斑马鱼视网膜蛋白定位的相关超分辨和电镜观察

方法, 以确定蛋白质的亚细胞定位和它们之间的关系, 以不同的单元, 是了解它们的功能和可能的相互作用的基本工具。超分辨率显微镜结合电子显微镜提供了这样的信息¹。基态损耗显微镜后, 个别分子返回 (GSDIM) 是一个超分辨率显微镜技术兼容广泛的有机和遗传编码的荧光²和实现横向分辨率高达 20 nm³. 采用比标准衍射极限显微镜更高分辨率的方法, 提高了相关性^4、56的准确性。为了达到与特定亚细胞室的蛋白质表达的最佳相关性, 并减少不确定度的体积⁷推荐使用相同的超薄切片进行光和电子显微镜。在不同的切片方法中, 得冰冻切片协议不需要脱水或树脂嵌入, 此外, 保留了许多表位抗原性, 并提供了良好的组织超微结构⁸。几种方法在相关光和电子显微镜 (克莱)^{4、5、9、10}中显示了这些部分的适用性。

斑马鱼视网膜是一个有价值的模型, 研究视觉发展和人类疾病的机制, 鉴于其高度保守的结构和功能, 在脊椎动物。特别是, 视网膜光显示与哺乳动物光相同的结构, 与基底突触, apico 基部拉长核, 线粒体聚类在更顶端内段和外段组成的膜最顶端位置的磁盘¹¹。蛋白质定位到不同的细胞隔间是保存在斑马鱼和人类之间, 允许调查的生物学功能的人类疾病相关的蛋白质^12,13。

在这里, 我们提出了一个协议来准备斑马鱼视网膜标本, 以解决线粒体外膜蛋白 Tom20 的相关超分辨光和电子显微镜的定位。该方法是基于在硅片上收集低温切片, 并通过在应用了一层铂后产生的地形信息获得对比。这些步骤在易用性、重现性和完成实验的时间方面都有明显的技术改进。我们最近证明了该方法在小鼠组织中检测核孔和线粒体蛋白的适用性¹⁴。

所有实验都是按照帕特的声明进行的, 用于眼科和视力研究中的动物使用, 并得到地方当局的批准.

1. 在硅片上制备超薄切片

1. 样品固定
   1. 准备含有0.1% 戊二醛的定影液, 4% 甲醛在0.1 米甲缓冲中.
      注意: 小心! 在使用戊二醛、甲醛和甲缓冲液时要小心, 佩戴适当的个人防护设备, 并在通风罩中工作.
   2. 安乐5天后受精 (5 dpf) 斑马鱼幼虫与 tricaine (乙基 3-氨基甲基磺酸, 0.4% 瓦特/v 在 PBS (磷酸盐缓冲盐水, pH 7)), 如前所述 ¹⁵ .
   3. 通过在冰上浸泡 pre-chilled 固定液来修复幼虫。取下头部, 在4和 #176 的夜间孵育; C 带轻柔摇摆.
   通过1% 琼脂糖层板上的冷冻固定液, 用细钳和显微解剖刀 (在双目下) 修剪眼部周围的组织,
   4. 解剖眼睛。用新鲜的 pre-chilled 固定剂把眼睛转到管子上.
   5. 在 PBS 中洗涤两次 (磷酸盐缓冲盐水, pH 值 7.4), 每次在室温下洗涤5分钟 (RT).
2. 明胶渗透和安装
   1. 将15毫升本地食品品牌明胶12% 瓦特/#160;(p hosphate 缓冲, 0.1 米 pH 7.4) 在40和 #176; c. 除去 PBS, 并在含有眼睛的管子上加入明胶溶液。轻轻拍打试管, 确保明胶渗入样品, 孵育 10-30 分钟, 在40和 #176; C 在 thermoblock 与温和晃动或在水浴.
   2. 填充 12 mm x 5 mm x 3 mm 硅或聚乙烯平面嵌入模具, 用温明胶在40和 #176; C 水浴。使用吸管在每个模具上加两只眼睛, 用解剖针在双目下正确对准, 让明胶在室温下冷却1分钟, 硬化4和 #176; C 为 20 min.
   3. 重新修剪在双目下的明胶块, 使用刀片式服务器每块用一只眼睛.
   4. 在冰上将明胶嵌入的眼睛转移到2.3 米的蔗糖中。在晚上4和 #176 孵育; C.
   5. 交换到新的2.3 米蔗糖溶液和存储在4和 #176; c 或-20 和 #176; c; 在这一步之后, 样品准备切片, 或者可以存储在-20 和 #176; c 几个星期到几个月.
   6. 将明胶块重新修整到几乎眼睛的大小, 然后再转到冷冻针。在液氮中冷冻并转移到低温 ultramicrotome.
3. Cryosectioning
   1. 在-120 和 #176 处剪切 110 nm 厚剖面; C 在冷冻 ultramicrotome 中使用金刚石刀.
   2. 选取含有2% 纤维素 (在水中) 和2.3 米蔗糖溶液 (1:1) 的有线回路的截面。将截面转换为 7 mm x 7 mm 硅片。在4和 #176 中存储部分, 直到进一步处理.

