斑马鱼视网膜蛋白定位的相关超分辨和电镜观察

该协议描述了在斑马鱼视网膜上获得亚细胞蛋白定位结果的必要步骤, 方法是将超分辨光显微镜和扫描电子显微镜图像关联起来。

这种显微镜方法的总体目标是通过关联超分辨率和扫描电子显微镜图像来精确定位与幼虫斑马鱼视网膜中不同亚细胞器相关的蛋白质表达。这种方法可以帮助回答视网膜发育和细胞通路领域的关键问题，例如研究突变体中的蛋白质错误定位。该技术的主要优点是它将超分辨率与扫描电子显微镜相结合，可在样品的结构环境中获得高度准确的蛋白质定位数据。

有机硅晶片上 Tokuyasu 切片的收集极大地方便了处理，并且使用铂阴影进行对比提供了良好的样品形貌。因此，这种方法可以提供对幼虫斑马鱼视网膜研究的见解。它的主要优点之一是它还可以应用于许多其他生物系统，例如鉴定小鼠组织中的蛋白质表达。

根据文本方案从固定斑马鱼幼虫中解剖眼睛后，在 15 摄氏度的 PBS 中加热 40% 的 12% 当地食品品牌明胶。然后从眼管中吸出 PBS 并加入明胶溶液。轻轻敲击试管以确保明胶渗入样品，然后在 40 摄氏度下在热块中轻轻摇晃或在水浴中孵育 10 至 30 分钟。

在 40 摄氏度的水浴中，用温热的明胶填充 12 x 5 x 3 毫米的硅胶或聚乙烯平面包埋模具。然后，使用移液管为每个模具添加两只眼睛，并在双筒望远镜下使用解剖针正确对齐它们。让明胶在室温下冷却 1 分钟后，将其置于 4 摄氏度下 20 分钟以硬化。

在双筒望远镜下，使用剃须刀片重新修剪明胶块，使每个块适合一只眼睛。将明胶包埋的眼睛转移到冰上 PBS 中的 2.3 摩尔蔗糖中。将样品在 4 摄氏度下孵育过夜。

然后将样品更换为新鲜的 2.3 摩尔蔗糖溶液。并将组织储存在 4 摄氏度或零下 20 摄氏度，最多可储存数月。在将其转移到冷冻针之前，将明胶块重新修剪到几乎眼睛的大小。

然后将块在液氮中冷冻，并将其转移到冷冻超薄切片机中。在冷冻超薄切片机中使用金刚石刀，在零下 120 摄氏度下切割 110 纳米厚的切片。挑选带有含有 2% 甲基纤维素和 2.3 摩尔蔗糖溶液液滴的有线环的切片。

然后将切片转移到 7 x 7 毫米的硅胶晶片上。要清洗晶片，请吸取 4 滴，然后将晶片倒置在液滴上。将晶片在液滴上于 0 摄氏度孵育 20 分钟。

然后在室温下用 PBS 洗涤晶片两次，每次 2 分钟。将样品在 0.15% 甘氨酸的 PBS 溶液中孵育 3 次，每次 1 分钟。然后使用 PBS 洗涤样品 3 次，每次洗涤 1 分钟。

将组织与 PBG 预孵育 5 分钟。接下来，将 PBG 中的兔子抗 Tom20 添加到各个部分。并将晶片在室温下孵育 30 分钟。

使用 PBG 将组织洗涤 6 次，每次洗涤 1 分钟。然后将样品与 PBG 在室温下预孵育 5 分钟。在 PBG 中用 Alexa 647 抗兔二价 Fab 片段替换 PBG，并孵育 30 分钟。

在 PBG 中洗涤样品 6 次，每次洗涤 1 分钟。然后使用 PBS 洗涤晶片 3 次，每次 2 分钟。将 DAPI 和 PBS 添加到晶片中并孵育 10 秒。

然后使用 PBS 洗涤样品 2 次，每次 2 分钟。将晶片放在含有除氧系统的 80% 甘油和成像缓冲液的一对一溶液液滴上，并短暂孵育。将晶片组织面朝下转移到玻璃底培养皿上的 80% 甘油和成像缓冲液的一比一混合物的新鲜液滴上。

