 150 µL 的 100 µg/mL 相应抗体的 100 µL 含 TPCK 处理的胰蛋白酶的 1x MEM1 µg/mL) 至 B 至 H 行。通过转移进行 3 倍稀释 50 µL 从 A 行到 B 行，依此类推，直至 H 行。弃去最后一个 50 µL 从H行。每个孔的总体积应等于 100 µL. 暂时放置。
注意：抗体用添加了经TPCK处理的胰蛋白酶的1x MEM稀释1 µg/mL). - 吸弃第1.2.7步单层细胞中的病毒-抗体接种液，并全部补充新鲜培养基 100 µL/well 在步骤1.2.8中配制的适当抗体稀释液
注意：如果某孔中的终抗体浓度为 100 µg/mL 感染期间（步骤 1.2.7），补充的培养基中也应含有终浓度为 100 µg/mL （步骤 1.2.8） - 孵育24 h于 37 °C 培养箱（含5% CO₂）2).
- 吸出96孔板中的培养基，并用 200 µL/well 用1×PBS洗涤3次。
- 用固定液固定细胞 100 µL -20°C 下用预冷的 80% 丙酮固定 1 小时20 °C.
注意：80% 丙酮溶液用双蒸水（dd H₂O）稀释。2O (例如，80 mL 100% 丙酮加 20 mL ddH₂O20). 使用前可将80%的丙酮溶液置于冰上预冷。 - 洗涤细胞 200 µL/well 用1×PBS洗涤3次。
- 用封闭液封闭酶标板 200 µL/well 加入5%脱脂奶粉（用1×PBS稀释），室温孵育板孔1小时。
- 添加 100 µL 加入用1×PBS/1%牛血清白蛋白（BSA）按1:2,000稀释的生物素化抗甲型流感病毒核蛋白（NP）一抗，室温孵育1小时。
注意：对于乙型流感病毒，应使用针对乙型流感病毒NP蛋白的特异性抗体。 - 用 1× PBS 洗涤平板三次。
- 添加 100 µL 加入以1×PBS/1% BSA稀释的链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）偶联抗体（1:3,000），于室温孵育1 h。
- 洗涤平板 200 µL 用1×PBS洗涤三次。
- 加入HRP底物试剂 100 µL/well 并在室温下避光孵育。
注意：在加入酸性终止缓冲液（见下文）之前，应优化孵育时间。一般而言，15 至 30 分钟已足够。 - 用……淬灭反应 50 µL/well 5 M HCl
警告：5M 盐酸是一种强腐蚀性试剂，可对眼睛、皮肤和黏膜造成损伤。添加该试剂时应在通风橱内进行，并佩戴适当的个人防护装备。 - 在492 nm处读取各孔吸光度，并减去背景（未感染细胞）孔的数值。
- 使用以下公式计算抑制率百分比：
- 如果抗体具有中和活性（且无血凝抑制活性），则进行步骤 2.2。
注意：缺乏以下特征的抗体 体外 中和活性将缺乏血凝抑制活性。
- 以 2 x 10 的密度接种Madin Darby犬肾（MDCK）细胞4 细胞/孔，置于经组织培养处理的96孔板中，于 37 °C 和5% CO2 17至19小时。
2. 逃逸突变体变种的产生
注意：具有或不具有血凝抑制活性的中和抗体将通过下述特定方案进一步分析。
- 方案1：血凝抑制阳性/中和阳性抗体（图3A)
- 制备10的病毒原液6 斑块形成单位/毫升（PFU/mL）置于1×PBS中 400 µL 体积
- 将目标抗体用递增浓度制备四个稀释度（例如，0、0.5、0.05 和 0.005 mg/mL）溶于 1x PBS，体积为 100 µL 每稀释度
注意：野生型病毒应始终在无抗体存在的情况下平行传代培养。这些传代病毒的序列将有助于区分病毒对细胞培养条件的适应性突变与逃逸突变。 - 混合 100 µL 10 的6 病毒的PFU/mL 100 µL 每种抗体稀释液 100 µL 1× PBS 溶液
- 孵育1小时 37 °C 培养箱（含5% CO₂）2。涡旋振荡片刻。注射 200 µL 将每种混合物接种至无特定病原体（SPF）的鸡胚中。
- 将卵在指定条件下孵育 37 °C （不含CO）240–44 小时
- 通过孵育使感染病毒的鸡胚死亡 4 °C 至少 6 h。
- 按照先前所述方法收集尿囊液24,25.
