本方案描述了通过关联超分辨率光学显微镜与扫描电子显微镜图像，获得斑马鱼视网膜亚细胞蛋白定位结果所需的各个步骤。
本文内容
摘要
摘要
我们提出一种结合超分辨率光学显微镜与扫描电子显微镜的方法，用于研究幼年斑马鱼视网膜中的亚细胞蛋白质定位。超分辨率光学显微镜具备突破衍射极限的分辨能力，可提高关联数据的准确性。简言之，将厚度为110纳米的冷冻切片转移至硅晶圆上，经免疫荧光染色后，利用超分辨率光学显微镜成像。随后，切片用甲基纤维素保存，并在扫描电子显微镜（SEM）成像前进行铂喷镀投影处理。通过组织结构特征作为参照，使用开源软件即可轻松整合这两种显微技术所获得的图像。本文描述了适用于幼年斑马鱼视网膜的改进方法，但该方法同样可用于其他类型的组织和生物体。我们证明，通过这种关联成像所获得的互补信息，能够解析线粒体蛋白的表达情况，明确其与线粒体膜及嵴结构的关系，以及与其他细胞区室的空间关联。
引言
确定蛋白质的亚细胞定位及其与细胞不同区室之间关系的方法，是理解其功能和可能相互作用的关键工具。超分辨率显微镜结合电子显微镜可提供此类信息1。基态耗尽显微镜随后进行单分子返回成像（GSDIM）是一种超分辨率显微技术，适用于多种有机荧光染料和基因编码荧光蛋白2，其侧向分辨率可达20 nm3。采用分辨率高于传统衍射极限显微镜的技术，可提高相关性分析的准确性4,5,6。为了实现蛋白质表达与特定亚细胞区室之间最佳的关联定位，并减少不确定性范围7，建议对同一超薄切片进行光学显微镜和电子显微镜观察。在多种切片方法中，Tokuyasu冷冻切片法无需脱水或树脂包埋，同时能较好地保留多种抗原表位的抗原性，并维持良好的组织超微结构8。已有多种方法证明了此类切片在关联光学显微镜与电子显微镜（CLEM）中的适用性4,5,9,10。
斑马鱼视网膜因其在脊椎动物中高度保守的结构和功能，成为研究视觉发育和人类疾病机制的重要模型。特别是，视网膜光感受器具有与哺乳动物光感受器相同的结构，包括基部突触、沿顶-基方向伸长的细胞核、线粒体聚集于更靠近顶端的内节区域，以及位于最顶端位置、由膜盘构成的外节11。斑马鱼与人类之间，蛋白质在不同细胞区室中的定位具有保守性，这使得研究人员能够探究与人类疾病相关蛋白质的生物学功能12,13。
本文介绍了一种制备斑马鱼幼体视网膜样品的实验方案，用于通过关联性超分辨率光学显微镜与电子显微镜技术解析线粒体外膜蛋白Tom20的定位。该方法基于将冷冻切片收集于硅晶圆表面，并通过镀上一层薄铂后产生的形貌信息获得对比度。这些步骤在操作简便性、可重复性以及实验完成时间方面均具有明显的技术优势。我们近期已证明该方法可用于检测小鼠组织中的核孔和线粒体蛋白14。
方案
所有实验均遵循眼科与视觉研究中动物使用方面的ARVO声明，并已获得当地主管部门批准。
1. 在硅片上制备超薄切片
- 样品固定
- 配制固定液，其中含0.1%戊二醛、4%甲醛的0.1 M 卡可基酸盐缓冲液。
注意：警告！操作戊二醛、甲醛和卡可基酸盐缓冲液时需谨慎，应佩戴适当的个人防护装备，并在通风橱中操作。 - 使用三卡因（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，0.4% w/v PBS（磷酸盐缓冲液，pH 7））对受精后5天（5 dpf）的斑马鱼幼体实施安乐死，方法如前所述15。
- 将幼体浸入预冷的固定液中，置于冰上进行固定。去除头部后，在4 °C下轻轻振荡孵育过夜。
- 在体视显微镜下，使用精细镊子和显微解剖刀，在含预冷固定液的1%琼脂糖包埋板上修剪眼部周围组织以分离眼球。将分离的眼球转移至含有新鲜预冷固定液的离心管中。
- 在PBS（磷酸盐缓冲液，pH 7.4）中室温（RT）洗涤两次，每次5分钟。
- 配制固定液，其中含0.1%戊二醛、4%甲醛的0.1 M 卡可基酸盐缓冲液。
- 明胶浸润与包埋
- 将15 mL本地食品级明胶（12% w/v）溶于PB （磷酸盐缓冲液，0.1 M，pH 7.4）中，在40 °C下加热溶解。吸除PBS，向含眼球的离心管中加入温热的明胶溶液。轻弹管壁以确保明胶充分渗入样品，并在40 °C的金属浴或水浴中轻轻振荡孵育10–30分钟。
