Name: 斑马鱼视网膜蛋白定位的相关超分辨和电镜观察 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: 学习超分辨与扫描电镜联用技术，实现斑马鱼视网膜蛋白精确定位。该方法结合冷冻超薄切片与免疫标记，为研究视网膜发育及细胞器功能提供高分辨率成像方案。

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资助 ION 和 RGB：瑞士国家科学基金会 Ambizione-SCORE 项目资助 PZ00P3 142404/1 和 PZ00P3 163979。

所有实验均遵循眼科与视觉研究中动物使用方面的ARVO声明，并已获得当地主管部门批准。
1. 在硅片上制备超薄切片
<ol>
	<li>样品固定
	<ol>
		<li>配制固定液，其中含0.1%戊二醛、4%甲醛的0.1 M 卡可基酸盐缓冲液。 
		注意：警告！操作戊二醛、甲醛和卡可基酸盐缓冲液时需谨慎，应佩戴适当的个人防护装备，并在通风橱中操作。</li>
		<li>使用三卡因（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，0.4% w/v PBS（磷酸盐缓冲液，pH 7））对受精后5天（5 dpf）的斑马鱼幼体实施安乐死，方法如前所述15。</li>
		<li>将幼体浸入预冷的固定液中，置于冰上进行固定。去除头部后，在4 °C下轻轻振荡孵育过夜。</li>
		<li>在体视显微镜下，使用精细镊子和显微解剖刀，在含预冷固定液的1%琼脂糖包埋板上修剪眼部周围组织以分离眼球。将分离的眼球转移至含有新鲜预冷固定液的离心管中。</li>
		<li>在PBS（磷酸盐缓冲液，pH 7.4）中室温（RT）洗涤两次，每次5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>明胶浸润与包埋
	<ol>
		<li>将15 mL本地食品级明胶（12% w/v）溶于PB&#160;（磷酸盐缓冲液，0.1 M，pH 7.4）中，在40 °C下加热溶解。吸除PBS，向含眼球的离心管中加入温热的明胶溶液。轻弹管壁以确保明胶充分渗入样品，并在40 °C的金属浴或水浴中轻轻振荡孵育10–30分钟。</li>
		<li>在40 °C水浴中，将温热的明胶注入12 mm × 5 mm × 3 mm的硅胶或聚乙烯平底包埋模具中。使用移液器将两个眼球放入每个模具中，在体视显微镜下用解剖针调整其位置，使其排列整齐。先在室温下冷却1分钟，再于4 °C下固化20分钟。</li>
		<li>在体视显微镜下使用剃刀片重新修整明胶块，使每个明胶块仅包含一个眼球。</li>
		<li>将包埋在明胶中的眼球转移至含2.3 M蔗糖的PB溶液中，置于冰上。在4 °C下孵育过夜。</li>
		<li>更换为新的2.3 M蔗糖溶液，可在4 °C或-20 °C保存；此步骤后样品即可用于切片，或在-20 °C下保存数周至数月。</li>
		<li>在转移至冷冻钉前，将明胶块重新修整至略大于眼球的尺寸。在液氮中速冻后，转移至冷冻超薄切片机中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冷冻切片
	<ol>
		<li>在冷冻超薄切片机中，使用金刚石刀于-120 °C下切割厚度为110 nm的切片。</li>
		<li>用带有液滴（含2%甲基纤维素（溶于水）与2.3 M蔗糖溶液，体积比1:1）的金属环捞取切片。将切片转移至7 mm × 7 mm的硅片上。在4 °C下保存，直至后续处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 免疫标记
<ol>
	<li>用预冷至 0 °C 的 PBS 在 4°C 下洗涤晶片 20 分钟&#160;将晶片倒置放置在液滴上，室温下用 PBS 洗涤 2 次，每次 2 分钟。</li>
	<li>用0.15%甘氨酸的PBS溶液孵育3次，每次1分钟。用PBS洗涤3次，每次1分钟。用PBG（含0.5%牛血清白蛋白BSA和0.2% B型明胶的PBS）预孵育5分钟。</li>
	<li>孵育兔抗 Tom20 抗体（参见材料清单） 材料表) 在室温下置于含PBG（4 µg/mL）的溶液中孵育30分钟。</li>
	<li>用 PBG 洗涤 6 次，每次 1 分钟。室温下用 PBG 预孵育 5 分钟。加入抗兔 Alexa 647 F(ab')2 （参见 材料表) 在 PBG（7.5 µg/mL）中孵育 30 分钟。</li>
	<li>用PBG洗涤6次，每次1分钟。用PBS洗涤3次，每次2分钟。在PBS中加入DAPI（4 µg/mL）孵育10秒。用PBS洗涤2次，每次2分钟。</li>