- 按照上述方法进行血凝试验24,26如果所有尿囊液样本均无血凝滴度，则从第2步开始重复实验，抗体稀释浓度范围为0.005 mg/mL至0.00005 mg/mL。
注意：HI阳性抗体的饱和浓度可能会中和存在的所有病毒颗粒。因此，可能需要减少传代过程中抗体的用量。 - 通过血凝抑制试验确认逃逸变异株24 （步骤 1.1）
注意：HI 活性抗体可阻断病毒血凝素（HA）与靶细胞表面唾液酸基序的结合。因此，当存在相应抗体时，病毒失去凝集红细胞（RBC）的能力（可见红细胞沉淀）。理论上，能够逃逸 HI 活性抗体的变异病毒即使在相应抗体存在的情况下仍可结合唾液酸基序，从而仍能引起红细胞凝集（无红细胞沉淀）。如果目标抗体的 HI 活性仍可检测到，请从步骤 2.1.2 重新开始实验，并提高抗体的起始浓度。
- 方案2：HI阴性/中和阳性抗体（图3B)
注意：为了产生针对无血凝抑制（HI）活性的中和抗体的逃逸变异株，必须在抗体浓度逐步增加的条件下对病毒进行连续传代。- 将 MDCK 细胞以 1 x 10⁵ 的密度接种于 6 孔板中6 细胞/孔，并在37°C、5% CO₂培养箱中孵育至少4小时 37 °C 培养箱（含5% CO₂）2).
- 将病毒原液稀释至 106 PFU/mL 或前一代病毒，溶于含 TPCK 处理的胰蛋白酶的 1× MEM 中1 µg/mL) 在一个 500 µL 体积
- 在含TPCK处理的胰蛋白酶的1×MEM中，配制抗体的单次稀释液（原始传代为0.02 mg/mL，后续所有传代可使用更高浓度） 250 µL 体积
- 混合 250 µL 稀释病毒液 250 µL 稀释抗体（+抗体）或 250 µL 1× MEM（无抗体对照）
- 将病毒-抗体混合物在37°C下孵育30分钟 37 °C 培养箱（含5% CO₂）2).
- 使用玻璃巴斯德吸管吸去培养基，并用 1 mL 1× PBS 洗涤细胞单层。
- 添加 500 µL 将混合物加入各孔中，并在培养箱中孵育 37 °C 培养箱（含 5% CO21小时。
- 孵育1小时后，向各孔中补充2 mL含TPCK处理的胰蛋白酶的1×MEM培养基1 µg/mL).
- 在显微镜下观察感染后48小时的细胞，检查细胞病变效应（CPE）迹象，或进行血凝试验以检测病毒增殖26.
- 如果添加抗体的培养物中出现明显的细胞病变效应（CPE），则将上清液分装至多个冻存管中，标记传代次数后于 -80 °C 保存。80 °C.
- 保存 100 µL 取上清液，用含 TPCK-胰蛋白酶和抗体的 2 mL 1x MEM 感染新鲜的 MDCK 单层细胞。每次传代均需设置无抗体对照。
注意：在下一次传代（每两天一次）时，将抗体浓度增加一倍（或根据研究人员的判断进行调整）。 - 逐步提高每次传代中抗体的浓度，直至病毒在抗体终浓度为0.6 mg/mL时仍能维持有效增殖。将每次传代的上清液分装至多个冻存管中，冻存并置于-80°C保存。80 °C.
