De neuropéptido Y-pHluorin de la proyección de imagen confocal: una técnica para visualizar la exocitosis de gránulos de insulina en islotes humanos y murinos intactos
Summary
Se describe un protocolo para la visualización de exocitosis de la insulina en los islotes intactos usando pHluorin, una proteína verde fluorescente sensible al pH. Islotes aislados están infectados con adenovirus codificación pHluorin acoplado al carga vesícula del neuropéptido Y. Esto permite la detección de eventos de fusión de gránulos de insulina mediante microscopía confocal.
Abstract
La secreción de insulina juega un papel central en la homeostasis de la glucosa bajo condiciones fisiológicas normales, así como en la enfermedad. Enfoques actuales para el estudio de exocitosis de gránulos de insulina utilice electrofisiología o microscopía juntada a la expresión de reporteros fluorescentes. Sin embargo la mayoría de estas técnicas se han optimizado para líneas celulares clonales o requiere disociar islotes pancreáticos. En contraste, el método presentado aquí permite la visualización en tiempo real de la exocitosis de gránulos de insulina en los islotes pancreáticos intactos. En este protocolo se describe primero la infección viral de los islotes pancreáticos aislados con adenovirus que codifica una pH-sensible a la proteína verde fluorescente (GFP), pHluorin, acoplada al neuropéptido Y (NPY). En segundo lugar, describimos el confocal de imágenes de islotes cinco días después de la infección viral y cómo controlar la secreción de gránulos de insulina. Brevemente, los islotes infectados se colocan sobre un cubreobjetos sobre una cámara de proyección de imagen y reflejados en un microscopio confocal vertical escaneo láser mientras que continuamente siendo perfundidos con solución extracelular que contiene varios estímulos. Se adquieren imágenes confocales, que abarca 50 μm del islote como grabaciones time-lapse utilizando un escáner rápido resonante. La fusión de gránulos de insulina con la membrana plasmática puede ser seguida en el tiempo. Este procedimiento también permite probar una batería de estímulos en un solo experimento es compatible con ratón e islotes humanos y puede ser combinado con diversos colorantes para proyección de imagen funcional (por ejemplo, tintes de calcio citosólico o potencial de membrana).
Introduction
Insulina es producida por las células beta del islote pancreático y es un regulador clave del metabolismo de glucosa1. Muerte o disfunción de las células beta perturba la homeostasis de la glucosa y conduce a la diabetes2. Insulina está lleno de gránulos de núcleo denso que se liberan en un Ca2 +-dependiente de la forma3. Dilucidar cómo se regulación la exocitosis de gránulos de insulina es esencial para comprender plenamente lo que determina la secreción de insulina y abre nuevas vías para la identificación de nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de la diabetes.
Exocitosis de insulina ha sido extensamente estudiada con métodos electrofisiológicos, como mediciones de capacitancia de la membrana y los enfoques microscópicos en combinación con moléculas fluorescentes. Mediciones de capacitancia de membrana tienen buena resolución temporal y permitan grabaciones unicelular. Sin embargo, cambios en la capacidad de reflejar el cambio neto de la superficie de la célula y capturar eventos de fusión individuales ni distinguir fusión de gránulos de insulina de otras vesículas secretoras de insulina no3. Enfoques microscópicos, tales como microscopía de fluorescencia (TIRF) de reflexión interna total o de dos fotones en combinación con sondas fluorescentes y vesícula carga proteínas, proporcionan detalles adicionales. Estas técnicas de capturan eventos exocitóticas simples y también las etapas pre- y post-exocitóticas y pueden ser utilizadas para estudiar los patrones exocitóticas en poblaciones de células3.