使用移液管从四面八方去除晶片下方的大部分液体。然后使用硅胶条将晶片固定到培养皿的底部。将安装的切片放在具有高数值孔径油浸物镜的倒置显微镜上。

在成像之前，让样品平衡到显微镜温度，以尽量减少或减少横向和轴向漂移。将感兴趣区域居中并获取宽场落射荧光参考图像。更改为超分辨率作模式。

将相机的曝光时间调整为 15 毫秒，并将电子倍增增益设置为最大值 300。接下来，用 642 纳米激光以最大激光功率以落射荧光模式照射样品。一旦单分子闪烁在每一帧中被很好地分离，因此单个信号重叠的可能性很低，就可以将激光功率降低到近 1/3。

通过获取至少 30， 000 帧来记录落射荧光的原始图像。从原始数据中，在 Tools （工具） 下，t-Series Analysis 使用 30 个光子的检测阈值。单击 Evaluate 以生成本地化事件列表。

在"工具"下的"事件列表处理"面板中，单击"创建图像"，通过高斯拟合可视化超分辨率图像，并应用 4 纳米的渲染像素大小。去除硅胶条，在靠近晶片边缘的地方加入一滴 PBS，将其从培养皿中提起。使用 PBS 洗涤晶片 2 次，每次 2 分钟后，使用 0.1% 戊二醛的 PBS 溶液后固定 5 分钟。

然后在 PBS 中再次洗涤样品 2 次，每次洗涤 2 分钟。将晶片放入一滴 2% 甲基纤维素的冰水中孵育 2 次，每次孵育 5 分钟。然后将晶片插入离心管中，以 14、100 倍 g 离心 90 秒。

旋转后，使用导电碳水泥将晶片安装在 SEM 铝短管上。使用电子束蒸发装置，通过旋转阴影在样品上添加一层 2 至 10 纳米的铂碳，设置如下。使用 1.5 kV、2 mm 工作距离和镜头内二次电子探测器对切片进行成像。

使用 Fiji 通过单击 File （文件）、Open （打开） 来打开光学和电子显微镜图像。通过单击图像、调整、画布大小来调整画布大小。然后，通过依次单击 Image （图像）、Stacks （堆栈）、Images to Stack （要堆叠的图像） 将两个图像放入堆栈中。

在斐济，通过单击文件、新建、新建跟踪 EM2 打开新的跟踪 EM2 界面。通过右键单击黑色窗口并选择 Import stack 来导入包含两个图像的堆栈。通过在图像上单击鼠标右键并选择 Align（对齐）、Align layer（图层与地标手动对齐），手动将光学显微镜图像与电子显微镜图像与地标对齐。

选择 Select （选择） 工具以添加陆标。使用细胞核的形状作为参考，在两个图像中选择相同的边缘并添加多个点。通过右键单击并选择 Apply transform （应用转换）、Affine Model （仿射模型） 来应用与仿射模型的对齐。

最后，更改图层透明度以评估对齐质量。该面板显示了受精后 5 天的斑马鱼视网膜切片的低倍率宽视野图像。扫描电子显微镜在此处显示了相同的区域。

这些更高放大倍率的图像显示 Tom20 染色为红色，线粒体处有簇。此处显示了 Tom20 的表达，通过 GSDIM 显微镜检测到。在这张图片中，同一部分结合了相关的超分辨率和扫描电子显微镜。

Tom20 染色出现在线粒体外膜的线粒体簇内。细胞核中的荧光 DAPI 信号与 SEM 图像的形貌相对应。该 SEM 图像为 GSDIM 图像中的 Tom20 染色提供了背景。

线粒体嵴清晰可见，Tom20 染色位于线粒体外膜。光感受器外段的膜清晰分辨。在尝试此过程时，请务必记住尽可能优化您的标记和成像参数。

只有经过最佳标记的样品才适合进行超分离。在标记过程中，样品在任何时候都不得干燥。该程序可以扩展到双标记免疫荧光，从而允许在特定结构内定位两种不同的蛋白质。

对于更复杂的样本，建议使用基准标记以获得图像的精确对齐。观看本视频后，您应该对如何以超分辨率精度在复杂组织样品中进行相关研究以定位与细胞不同细胞器相关的蛋白质有一个很好的了解。