- 在40 °C水浴中，将温热的明胶注入12 mm × 5 mm × 3 mm的硅胶或聚乙烯平底包埋模具中。使用移液器将两个眼球放入每个模具中，在体视显微镜下用解剖针调整其位置，使其排列整齐。先在室温下冷却1分钟，再于4 °C下固化20分钟。
- 在体视显微镜下使用剃刀片重新修整明胶块，使每个明胶块仅包含一个眼球。
- 将包埋在明胶中的眼球转移至含2.3 M蔗糖的PB溶液中，置于冰上。在4 °C下孵育过夜。
- 更换为新的2.3 M蔗糖溶液，可在4 °C或-20 °C保存；此步骤后样品即可用于切片，或在-20 °C下保存数周至数月。
- 在转移至冷冻钉前，将明胶块重新修整至略大于眼球的尺寸。在液氮中速冻后，转移至冷冻超薄切片机中。
- 冷冻切片
- 在冷冻超薄切片机中，使用金刚石刀于-120 °C下切割厚度为110 nm的切片。
- 用带有液滴（含2%甲基纤维素（溶于水）与2.3 M蔗糖溶液，体积比1:1）的金属环捞取切片。将切片转移至7 mm × 7 mm的硅片上。在4 °C下保存，直至后续处理。
2. 免疫标记
- 用预冷至 0 °C 的 PBS 在 4°C 下洗涤晶片 20 分钟 将晶片倒置放置在液滴上，室温下用 PBS 洗涤 2 次，每次 2 分钟。
- 用0.15%甘氨酸的PBS溶液孵育3次，每次1分钟。用PBS洗涤3次，每次1分钟。用PBG（含0.5%牛血清白蛋白BSA和0.2% B型明胶的PBS）预孵育5分钟。
- 孵育兔抗 Tom20 抗体（参见材料清单） 材料表) 在室温下置于含PBG（4 µg/mL）的溶液中孵育30分钟。
- 用 PBG 洗涤 6 次，每次 1 分钟。室温下用 PBG 预孵育 5 分钟。加入抗兔 Alexa 647 F(ab')2 （参见 材料表) 在 PBG（7.5 µg/mL）中孵育 30 分钟。
- 用PBG洗涤6次，每次1分钟。用PBS洗涤3次，每次2分钟。在PBS中加入DAPI（4 µg/mL）孵育10秒。用PBS洗涤2次，每次2分钟。
3. 超分辨率显微镜
- 将晶圆短暂孵育（10 s），置于一滴由甘油（80%）与含氧清除系统的成像缓冲液按1:1比例配制的溶液上（成像缓冲液组成为：200 mM 磷酸盐缓冲液含10%葡萄糖、0.5 mg/mL 葡萄糖氧化酶、40 µg/mL 过氧化氢酶、15 mM 巯基乙胺盐酸盐（MEA HCL），pH 8.0）。
- 将晶圆（切面朝下）转移至玻璃底（厚度为170 ± 5 µm）培养皿中的新鲜甘油（80%）与成像缓冲液1:1混合液滴上（同3.1步骤）。
- 用移液管从芯片四周移除下方大部分液体。使用硅胶条将芯片固定在培养皿底部。
注意：硅胶条由双组分硅胶胶水制成（3 mm × 12 mm）。 - 使用高数值孔径的倒置显微镜进行图像拍摄例如 160X / NA 1.43；参见 材料表) 油浸式超分辨率专用物镜。成像前，让样品在显微镜中平衡至显微镜温度，以最小化或减少横向和轴向漂移。
- 将目标区域置于视野中心，并获取第一幅宽场落射荧光参考图像。切换至超分辨率工作模式。将相机曝光时间调整为15 ms，电子倍增（EM）增益设置为最大值300。
- 用642 nm连续波激光器在最大激光功率（约对应2.8 kW/cm²）下照射样品2在落射荧光模式下，当单个分子的闪烁信号在每一帧中均清晰分离，使得单个信号重叠的概率较低时，将激光功率设置为约0.7 kW/cm²。2以落射荧光模式采集至少 30,000 帧图像，记录原始图像。
注意：所有这些参数可能因不同样本和标记密度而有所变化。 - 从原始数据中，通过点击使用30个光子的检测阈值（需根据样本进行调整）生成重建事件列表（即原始图像中每个单分子闪烁的定位信息） "评估" 在“工具”下的“t系列分析”中。
- 通过高斯拟合可视化超分辨率图像16 通过单击应用 4 nm 的渲染像素尺寸 "生成图像" 在“工具”下的“事件列表处理面板”中。
注意：本研究中，超分辨图像的生成使用了所用系统自带的集成软件工具。然而，所述的超分辨率成像也可在任何其他基于单分子定位的系统上进行，且数据可使用开源软件工具（如 thunderSTORM）进行处理。17.