</ol>
3. 超分辨率显微镜
<ol>
	<li>将晶圆短暂孵育（10 s），置于一滴由甘油（80%）与含氧清除系统的成像缓冲液按1:1比例配制的溶液上（成像缓冲液组成为：200 mM 磷酸盐缓冲液含10%葡萄糖、0.5 mg/mL 葡萄糖氧化酶、40 µg/mL 过氧化氢酶、15 mM 巯基乙胺盐酸盐（MEA HCL），pH 8.0）。</li>
	<li>将晶圆（切面朝下）转移至玻璃底（厚度为170 ± 5 µm）培养皿中的新鲜甘油（80%）与成像缓冲液1:1混合液滴上（同3.1步骤）。</li>
	<li>用移液管从芯片四周移除下方大部分液体。使用硅胶条将芯片固定在培养皿底部。 
	注意：硅胶条由双组分硅胶胶水制成（3 mm × 12 mm）。</li>
	<li>使用高数值孔径的倒置显微镜进行图像拍摄例如 160X&#160;/ NA 1.43；参见 材料表) 油浸式超分辨率专用物镜。成像前，让样品在显微镜中平衡至显微镜温度，以最小化或减少横向和轴向漂移。</li>
	<li>将目标区域置于视野中心，并获取第一幅宽场落射荧光参考图像。切换至超分辨率工作模式。将相机曝光时间调整为15 ms，电子倍增（EM）增益设置为最大值300。</li>
	<li>用642 nm连续波激光器在最大激光功率（约对应2.8 kW/cm²）下照射样品2在落射荧光模式下，当单个分子的闪烁信号在每一帧中均清晰分离，使得单个信号重叠的概率较低时，将激光功率设置为约0.7 kW/cm²。2以落射荧光模式采集至少 30,000 帧图像，记录原始图像。 
	注意：所有这些参数可能因不同样本和标记密度而有所变化。</li>
	<li>从原始数据中，通过点击使用30个光子的检测阈值（需根据样本进行调整）生成重建事件列表（即原始图像中每个单分子闪烁的定位信息） &#34;评估&#34; 在“工具”下的“t系列分析”中。</li>
	<li>通过高斯拟合可视化超分辨率图像16 通过单击应用 4 nm 的渲染像素尺寸 &#34;生成图像&#34; 在“工具”下的“事件列表处理面板”中。 
	注意：本研究中，超分辨图像的生成使用了所用系统自带的集成软件工具。然而，所述的超分辨率成像也可在任何其他基于单分子定位的系统上进行，且数据可使用开源软件工具（如 thunderSTORM）进行处理。17.</li>
</ol>
4. 铂金喷镀
<ol>
	<li>移除硅胶条，并在晶圆边缘附近滴加一滴 PBS，使晶圆从培养皿中抬起。用 PBS 清洗晶圆，每次 2 分钟，共洗 2 次，然后用含 0.1% 戊二醛的 PBS 溶液后固定 5 分钟。再用 PBS 每次清洗 2 分钟，共洗 2 次。</li>
	<li>将晶圆置于冰上，每次加入一滴 2% 甲基纤维素水溶液，冰浴孵育 5 分钟，共孵育两次。将晶圆转移至离心管中，在 14,100 × g 条件下离心 90 秒。使用导电碳胶将样品固定于扫描电镜用铝 stub 上。</li>
	<li>使用电子束蒸发装置，通过 8° 角度旋转喷镀法，在样品表面镀上 2 至 10 nm 厚的铂/碳层；设备参数设置为：1.55 kV，55 mA，镀膜速率为 0.3 nm/s，倾斜角度为 8°，旋转等级为 4。</li>
</ol>
5. 扫描电子显微镜
<ol>
	<li>使用扫描电子显微镜在1.5 kV、2 mm工作距离下成像，并采用In lens二次电子探测器。</li>
</ol>
6. 光学显微镜与电子显微镜图像的对齐
<ol>
	<li>通过点击&#34;文件|打开&#34;，在 Fiji18 中打开两种类型的图像。通过点击&#34;图像|调整|画布大小&#34;调整画布尺寸，并通过点击&#34;图像|堆栈|图像合并为堆栈&#34;将两幅图像合并为一个堆栈。将该堆栈保存为 tiff 文件格式。</li>
	<li>在 Fiji 中，通过点击&#34;文件|新建|TrackEM2 (新建)&#34;打开一个新的 TrackEM219 界面。右键单击黑色窗口并选择&#34;导入堆栈&#34;，以导入包含两幅图像的堆栈。</li>
	<li>使用参考标记手动对齐光学显微镜图像与电子显微镜图像：在图像上单击鼠标右键，选择&#34;对齐|使用参考标记手动对齐图层&#34;。
	<ol>
		<li>选择选择工具（黑色箭头）以添加参考标记。以细胞核的形状为参考，在两幅图像中选取相同的边缘位置（补充图 1）。添加多个点（至少需选择三个点）。通过鼠标右键单击并选择&#34;应用变换|仿射模型&#34;，使用仿射模型进行对齐。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调整图层透明度（见 补充图 1），以评估对齐质量。</li>
</ol>