注意：无抗体对照对于验证病毒从一个传代到另一个传代的生长情况至关重要。若无抗体对照组出现明显的细胞病变效应（CPE），而加抗体组未出现CPE，则表明抗体浓度过高，未产生逃逸变异株。若无抗体对照组出现明显的CPE，而加抗体组仅出现中度CPE，则提示可能存在潜在的逃逸变异株。在下一轮传代中，应增加传代体积。 200 µL 上清液的浓度，并保持抗体浓度，以提高获得逃逸突变体的可能性。
3. 通过噬斑纯化分离逃逸变异株
- 以每孔 1 × 106 个细胞的密度将 MDCK 细胞接种于 6 孔板中，在 37 °C 培养箱（含 5% CO2）中孵育至少 4 小时。
- 在 250 µL 体积的 1×MEM 中稀释抗体，并加入 TPCK 处理的胰蛋白酶，起始浓度为 300 µg/mL，然后与 250 µL 相应的逃逸突变病毒混合。未加抗体传代的病毒也应进行空斑纯化。
- 吸去细胞培养液，用 1×PBS 洗涤三次，然后加入全部 500 µL 病毒-抗体混合液（步骤 3.2）。
- 将培养板置于 37 °C 培养箱（含 5% CO2）中孵育 1 小时，每隔 10 分钟轻轻前后摇动一次，以防止单层细胞干燥。
- 吸去病毒-抗体混合液，补充含有相应抗体浓度（300 µg/mL；步骤 3.2）的覆盖琼脂培养基至各孔中。
- 将培养板在 37 °C 培养箱（含 5% CO2）中孵育 40–44 小时。
- 使用蓝色或黑色标记笔圈出可见的空斑，以便于挑选空斑。
- 针对每种逃逸突变病毒-抗体组合，挑选四个空斑；同时挑选在 MDCK 细胞或鸡胚中无抗体条件下传代的野生型病毒空斑。
- 将挑出的空斑重悬于 100 µL 的 1×PBS 中。
- 将全部 100 µL 空斑纯化的逃逸突变病毒注射至 10 日龄 SPF 鸡胚中。
- 将鸡胚在 37 °C 培养箱中孵育 40–44 小时（不加 5% CO2）。
- 进行血凝试验以确认病毒的存在（步骤 1.1）。
4. 病毒RNA的提取及HA序列变异分析
- 使用苯酚与异硫氰酸胍的单相溶液从200 µL逃逸突变病毒羊水液中提取病毒RNA。
警告：苯酚是一种挥发性液体试剂，接触后可能引起咳嗽、呼吸急促，并对皮肤产生中度刺激。 - 利用逆转录酶和流感病毒A型HA片段特异性引物，扩增病毒RNA中的HA片段27。
注：表2中描述的流感病毒B型通用引物可同时扩增HA（约1,800 bp）和NA（约1,500 bp）28。 - 将RT-PCR产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳分离，并切下大小正确的条带（约1,800 bp）。
- 采用基于二氧化硅膜的纯化方法从凝胶中回收PCR产物，并将cDNA送测序。
- 通过比较假定逃逸突变体与传代野生型病毒中存在的突变，区分因细胞培养适应或免疫选择而产生的变异，从而确定抗体结合所必需的氨基酸残基。
- 将含有野生型或逃逸突变型HA的PCR产物克隆至pCAGGs表达载体中（NotI和NheI位点）。
- 可通过下述两种方法之一（或两者同时）评估抗体对逃逸突变型HA的结合能力。
5. 逃逸突变株的抗体结合分析
- 免疫荧光
- 将293T细胞以每孔2 × 104个细胞的密度接种于96孔板中，在37 °C培养箱（含5% CO2）中孵育24小时。
- 使用转染试剂，将编码逃逸突变HA、病毒传代HA和野生型HA（未传代）的pCAGGS质粒以每孔0.10 µg的量转染细胞。
- 将96孔板在37 °C培养箱（含5% CO2）中继续孵育48小时。
- 在室温下用100 µL的0.5%多聚甲醛固定15分钟。
注意：多聚甲醛是一种挥发性液体试剂，可能引起咳嗽、呼吸急促，并通过接触对皮肤产生中度刺激。已被列为潜在的人类致癌物。添加该试剂时应在通风良好的化学通风橱中进行。 - 用1× PBS洗涤三次。在含5%脱脂奶粉的1× PBS中室温封闭1小时。