2。Immunolabelling

1. 在0和 #176 上用 PBS 清洗硅片; C 为20分钟, 四和 #160;d 保护, 将晶片倒置放在水滴上。在室温下用 PBS 2x 冲洗2分钟.
2. 在 PBS 中孵育3倍于0.15% 甘氨酸, 每1分钟。用 PBS 清洗 3x 1 分钟。前孵育与 PBG (PBS 与0.5% 牛血清白蛋白 BSA 和0.2% 明胶类型 B) 为 5 min.
3. 在室温下用 PBG (4 和 #181、g/毫升) 的 anti-Tom20 (参见 材料表 ) 进行孵育30分钟.
4. 洗 6x 1 分钟/PBG。孵育与 PBG 5 分钟在 RT. 孵育与兔 Alexa 647 F (ab 和 #39;) ₂ (参见 材料目录 ) 在 PBG (7.5 和 #181; g/毫升) 为 30 min.
5. 洗 6x 1 分钟/PBG。在 PBS 中洗 3x 2 分钟。在 pbs 中孵育 DAPI (4 和 #181; g/毫升), 十年代. 在 pbs 中冲洗 2x 2 分钟.

3。超分辨率显微术

1. 通过将其放置在甘油 (80%) 的1:1 溶液的液滴和含有氧清除系统的成像缓冲器 (含10% 葡萄糖的200毫米磷酸缓冲液, 0.5 毫克/毫升glucoseoxidase, 40 和 #181; g/毫升过氧化氢酶, 15 毫米β-mercaptoethylamine 盐酸盐 (HCL), pH 值 8.0).
2. 将晶圆片 (面朝下) 转移到玻璃底部 (厚度170和 #177; 5 和 #181; m) 培养皿放在甘油 (80%) 和成像缓冲器的1:1 混合物的新滴上 (如步骤 3.1).
3. 从四面八方移除, 用吸管, 大部分的液体在晶片下面。使用硅胶条纹将晶片固定在培养皿的底部.
   注: 硅胶条纹由双组分硅胶 (3 mm x 12 mm) 制成.
4. 使用高数值孔径的倒置显微镜上的图像剖面 ( 如 160X 和 #160;/NA 1.43; 查看材料 表) 油浸超分辨率专用目标。在成像之前, 让样品平衡到显微镜温度, 以最小化/减少横向和轴向漂移.
5. 将感兴趣的区域居中并获取第一个 widefield 荧光参考图像。更改为超分辨率操作模式。将相机的曝光时间调整为15毫秒, 并将电子倍增 (EM) 增益设置为最大值 300.
6. 在荧光模式下用 642 nm 连续波激光照射最大激光功率 (对应于 ~ 2.8 kW/cm ² ) 的样品。只要单分子闪烁在每个帧中都是很好的分离, 使单个信号重叠的概率较低, 则将激光功率设置为 ~ 0.7 kW/cm ² 。通过获得至少3万帧, 在荧光模式下记录原始图像.
   注: 所有这些参数可以根据不同的试样和标记密度而变化.
7. 从原始数据中, 生成一个重建事件列表 (定位在原始图像中闪烁的每个分子), 使用30光子的检测阈值 (需要根据样本进行调整), 方法是单击并 #34; 评估和 #34; 在和 #39; t 系列分析和 #39; #39; 工具和 #39;.
8. 按高斯管接头显示超分辨率图像 ¹⁶ 通过单击和 #34 应用渲染像素大小; 创建图像和 #34; 在和 #39 中; 在和 #39; #39; 工具. #39;
   注: 为了生成超分辨图像, 本研究采用了系统集成软件工具。但是, 所描述的超分辨率成像可以在任何其他单分子定位系统上执行, 并且可以使用开放源码软件工具处理数据, 如雷雨 ¹⁷ .