<ol><li>Hauser, M., Wojcik, M., Kim, D., Mahmoudi, M., Li, W., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+Super-Resolution+Microscopy%3A+New+Dimensions+and+New+Opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Correlative Super-Resolution Microscopy: New Dimensions and New Opportunities.</a> Chem Rev. , (2017).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Fölling, J., Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).</li>
<li>Betzig, E., Patterson, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science (New York, N.Y.). 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Grimm, J. B., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+photoactivated+localization+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+one%22%5BJournal%5D)">Correlative photoactivated localization and scanning electron microscopy.</a> PLOS one. 8 (10), e77209(2013).</li>
<li>Paez-Segala, M. G., Sun, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation-resistant+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+CLEM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM.</a> Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).</li>
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<li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemistry+on+ultrathin+frozen+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+J%22%5BJournal%5D)">Immunochemistry on ultrathin frozen sections.</a> Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).</li>
<li>Suleiman, H., Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+protein+architecture+of+the+kidney+glomerular+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Nanoscale protein architecture of the kidney glomerular basement membrane.</a> eLife. 2, e01149(2013).</li>
<li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Xu, C. S., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+3D+superresolution+fluorescence+and+electron+microscopy+reveal+the+relationship+of+mitochondrial+nucleoids+to+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Correlative 3D superresolution fluorescence and electron microscopy reveal the relationship of mitochondrial nucleoids to membranes.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (16), 6136-6141 (2012).</li>
<li>Avanesov, A., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+retina+in+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the retina in the zebrafish model.</a> Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).</li>
<li>Bachmann-Gagescu, R., Phelps, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliopathy+gene+cc2d2a+controls+zebrafish+photoreceptor+outer+segment+development+through+a+role+in+Rab8-dependent+vesicle+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">The ciliopathy gene cc2d2a controls zebrafish photoreceptor outer segment development through a role in Rab8-dependent vesicle trafficking.</a> Hum Mol Gen. 20 (20), 4041-4055 (2011).</li>
<li>Bachmann-Gagescu, R., Dona, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ciliopathy+Protein+CC2D2A+Associates+with+NINL+and+Functions+in+RAB8-MICAL3-Regulated+Vesicle+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Gen%22%5BJournal%5D)">The Ciliopathy Protein CC2D2A Associates with NINL and Functions in RAB8-MICAL3-Regulated Vesicle Trafficking.</a> PLOS Gen. 11 (10), e1005575(2015).</li>
<li>Mateos, J. M., Guhl, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+contrast+of+ultrathin+cryo-sections+for+correlative+super-resolution+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Topographic contrast of ultrathin cryo-sections for correlative super-resolution light and electron microscopy.</a> Sci Rep. 6, 34062(2016).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ThunderSTORM%3A+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Cardona, A., Saalfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+one%22%5BJournal%5D)">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS one. 7 (6), e38011(2012).</li>
<li>Wurm, C. A., Neumann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+distribution+of+mitochondrial+import+receptor+Tom20+is+adjusted+to+cellular+conditions+and+exhibits+an+inner-cellular+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 108 (33), 13546-13551 (2011).</li>
<li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17947990">Cryosectioning and immunolabeling.</a> Nat Prot. 2 (10), 2480-2491 (2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该方法结合超分辨率蛋白质定位与上下文信息，以确定蛋白质在细胞器中的精确定位。本文展示了完成实验的全过程，用于可视化线粒体外膜中Tom20的表达，并揭示其与细胞核或幼年斑马鱼视网膜光感受器外段等其他细胞器的空间关系。
Tokuyasu 冷冻切片需要经过一定训练才能获得保存良好的切片。然而，该方法已在许多实验室成功应用21。将切片转移至硅晶圆的过程非常简单，无需特殊操作。在成像缓冲液中使用甘油是防止切片干燥的关键步骤。进行超分辨率成像时，当硅晶圆非常接近培养皿的玻璃底部时可获得最佳结果。硅胶条有助于将晶圆固定在此位置。在移除硅胶条时需格外小心，以避免损伤切片。
冷冻切片的厚度约为100 nm，薄于Z轴方向的光学分辨率，这进一步提高了该关联成像方法的准确性，因为超分辨率显微镜信号仅来源于此薄层，而扫描电子显微镜信号则反映样品的表面形貌。该方法还可与多色成像结合使用。然而，必须特别注意确保样品可在相同条件下进行成像（例如 成像缓冲液）并防止串扰。
该方法的一个局限性在于其二维特性，因为每个晶片仅能收集有限数量的连续切片（约3至7片）。因此，该方法不太适合涉及体积分析的研究项目。然而，该方法可通过简单切片应用于检测任何类型组织中的蛋白质表达。我们提供了一种无需使用醋酸铀酰或柠檬酸铅等经典对比剂的方法。铂金喷镀所产生的对比度可提供非常丰富的形貌信息，但在某些情况下膜结构较难分辨。这可能会对需要确定小囊泡中蛋白质表达水平的研究项目造成困难。
本方案基于Tokuyasu冷冻切片技术，利用常规设备从超分辨率显微镜和扫描电子显微镜获得关联成像结果。将切片收集于硅片上，并使用铂作为对比剂，这些简单步骤可提高样品制备的稳定性和可重复性。