- 用1× PBS洗涤三次。加入目标一抗（终浓度为5 µg/mL），室温孵育1小时。
- 加入100 µL二抗（抗人或抗小鼠Alexa 488），按1:2,000比例稀释于1× PBS/1% BSA中，室温避光孵育1小时。
- 用1× PBS洗涤三次。在荧光显微镜下观察细胞的阳性或阴性染色情况。
- 荧光激活细胞分选（FACS）
- 将293T细胞以每孔2 × 105个细胞的密度接种于6孔板中，在37 °C（含5% CO2）条件下孵育24小时。
- 使用转染试剂，将编码逃逸突变HA、仅病毒传代HA和野生型HA的pCAGGS质粒以每孔0.50 µg的量转染细胞。
- 将6孔板在37 °C（含5% CO2）条件下孵育48小时。
- 48小时后，吸除培养基，用1× PBS轻柔洗涤两次（确保单层细胞不受扰动）。
- 用500 µL FACS缓冲液（1× PBS/2%胎牛血清）收集转染后的293T细胞。
备注：FACS缓冲液使用前应预冷至4 °C。 - 在4 °C下以300 × g离心5分钟。
- 吸除FACS缓冲液，用含目标单克隆抗体（终浓度为1至5 µg/mL）的200 µL FACS缓冲液重悬细胞，室温孵育20分钟。
- 在4 °C下以300 × g离心5分钟。用500 µL FACS缓冲液洗涤两次，使用玻璃巴斯德移液管小心吸除上清，避免扰动细胞沉淀。
- 用含Alexa 488标记二抗的200 µL FACS缓冲液重悬细胞（终稀释比为1:1,000），在4 °C避光孵育20分钟。
- 在4 °C下以300 × g离心5分钟。用500 µL FACS缓冲液洗涤两次，并小心吸除洗涤液。
- 用500 µL FACS缓冲液重悬细胞，通过FACS检测单克隆抗体和/或多克隆血清与表达HA的转染细胞之间的结合情况。
备注：实验中应包括无单克隆抗体/多克隆血清的对照组以及未转染的样本对照组。
结果
我们此前已使用该方法的多种变体，以产生针对季节性流感病毒疫苗、H7N9疫苗或连续DNA/重组HA蛋白疫苗所诱导的人源和鼠源单克隆抗体（mAb）的逃逸突变株4,5,6,7。如上所述，首先通过血凝抑制（HI）和微量中和实验对抗体进行表征，以指导我们选择后续采用的具体实验方案4,5。抗体07-5D03、07-5F01、07-5G01、07-4B03、07-4E02和07-4D05被发现对禽源H7N9病毒（A/Shanghai/1/2013）具有HI活性和中和活性（表1），因此采用方案1（步骤2.1）。对于具有中和活性但缺乏HI活性的单克隆抗体，例如41-5E04、045-051310-2B06、042-100809-2F04和S6-B01（表1），则采用方案2（步骤2.2）来生成逃逸突变株。逃逸突变体定位分析显示，许多抗体识别病毒HA蛋白不同位置上的关键残基4,5（图4）。尽管大多数HI阳性抗体的逃逸突变残基位于H7 HA已报道的抗原位点附近，而HI阴性抗体产生的逃逸突变体则在HA茎区出现点突变4,5。
| 抗体 | HI 活性 | NEUT 活性 |
| 07-5D03 | + | + |
| 07-5F01 | + | + |
| 07-5G01 | + | + |
| 07-4B03 | + | + |
| 07-4E02 | + | + |
| 07-4D05 | + | + |
| 41-5E04 | - | + |
| 045-051310-2B06 | - | + |
| 042-100809-2F04 | - | + |
| S6-B01 | - | + |
表1： 抗体HI及中和活性表 从接种实验性H7N9疫苗的个体中分离出的十种H7特异性单克隆抗体表现出不同特性 体外 抗病毒活性5.