4. 铂金喷镀
- 移除硅胶条，并在晶圆边缘附近滴加一滴 PBS，使晶圆从培养皿中抬起。用 PBS 清洗晶圆，每次 2 分钟，共洗 2 次，然后用含 0.1% 戊二醛的 PBS 溶液后固定 5 分钟。再用 PBS 每次清洗 2 分钟，共洗 2 次。
- 将晶圆置于冰上，每次加入一滴 2% 甲基纤维素水溶液，冰浴孵育 5 分钟，共孵育两次。将晶圆转移至离心管中，在 14,100 × g 条件下离心 90 秒。使用导电碳胶将样品固定于扫描电镜用铝 stub 上。
- 使用电子束蒸发装置，通过 8° 角度旋转喷镀法，在样品表面镀上 2 至 10 nm 厚的铂/碳层；设备参数设置为：1.55 kV，55 mA，镀膜速率为 0.3 nm/s，倾斜角度为 8°，旋转等级为 4。
5. 扫描电子显微镜
- 使用扫描电子显微镜在1.5 kV、2 mm工作距离下成像，并采用In lens二次电子探测器。
6. 光学显微镜与电子显微镜图像的对齐
- 通过点击"文件|打开"，在 Fiji18 中打开两种类型的图像。通过点击"图像|调整|画布大小"调整画布尺寸，并通过点击"图像|堆栈|图像合并为堆栈"将两幅图像合并为一个堆栈。将该堆栈保存为 tiff 文件格式。
- 在 Fiji 中，通过点击"文件|新建|TrackEM2 (新建)"打开一个新的 TrackEM219 界面。右键单击黑色窗口并选择"导入堆栈"，以导入包含两幅图像的堆栈。
- 使用参考标记手动对齐光学显微镜图像与电子显微镜图像：在图像上单击鼠标右键，选择"对齐|使用参考标记手动对齐图层"。
- 选择选择工具（黑色箭头）以添加参考标记。以细胞核的形状为参考，在两幅图像中选取相同的边缘位置（补充图 1）。添加多个点（至少需选择三个点）。通过鼠标右键单击并选择"应用变换|仿射模型"，使用仿射模型进行对齐。
- 调整图层透明度（见 补充图 1），以评估对齐质量。
结果
线粒体外膜转位酶复合物亚基 Tom20 的表达20，通过超分辨率光学显微镜在幼年斑马鱼视网膜的薄切片中测定图1）并结合对相同切片进行铂投影处理后通过扫描电子显微镜获得的形貌信号，进一步补充了该信息。这些相关联的数据证实了某蛋白质定位于特定区室——线粒体外膜，并且还提供了该蛋白质与其他细胞器之间空间关系的信息。
图1：斑马鱼视网膜的关联光镜与电镜（CLEM）成像。 A. 5天龄斑马鱼视网膜切片的低倍宽场图像，细胞核用DAPI染色（青色）。 B. 同一区域的扫描电子显微镜图像。 C. B图框内区域的高倍宽场图像。细胞核用DAPI染色（青色），Tom20线粒体染色呈红色。 D. 同一区域更高倍数的宽场图像。Tom20的表达模式位于线粒体簇中。 E. 通过GSDIM显微镜检测到的Tom20表达（红色点状信号）。细胞核用DAPI染色（青色）。 F. 与E图相同区域的关联超分辨率成像与扫描电子显微镜图像叠加结果。Tom20染色信号（红色点状）定位于线粒体的外膜上的线粒体簇（M）。细胞核中的DAPI荧光信号（N）与扫描电镜图像的拓扑结构相对应。 G. F图框内区域的高倍图像。扫描电子显微镜图像为GSDIM图像（红色点状）提供了结构背景。线粒体嵴清晰可见，Tom20染色定位于线粒体的外膜。感光细胞外段的膜结构（OS）也清晰可辨。图像像素大小为5 nm。比例尺：A、B和C：10 µm；D：2 µm；E和F：1 µm；G：0.2 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
补充图1：光学显微镜与电子显微镜图像的对齐。A. TrackEM2界面的截图，显示扫描电镜图像以及沿不同细胞核分布的编号标记点（黄色）。B. TrackEM2界面的截图，显示荧光图像以及沿不同DAPI染色细胞核分布的编号标记点（黄色）。可通过菜单左上角的滑块调节图层透明度。比例尺：1 µm。请点击此处下载该文件。
讨论
该方法结合超分辨率蛋白质定位与上下文信息，以确定蛋白质在细胞器中的精确定位。本文展示了完成实验的全过程，用于可视化线粒体外膜中Tom20的表达，并揭示其与细胞核或幼年斑马鱼视网膜光感受器外段等其他细胞器的空间关系。
Tokuyasu 冷冻切片需要经过一定训练才能获得保存良好的切片。然而，该方法已在许多实验室成功应用21。将切片转移至硅晶圆的过程非常简单，无需特殊操作。在成像缓冲液中使用甘油是防止切片干燥的关键步骤。进行超分辨率成像时，当硅晶圆非常接近培养皿的玻璃底部时可获得最佳结果。硅胶条有助于将晶圆固定在此位置。在移除硅胶条时需格外小心，以避免损伤切片。
冷冻切片的厚度约为100 nm，薄于Z轴方向的光学分辨率，这进一步提高了该关联成像方法的准确性，因为超分辨率显微镜信号仅来源于此薄层，而扫描电子显微镜信号则反映样品的表面形貌。该方法还可与多色成像结合使用。然而，必须特别注意确保样品可在相同条件下进行成像（例如 成像缓冲液）并防止串扰。