确定蛋白质的亚细胞定位及其与细胞不同区室之间关系的方法，是理解其功能和可能相互作用的关键工具。超分辨率显微镜结合电子显微镜可提供此类信息1。基态耗尽显微镜随后进行单分子返回成像（GSDIM）是一种超分辨率显微技术，适用于多种有机荧光染料和基因编码荧光蛋白2，其侧向分辨率可达20 nm3。采用分辨率高于传统衍射极限显微镜的技术，可提高相关性分析的准确性4,5,6。为了实现蛋白质表达与特定亚细胞区室之间最佳的关联定位，并减少不确定性范围7，建议对同一超薄切片进行光学显微镜和电子显微镜观察。在多种切片方法中，Tokuyasu冷冻切片法无需脱水或树脂包埋，同时能较好地保留多种抗原表位的抗原性，并维持良好的组织超微结构8。已有多种方法证明了此类切片在关联光学显微镜与电子显微镜（CLEM）中的适用性4,5,9,10。
斑马鱼视网膜因其在脊椎动物中高度保守的结构和功能，成为研究视觉发育和人类疾病机制的重要模型。特别是，视网膜光感受器具有与哺乳动物光感受器相同的结构，包括基部突触、沿顶-基方向伸长的细胞核、线粒体聚集于更靠近顶端的内节区域，以及位于最顶端位置、由膜盘构成的外节11。斑马鱼与人类之间，蛋白质在不同细胞区室中的定位具有保守性，这使得研究人员能够探究与人类疾病相关蛋白质的生物学功能12,13。
本文介绍了一种制备斑马鱼幼体视网膜样品的实验方案，用于通过关联性超分辨率光学显微镜与电子显微镜技术解析线粒体外膜蛋白Tom20的定位。该方法基于将冷冻切片收集于硅晶圆表面，并通过镀上一层薄铂后产生的形貌信息获得对比度。这些步骤在操作简便性、可重复性以及实验完成时间方面均具有明显的技术优势。我们近期已证明该方法可用于检测小鼠组织中的核孔和线粒体蛋白14。