| 上游引物 (5' 至 3') | 下游引物 (5' 至 3') | PCR扩增条件 | ||||||||
| IAV | TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG | ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT | 42 ºC 反应 60 分钟，94 ºC 预变性 2 分钟；5 个循环：94 ºC 变性 20 秒，50 ºC 退火 30 秒，68 ºC 延伸 3 分 30 秒；随后 40 个循环：94 ºC 变性 20 秒，58 ºC 退火 30 秒，68 ºC 延伸 3 分 30 秒；最后 68 ºC 延伸 10 分钟 | |||||||
| IBV | GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC | CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC | 45 ºC 反应 60 分钟，55 ºC 反应 30 分钟，94 ºC 预变性 2 分钟；5 个循环：94 ºC 变性 20 秒，40 ºC 退火 30 秒，68 ºC 延伸 3 分 30 秒；随后 40 个循环：94 ºC 变性 20 秒，58 ºC 退火 30 秒，68 ºC 延伸 3 分 30 秒；最后 68 ºC 延伸 10 分钟 | |||||||
表2：通用流感病毒引物。 用于扩增甲型27和乙型28流感病毒HA片段的引物对及其相应的热循环仪反应条件。
图1：血凝抑制（HI）试验。（A）使用96孔V型底板对两种小鼠H1特异性单克隆抗体7B2（靶向头部）和6F12（靶向茎部）进行HI试验的设置示意图；（B）HI试验结果示例23。请点击此处查看该图的高清版本。
图 2：微量中和试验。 建立微量中和试验的示意图，用于检测两种人源单克隆抗体 4D055 和 CR911417 的活性。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：逃逸突变体的产生。 所建议的方法取决于抗体所表现出的血凝素抑制（HI）活性和微量中和活性。针对（A）中和性HI阳性抗体的逃逸突变体可能只需在鸡胚中传代一次，而针对（B）中和性HI阴性抗体的逃逸突变体则可能需要在细胞培养中进行多次传代，并逐步增加抗体用量。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：利用逃逸突变体构建的新型禽流感H7N9血凝素（HA）表位图示例。 从接种H7N9流感病毒候选疫苗的个体中分离出疫苗诱导的抗体，并用于生成逃逸突变体。每个以红色标示的残基代表对单克隆抗体（mAb）高效结合至关重要的氨基酸位点。数据改编自Dunand-Henry et al., 20154。 请点击此处查看该图的高清版本。
讨论
尽管通过逃逸突变体鉴定出的大多数残基是准确的，但该方法的一个主要局限在于，逃逸突变体中的点突变未必位于抗体分子结合区域之内，而该区域通常由结构分析确定。这是因为特定残基的突变可能引起远离突变位点的构象变化，类似于变构效应。另一个局限是，该方法仅适用于中和抗体；对于缺乏中和活性的抗体则无法应用 体外 选择性压力不会导致逃逸突变体的产生。然而，通过使用一组由先前已表征的中和抗体诱导产生的逃逸变异体，可以克服这一局限性。Tan 等 利用H7N9病毒中和性单克隆抗体的一个逃逸突变体，来定位非中和性抗体的表位7.