该方法的一个局限性在于其二维特性，因为每个晶片仅能收集有限数量的连续切片（约3至7片）。因此，该方法不太适合涉及体积分析的研究项目。然而，该方法可通过简单切片应用于检测任何类型组织中的蛋白质表达。我们提供了一种无需使用醋酸铀酰或柠檬酸铅等经典对比剂的方法。铂金喷镀所产生的对比度可提供非常丰富的形貌信息，但在某些情况下膜结构较难分辨。这可能会对需要确定小囊泡中蛋白质表达水平的研究项目造成困难。
本方案基于Tokuyasu冷冻切片技术，利用常规设备从超分辨率显微镜和扫描电子显微镜获得关联成像结果。将切片收集于硅片上，并使用铂作为对比剂，这些简单步骤可提高样品制备的稳定性和可重复性。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
资助 ION 和 RGB：瑞士国家科学基金会 Ambizione-SCORE 项目资助 PZ00P3 142404/1 和 PZ00P3 163979。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | #158127 | |
| 电镜级戊二醛 | EMS, USA | #16220 | |
| 卡可基酸 | Merck | #8.20670 | |
| 三卡因 | Sigma-Aldrich | #886-86-2 | |
| peqGOLD Universal 琼脂糖 | VWR International GmbH | 35-1020 | |
| 平底包埋模具 | BEEM Flat | ||
| 本地食品品牌明胶 | Dr.Oetker | Extra Gold | |
| 蔗糖 | Merck | #1.07687 | |
| 甲基纤维素 | Sigma | #M-6385 | |
| 甘氨酸 | Sigma | #G-7126 | |
| B型明胶 | Sigma | #G-6650 | |
| 牛血清白蛋白 | Applichem | #A6588.0050 | |
| 硅晶圆片 | Si-Mat Silicon Materials | 类型：P/硼；晶向 <111> ON；生长方法：直拉法（CZ）；电阻率：1–30 欧姆/厘米；表面：抛光；激光切割为 7 × 7 mm | |
| 冷冻针 | Baltic Preparation | #16701950 | |
| 带线金属环 "Perfect loop" | |||
| 硅胶条 | Picodent | Twinsil 22 | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | #G8270 | |
| 葡萄糖氧化酶 | Sigma-Aldrich | #G7141 | |
| 过氧化氢酶 | Sigma-Aldrich | #C40 | |
| β-巯基乙胺盐酸盐 | Sigma-Aldrich | #M6500 | |
| 抗 Tom20 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | #sc - 11415 | |
| AlexaFluor 647 标记的驴抗兔 IgG F(ab')2 片段亲和纯化抗体 | Jackson Immuno-Research | #711-606-152 | |
| DAPI | ROCHE, Switzerland | #10236276001 | |
| 甘油溶液 | Sigma-Aldrich | #49782 | |
| 玻璃底培养皿 | Ibidi, Germany | u-Dish 35 mm，高底玻璃，#81158 | |
| SEM 铝制样品台 | Agar Scientific | #G301F | |
| 导电碳胶 Leit-C | Plano, Germany | AG3300 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 仪器 | |||
| 金刚石刀（冷冻免疫专用） | Diatome | DCIMM3520 | |
| 冷冻超薄切片机 | Leica Microsystems | Leica EM FCS | |
| 宽场-全内反射荧光显微镜 GSD Leica SR GSD 3D | Leica Microsystems | ||
| 160倍 1.43 数值孔径 TIRF 物镜 | Leica Microsystems | 11523048 | |
| 扫描电镜 - Zeiss Supra 50 VP | Zeiss | Supra 50 VP | |
| 聚焦离子束-扫描电镜 - Zeiss Auriga 40 | Zeiss | Auriga 40 |
参考文献
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重印与许可