<table><tbody><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#158127</td><td></td></tr><tr><td>电镜级戊二醛</td><td>EMS, USA</td><td>#16220</td><td></td></tr><tr><td>卡可基酸</td><td>Merck</td><td>#8.20670</td><td></td></tr><tr><td>三卡因</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>peqGOLD Universal 琼脂糖</td><td>VWR International GmbH</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>平底包埋模具</td><td>BEEM Flat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>本地食品品牌明胶</td><td>Dr.Oetker</td><td>Extra Gold</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Merck</td><td>#1.07687</td><td></td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Sigma</td><td>#M-6385</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma</td><td>#G-7126</td><td></td></tr><tr><td>B型明胶</td><td>Sigma</td><td>#G-6650</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Applichem</td><td>#A6588.0050</td><td></td></tr><tr><td>硅晶圆片</td><td>Si-Mat Silicon Materials</td><td></td><td>类型：P/硼；晶向 &amp;lt;111&gt; ON；生长方法：直拉法（CZ）；电阻率：1–30 欧姆/厘米；表面：抛光；激光切割为 7 × 7 mm</td></tr><tr><td>冷冻针</td><td>Baltic Preparation</td><td>#16701950</td><td></td></tr><tr><td>带线金属环 &quot;Perfect loop&quot;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅胶条</td><td>Picodent</td><td>Twinsil 22</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G8270</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G7141</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C40</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙胺盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#M6500</td><td></td></tr><tr><td>抗 Tom20 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#sc - 11415</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 标记的驴抗兔 IgG F(ab')2 片段亲和纯化抗体</td><td>Jackson Immuno-Research</td><td>#711-606-152</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ROCHE, Switzerland</td><td>#10236276001</td><td></td></tr><tr><td>甘油溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#49782</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>Ibidi, Germany</td><td>u-Dish 35 mm，高底玻璃，#81158</td><td></td></tr><tr><td>SEM 铝制样品台</td><td>Agar Scientific</td><td>#G301F</td><td></td></tr><tr><td>导电碳胶 Leit-C</td><td>Plano, Germany</td><td>AG3300</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>金刚石刀（冷冻免疫专用）</td><td>Diatome</td><td>DCIMM3520</td><td></td></tr><tr><td>冷冻超薄切片机</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica EM FCS</td><td></td></tr><tr><td>宽场-全内反射荧光显微镜 GSD Leica SR GSD 3D</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>160倍 1.43 数值孔径 TIRF 物镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>11523048</td><td></td></tr><tr><td>扫描电镜 - Zeiss Supra 50 VP</td><td>Zeiss</td><td>Supra 50 VP</td><td></td></tr><tr><td>聚焦离子束-扫描电镜 - Zeiss Auriga 40</td><td>Zeiss</td><td>Auriga 40</td><td></td></tr></tbody></table>

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

我们提出一种结合超分辨率光学显微镜与扫描电子显微镜的方法，用于研究幼年斑马鱼视网膜中的亚细胞蛋白质定位。超分辨率光学显微镜具备突破衍射极限的分辨能力，可提高关联数据的准确性。简言之，将厚度为110纳米的冷冻切片转移至硅晶圆上，经免疫荧光染色后，利用超分辨率光学显微镜成像。随后，切片用甲基纤维素保存，并在扫描电子显微镜（SEM）成像前进行铂喷镀投影处理。通过组织结构特征作为参照，使用开源软件即可轻松整合这两种显微技术所获得的图像。本文描述了适用于幼年斑马鱼视网膜的改进方法，但该方法同样可用于其他类型的组织和生物体。我们证明，通过这种关联成像所获得的互补信息，能够解析线粒体蛋白的表达情况，明确其与线粒体膜及嵴结构的关系，以及与其他细胞区室的空间关联。