尽管如此，通过产生逃逸突变体来解析抗体的表位，为晶体学和冷冻电子显微镜提供了一种可行的替代方案，而这两种方法均需要大量设备投入。其他替代方法包括利用丙氨酸扫描或肽段扫描/截短突变体来确定单克隆抗体的最小结合区域。丙氨酸扫描突变可能需要在筛选过程中构建大量突变体，工作量较大。29，而肽段扫描仅限于线性表位30本方案中所述方法无需特殊设备或技术，实际上利用了现有的 体外 为生成目标抗体逃逸变异体而改良的中和实验。
需要多次传代以产生逃逸突变株的实验方案（例如，茎部特异性抗体）的效果在很大程度上取决于第0代中抗体的起始浓度。为稳妥起见，建议从比抗体半数最大抑制浓度低一个对数或半个对数的浓度开始，以确保病毒能够有效增殖。研究者可以推测，在低免疫压力下产生的高滴度病毒培养物，其病毒群体将具有较大的遗传变异。通过在后续传代中逐步提高抗体浓度，可筛选出逃逸突变株。如果出现病毒增殖减少的情况，可在下一次传代中增加病毒上清液的用量，同时保持与前一次传代相同的抗体浓度。
多数通用流感疫苗的目标是诱导针对血凝素（HA）茎区的强效抗体反应。对茎区特异性抗体逃逸变异体的分析，对于明确流感病毒适应性与免疫压力之间关系具有重要意义。有趣的是，由茎区特异性单克隆抗体诱导产生的逃逸突变病毒均表现出减毒特性 体内 在小鼠LD中50 研究4这些研究为基于茎部的疫苗接种平台提供了有力证据。此外，本方案还可用于鉴定针对其他抗病毒化合物（如小分子抑制剂）的逃逸突变体。最后，该方法不仅限于流感病毒表面糖蛋白，还可更广泛地应用于确定其他病毒糖蛋白的表位。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本项目部分资金来自美国卫生与公共服务部、美国国立卫生研究院、国家过敏与传染病研究所的联邦基金，资助编号为CEIRS合同HHSN272201400008C（F.K.）；NIH U19AI109946-01（F.K.）；以及P01AI097092-04S1（P.E.L.）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 带盖 Falcon 96 孔透明平底 TC 处理培养微孔板 | Corning, Inc. | 353072 | 用于微量中和试验的检测板 |
| Falcon 96 孔透明 V 型底板 | Corning, Inc. | 353263 | 用于血凝抑制试验的检测板 |
| 1X 最小必需培养基（MEM） | Gibco | 11095080 | 感染用培养基 |
| 甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲烷（TPCK）处理的胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T8802 | 将不成熟的 HA0 切割为 HA1 和 HA2 |
| 生物素化抗 NP 一抗（IAV） | EMD Millipore | MAB8258B | 识别甲型流感病毒 NP 蛋白的抗体 |
| 生物素化抗 NP 一抗（IBV） | EMD Millipore | MAB8260B-5 | 识别乙型流感病毒 NP 蛋白的抗体 |
| 链霉亲和素-HRP 抗体 | EMD Millipore | 18-152 | 用作生物素化抗 NP 抗体的二抗 |
| HRP 底物（SIGMAFAST-OPD） | Sigma-Aldrich | P9187-5SET | 水溶性邻苯二胺二盐酸盐 HRP 底物 |
| 96 孔 V 型底板 | Nunc | 249662 | 用于血凝试验的检测板 |
| 鸡红细胞 | Lampire Biological Laboratories | 7201403 | 用于评估流感病毒的凝集能力 |
| TRIzol | Ambion | 15596026 | RNA 提取 |
| Superscript III | Invitrogen | 12574018 | 逆转录酶 |
| 凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28704 | 扩增 PCR 产物的分离 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | 转染试剂 |
| 抗人 IgG（H+L）Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11013 | 人源抗体的荧光二抗 |
| 抗小鼠 IgG（H+L）Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 鼠源抗体的荧光二抗 |
| 6 孔聚苯乙烯微孔板 | Corning, Inc. | 353934 | |
| UltraPure 琼脂糖 | Invitrogen | 16500500 | |
| Nalgene 长期储存冻存管 | ThermoFisher Scientific | 5012-0020 | 病毒培养上清液的冷冻保存 |
| 重配株 A/California/04/09 (H1) | Palese 实验室 | 表达 A/California/04/09 (H1N1) 的 HA 和 NA 蛋白，并携带 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) 内部基因片段的重配病毒 | |
| 重配株 A/Shanghai/1/13 (H7) | Palese 实验室 | 表达 A/Shanghai/1/13 (H7N9) 的 HA 和 NA 蛋白，并携带 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) 内部基因片段的重配病毒 | |
| 牛血清白蛋白溶液（35%） | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| Qiagen 凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28704 | 基于硅胶膜的 DNA 片段纯化 |
参考文献
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