Reporteros fluorescentes pueden ser de tres tipos: 1) extracelular, 2) citoplasmática o 3) vesicular. 1) periodistas extracelulares son trazadores polar (por ejemplo, dextranos, sulforodamina B (SRB), lucifer amarillo, pyranine) que pueden ser introducidos a través del medio extracelular4. El uso de trazadores polar permite la investigación de la fusión del poro en una población de células y captura varias estructuras intercelulares como los vasos sanguíneos. Sin embargo, no informan sobre el comportamiento de carga de vesícula. 2) citoplasmáticas reporteros son sondas fluorescentes acopladas a las proteínas asociadas a membrana que cara el citoplasma y están involucradas en la exocitosis y acoplamiento. Ejemplos incluyen a los miembros de la soluble N– etilmaleimida sensible factor accesorio receptor (trampa) familia de proteínas que se han utilizado con éxito en Neurociencia para el estudio de la liberación de neurotransmisor5. Estas proteínas tienen múltiples socios de enlace y no son insulina-gránulo específico. 3) vesiculares reporteros son sondas fluorescentes fusionadas a proteínas de carga vesicular que permiten la investigación del comportamiento de la carga específica de vesícula. Las proteínas de carga específica de gránulos de insulina incluyen insulina, péptido c, polipéptido amiloideo del islote y NPY entre otros6,7. NPY sólo está presente en que contiene gránulos de insulina y se lanza conjuntamente con la insulina, lo que es un excelente socio para un reportero fluorescente8.
La fusión de diferentes proteínas fluorescentes a NPY ha sido empleada anteriormente para estudiar diversos aspectos de la exocitosis en las células neuroendocrinas, como el requisito del específico synaptotagmin isoformas9,10 y cómo curso del tiempo de lanzamiento depende en el citoesqueleto de actina y miosina II11,12. En este estudio, hemos elegido pHluorin como el reportero fluorescente, que es un GFP modificado que no fluorescente en el pH ácido dentro de núcleo denso gránulos pero se convierte en brillante fluorescente a la exposición al pH extracelular neutro13. Gránulos de insulina madura tienen un pH ácido por debajo de 5.5. Una vez que el gránulo se fusiona con la membrana plasmática y se abre, su carga está expuesta al neutral pH extracelular de 7.4, permitiendo el uso de la pHluorin de proteínas sensibles al pH como un reportero de7,14.
Debido a la naturaleza sensible de pH de pHluorin y la expresión selectiva de NPY en gránulos de insulina, puede utilizarse el concepto de fusión de NPY-pHluorin para el estudio de diversas propiedades de la exocitosis de gránulos de insulina. Viral la fusión construcción garantiza la eficacia de transfección alta y trabaja en primaria de las células beta o líneas celulares, así como en islotes aislados. Este método también puede utilizarse como una guía para el estudio de exocitosis en cualquier otro tipo de célula con las vesículas que contienen NPY. También se puede combinar con cualquier modelo de ratón transgénico para estudiar efectos de determinadas condiciones (caídas, sobreexpresión, etc.) en la exocitosis. Esta técnica se ha utilizado anteriormente para caracterizar patrones espaciales y temporales de la secreción de gránulos de insulina en poblaciones de células beta en islotes humanos15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito describe una técnica que puede utilizarse para visualizar la exocitosis de gránulos de insulina en las células beta en islotes pancreáticos intactos por microscopia confocal. Utiliza el NPY-pHluorin como el reportero fluorescente clonado en adenovirus para asegurar una eficacia de transfección alta.
Aunque el método era muy eficiente en nuestras manos, pueden requerir algunas modificaciones que dependen fundamentalmente de dos parámetros: 1) la calidad de la preparación…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Marcia Boulina de DRI de instalaciones centrales para obtener ayuda con los microscopios. Este trabajo fue financiado por los NIH becas 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, ES025673 R33 y R56 DK084321 (CA).
Materials
| Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
| Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
| Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
| 22×40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
| Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
| Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
| Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| 3M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 1M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| 1M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| Vacuum filter | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
References
- Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
- Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).
- Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).
- Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission. Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).
- Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion. Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).
- Ohara-Imaizumi, M., et al. Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy. Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).
- Whim, M. D. Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters. PLoS One. 6 (4), e19478 (2011).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
- Zhu, D., et al. Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).
- Aoki, R., et al. Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis. Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).
- Felmy, F. Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network. Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Gandasi, N. R., et al. Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis. PLoS One. 10 (6), e0127801 (2015).
- Almaca, J., et al. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. J Vis Exp. (99), e52632 (2015).
- Hanna, S. T., et al. Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells. Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Weber, M., et al. Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function. J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).
- Michael, D. J., et al. Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis. Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).
- Serre-Beinier, V., et al. Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression. Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).
- Rutter, G. A., Hodson, D. J. Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target?. Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).
- Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).