线粒体外膜转位酶复合物亚基 Tom20 的表达20，通过超分辨率光学显微镜在幼年斑马鱼视网膜的薄切片中测定图1）并结合对相同切片进行铂投影处理后通过扫描电子显微镜获得的形貌信号，进一步补充了该信息。这些相关联的数据证实了某蛋白质定位于特定区室——线粒体外膜，并且还提供了该蛋白质与其他细胞器之间空间关系的信息。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56113/56113fig1.jpg" /> 
图1：斑马鱼视网膜的关联光镜与电镜（CLEM）成像。 A. 5天龄斑马鱼视网膜切片的低倍宽场图像，细胞核用DAPI染色（青色）。 B. 同一区域的扫描电子显微镜图像。 C. B图框内区域的高倍宽场图像。细胞核用DAPI染色（青色），Tom20线粒体染色呈红色。 D. 同一区域更高倍数的宽场图像。Tom20的表达模式位于线粒体簇中。 E. 通过GSDIM显微镜检测到的Tom20表达（红色点状信号）。细胞核用DAPI染色（青色）。 F. 与E图相同区域的关联超分辨率成像与扫描电子显微镜图像叠加结果。Tom20染色信号（红色点状）定位于线粒体的外膜上的线粒体簇（M）。细胞核中的DAPI荧光信号（N）与扫描电镜图像的拓扑结构相对应。 G. F图框内区域的高倍图像。扫描电子显微镜图像为GSDIM图像（红色点状）提供了结构背景。线粒体嵴清晰可见，Tom20染色定位于线粒体的外膜。感光细胞外段的膜结构（OS）也清晰可辨。图像像素大小为5 nm。比例尺：A、B和C：10 µm；D：2 µm；E和F：1 µm；G：0.2 µm。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56113/56113fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：光学显微镜与电子显微镜图像的对齐。A. TrackEM2界面的截图，显示扫描电镜图像以及沿不同细胞核分布的编号标记点（黄色）。B. TrackEM2界面的截图，显示荧光图像以及沿不同DAPI染色细胞核分布的编号标记点（黄色）。可通过菜单左上角的滑块调节图层透明度。比例尺：1 µm。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56113/Supplementary_Figure_1.tif">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了通过关联超分辨率光学显微镜与扫描电子显微镜图像，获得斑马鱼视网膜亚细胞蛋白定位结果所需的各个步骤。

我们提出了一种结合超分辨率光学显微镜与……的方法，用于研究幼年斑马鱼视网膜中蛋白质的亚细胞定位。

本显微技术的总体目标是通过关联超分辨率显微成像与扫描电子显微成像，精确定位幼年斑马鱼视网膜中蛋白质表达相对于不同亚细胞器的空间位置。该方法有助于解答视网膜发育与细胞通路研究领域中的关键问题，例如突变体中蛋白质错误定位的研究。该技术的主要优势在于，它将超分辨率显微技术与扫描电子显微技术相结合，从而在样品的结构背景下获得高度精确的蛋白质定位数据。在硅晶圆上收集Tokuyasu切片可显著改善操作性，而采用铂金喷镀技术提供对比度则能获得良好的样品表面形貌。因此，该方法可为斑马鱼幼体视网膜研究提供重要信息。其主要优势之一在于，该技术还可广泛应用于其他多种生物系统，例如小鼠组织中蛋白质表达的鉴定。根据文本方案从固定后的斑马鱼幼鱼中解剖出眼睛后，将15毫升含12%本地食品品牌明胶的PBS溶液在40摄氏度下预热。然后吸除眼组织管中的PBS，加入明胶溶液。轻轻敲击管壁以确保明胶充分渗透样品，并在40摄氏度的恒温块中轻轻振荡或置于水浴中孵育10至30分钟。在40摄氏度的水浴中，将温热的明胶注入尺寸为12 × 5 × 3毫米的硅胶或聚乙烯平底包埋模具中。然后使用移液器向每个模具中加入两只眼球，并在双目显微镜下用解剖针将其正确排列。待明胶在室温下冷却1分钟后，将其置于4摄氏度环境中20分钟以使其凝固。在双目镜下，使用剃刀重新修整明胶包埋块，使每个包埋块容纳一只眼球。将包埋有眼球的明胶块转移至冰上含有2.3摩尔蔗糖的PBS溶液中。将样本在4摄氏度下孵育过夜。然后将样品转移至新鲜的2.3摩尔蔗糖溶液中，并在4摄氏度或-20摄氏度下保存，可储存数月。在将凝胶块转移至冷冻针之前，需重新修整至接近眼球的大小。然后将样品块在液氮中冷冻，并转移至冷冻超薄切片机中。在冷冻超薄切片机中使用金刚石刀于零下120摄氏度下切出厚度为110纳米的切片。用含有2%甲基纤维素和2.3摩尔蔗糖溶液液滴的金属丝环捞取切片。然后将切片转移至7 mm × 7 mm的硅片上。清洗硅片时，用移液器滴加四滴液体，并将硅片倒置放在液滴上。将硅片在0 °C下孵育20分钟。然后在室温下用 PBS 洗涤晶片两次，每次两分钟。将样品在含 0.15% 甘氨酸的 PBS 中孵育三次，每次一分钟。随后用 PBS 洗涤样品三次，每次一分钟。用PBG预孵育组织5分钟。接着，将兔抗Tom20抗体溶于PBG中并加入切片。将切片在室温下孵育30分钟。用PBG洗涤组织，每次1分钟，共洗涤6次。然后在室温下用PBG预孵育样品5分钟。弃去PBG，加入溶于PBG中的Alexa 647标记的兔源二价Fab片段，孵育30分钟。用 PBG 溶液清洗样品，每次清洗 1 分钟，共清洗六次。然后用 PBS 清洗晶片，每次 2 分钟，共清洗三次。向晶片中加入 DAPI 和 PBS，孵育 10 秒。然后用 PBS 每次清洗样品 2 分钟，共清洗两次。将晶圆片置于一滴由 80% 甘油与含氧清除系统的成像缓冲液按 1:1 比例配制的溶液上，短暂孵育。将晶圆片（组织面朝下）转移至玻璃底培养皿上新鲜的一滴 80% 甘油与成像缓冲液 1:1 混合液中。从晶圆片下方各个方向使用移液器吸除大部分液体。然后使用硅胶条将晶圆片固定在培养皿底部。将装片样本置于倒置显微镜下，采用高数值孔径的油浸物镜进行观察。成像前，让样品在显微镜温度下平衡，以最小化或减少横向和轴向漂移。将目标区域居中，并采集宽场落射荧光参考图像。切换至超分辨率工作模式。将相机曝光时间调整为15毫秒，电子倍增增益设置为最大值300。接着，使用642纳米激光器以最大激光功率在落射荧光模式下照射样品。一旦单分子闪烁在每帧图像中清晰分离，使得单个信号重叠的概率较低时，立即将激光功率降低至接近原来的1/3。通过采集至少 30,000 帧图像，在落射荧光模式下记录原始图像。在“工具”下的“时间序列分析”中，使用 30 个光子的检测阈值对原始数据进行处理。单击“评估”以生成定位事件列表。在“工具”下的“事件列表处理”面板中，单击“创建图像”，通过高斯拟合可视化超分辨率图像，并应用4纳米的渲染像素尺寸。移除硅胶条带，然后在晶圆边缘附近滴加一滴PBS，使其从培养皿中抬起。用PBS清洗晶圆两次，每次两分钟；随后使用含0.1%戊二醛的PBS溶液进行后固定，处理五分钟。然后用 PBS 再次清洗样品，每次清洗 2 分钟，共清洗两次。将晶片置于冰上，每次加入一滴 2% 的甲基纤维素水溶液，孵育 5 分钟，重复两次。然后将晶片放入离心管中，在 14,100 ×g 条件下离心 90 秒。离心后，使用导电碳胶将晶片固定在扫描电镜铝制样品台（SEM铝 stub）上。利用电子束蒸发仪，通过旋转阴影法在样品表面沉积一层2至10纳米厚的铂碳膜，具体参数设置如下。使用扫描电子显微镜在1.5千伏加速电压、2毫米工作距离、配备镜内二次电子探测器的条件下对样品区域进行成像。使用 Fiji 通过点击“文件”、“打开”来打开光学显微镜和电子显微镜图像。通过点击“图像”、“调整”、“画布大小”来调整画布尺寸。然后通过点击“图像”、“堆栈”、“图像到堆栈”将两幅图像合并为一个堆栈。在 Fiji 中，通过点击 文件，新建，Track EM2 新建，打开一个新的 Track EM2 界面。通过右键单击黑色窗口并选择 导入图像栈，导入包含两幅图像的图像栈。使用鼠标右键单击图像并选择 对齐，通过标志点手动对齐层，将光学显微镜图像与电子显微镜图像进行手动对齐。选择“选择”工具以添加标记点。以细胞核的形状为参考，在两幅图像中选择相同的边缘，并添加多个点。通过右键单击，选择“应用变换”中的“仿射模型”进行配准。最后，调整图层透明度以评估配准质量。该图显示受精后五天斑马鱼视网膜切片的低倍宽场图像。相同区域在此通过扫描电子显微镜呈现。这些高倍图像显示了线粒体上 Tom20 的红色荧光染色，可见其在线粒体上的簇状分布。图中所示 Tom20 的表达通过 GSDIM 超分辨显微镜检测获得。该图像在同一区域结合了关联性超分辨率显微镜与扫描电子显微镜的结果。Tom20 染色信号出现在线粒体簇的线粒体外膜位置。细胞核内的 DAPI 荧光信号与 SEM 图像的拓扑结构相对应。该 SEM 图像为 GSDIM 图像中 Tom20 染色提供了结构背景。线粒体嵴清晰可见，Tom20 染色定位于线粒体外膜。光感受器外段的膜结构清晰可辨。在进行该操作时，务必尽可能优化标记和成像参数。只有经过最佳标记的样品才适用于超分辨率成像。在标记过程中，样品任何时候都不得干燥。本方法可扩展用于双重免疫荧光标记，从而实现对特定结构内两种不同蛋白质的定位。对于更复杂的样品，建议使用标记物以获得图像的精确对齐。观看本视频后，您应充分理解如何在复杂组织样品中以超分辨率精度开展相关性研究，以定位蛋白质相对于细胞内不同细胞器的分布情况。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

斑马鱼视网膜蛋白定位的相关超分辨和电镜观察

我们演示了一种用于生成嵌合体斑马鱼胚胎的实验方案，以在胚胎发育过程中对细胞行为进行活体成像观察。...

移植表达GFP的卵裂球用于嵌合斑马鱼胚胎视网膜和脑发育的活体成像

本文介绍了一种显微解剖受精后一至三天斑马鱼胚胎视网膜的方法，可保留或不保留附着的视网膜色素上皮。...

斑马鱼胚胎眼部组织的显微解剖

在本视频中，提供了多色共聚焦延时成像和靶向细胞消融的技术。延时成像用于监测多种目标细胞类型的行为...

多色延时成像转基因斑马鱼：可视化通过靶向神经元细胞消融激活的视网膜干细胞

本文介绍了一种在成年斑马鱼视网膜中条件性敲低目标蛋白表达的方法，该方法包括将反义吗啉环寡核苷酸（morpholinos）玻璃体内注射并电穿孔导入视网膜。该方法可使目标蛋白表达在数天内被敲低，从而可用于研究该蛋白在再生或完整视网膜中的功能。...

体内电穿孔法将吗啉代寡核苷酸导入成年斑马鱼视网膜

我们介绍一种在成年斑马鱼中逆行标记视网膜神经节细胞（RGCs）的高效方法。...

成年斑马鱼视网膜神经节细胞的逆行荧光染料标记

成像细胞器及其他亚细胞结构的动态行为 体内 可以揭示它们在生理和疾病状态下的功能。本文介绍了对两种细胞器——中心体和线粒体——进行遗传标记的方法，并利用宽场显微镜和共聚焦显微镜对活体斑马鱼胚胎中这些细胞器的动态行为进行成像。...

活体斑马鱼胚胎中亚细胞结构的成像

光片荧光显微镜是成像胚胎发育的优秀工具，能够在接近生理条件下对活体胚胎进行长时间的延时成像。我们展示了其在跨越广泛时空尺度下斑马鱼眼部发育成像中的应用，并提供了一套多视角数据集融合与去卷积的处理流程。...

利用光片荧光显微镜成像斑马鱼眼睛发育过程

本方案展示了在早期斑马鱼胚胎冷冻切片上进行连续免疫荧光和免疫组织化学染色的方法，从而实现对特定细胞群体中蛋白共定位的精确分析。...

石蜡切片斑马鱼胚胎的连续免疫荧光与免疫组织化学染色

这些实验方案旨在分析斑马鱼晶状体的皮质形态、固定和活体晶状体缝合结构的完整性，并测量斑马鱼晶状体核沿前-后轴的位置。...

斑马鱼晶状体核定位及缝合完整性的评估

本方案描述了一种对斑马鱼早期眼部发育进行整体标记和多维成像的方法。我们介绍了利用激光扫描共聚焦显微镜进行标记、包埋和四维（4D）成像的操作步骤，并讨论了优化数据采集的注意事项，以深入解析视杯形态发生机制。...

斑马鱼视杯形态发生的四维成像

本方案详细阐述了预先包埋免疫电镜技术的各个步骤，重点在于研究视网膜中的突触环路和蛋白质定位。...

通过预包埋免疫电镜技术研究视网膜环路与分子定位

学习超分辨与扫描电镜联用技术，实现斑马鱼视网膜蛋白精确定位。该方法结合冷冻超薄切片与免疫标记，为研究视网膜发育及细胞器功能提供高分辨率成像方案。

相关超分辨率显微镜与电子显微镜技术解析斑马鱼视网膜中蛋白质的定位

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