分离小鼠皮层神经元培养物的制备 关键词：小鼠, 皮层神经元, 原代培养, 神经元分离, 细胞培养

摘要

本视频展示了一种从晚期胚胎和早期出生后小鼠大脑皮层制备神经元培养物的方法。这些培养物可用于免疫细胞化学、生物化学、电生理学、钙离子和钠离子成像，为研究携带出生后致死性基因突变的转基因动物的神经元发育提供了平台。

摘要

本视频将指导您完成从小鼠晚期胚胎及早期出生后脑组织中制备皮层神经元培养物的全过程。此类培养物可用于多种实验应用，包括免疫细胞化学、生物化学分析、电生理记录、钙离子与钠离子成像，以及蛋白质和/或RNA的提取。此外，这些培养体系还可为研究携带晚期胚胎期或出生后致死性基因突变的转基因动物的神经元发育提供平台。该实验流程相对简便，但需具备一定的组织培养技术经验；若准备充分，整个操作通常不超过两至三小时。在分离过程中仔细去除丘脑-皮层纤维束，有助于减少非神经元细胞的污染。在酶消化步骤后，应轻柔吹打皮层组织碎片以提高神经元细胞的得率。此步骤至关重要，因其可避免对细胞造成不必要的机械损伤，并防止神经元过早死亡。由于这些培养物在无胶质细胞饲养层的条件下维持，因而还可获得神经元高度富集的培养体系，具有额外优势。 关键词：皮层神经元培养，小鼠脑组织，晚期胚胎期，出生后早期，免疫细胞化学，生物化学，电生理学，钙成像，钠成像，蛋白质提取，RNA提取，基因突变，神经元发育，酶消化，吹打解离，非神经元细胞，胶质细胞饲养层

方案

培养前的准备工作：

• 配制无菌解剖液（DS）。
• 配制NBM/B27（含B27添加剂的Neurobasal培养基）。
• 如需要，对ddH₂O进行高压灭菌，并对玻璃盖玻片进行灭菌处理。
• 用多聚-D-赖氨酸包被组织培养皿或玻璃盖玻片。

多聚-D-赖氨酸包被：

在无菌条件下，于培养前一天进行准备。

• 将一份10X多聚赖氨酸（PDL）解冻并置于冰上。
• 在1 ml PDL中加入9 ml无菌超滤水，充分混匀（配制成1X）。
• 按以下方式在室温下用1X PDL过夜包被表面：
  • 玻璃盖玻片（Bellco Glass, Inc. 货号# 1943-00012）：每张盖玻片75 µl
     或
  • 24孔培养板：每孔300 µl
     或
  • 35 mm培养皿：每皿1 ml
• 用无菌水冲洗5次（使用无菌巴斯德吸管吸取液体）。
• 去除水分，直至表面完全干燥。

培养步骤（在层流罩内的无菌条件下进行）

1. 用超级胶水将琼脂块粘附到切片机（Vibraslicer，Campden Instruments Ltd.）的支撑块上。
2. 当使用晚期胚胎阶段（E17-18）的小鼠胎儿时，处死母鼠，取出子宫，并从胎膜中分离出单个胎儿。将胎儿置于无菌培养皿中，按以下步骤继续操作。
3. 将小鼠胎儿或幼鼠断头处死（遵循所在机构动物护理与使用委员会批准的指南）。
4. 去除皮肤和颅骨，将脑组织置于盛有冷解剖液（DS）的60 mm培养皿中的Whatman滤纸圆片上。
5. 使用无菌剃须刀片切除小脑。
6. 用刮铲拾取脑组织，在滤纸上吸去多余液体，然后将脑组织转移至Vibraslicer的支撑块上并固定（尾端朝上，腹侧面向琼脂）。
7. 向切片室中加入冷解剖液（DS），将速度选择器调至8-9档。
8. 从嗅球开始切取200-400 µm厚的脑片。当Vibraslicer刀片进入皮层区域后，开始切取600 µm厚的冠状切片。E17-18期小鼠脑通常可获得3-4个可用切片，而P0期小鼠脑可获得4-5个可用切片。
9. 使用未装吸头的10 ml玻璃巴斯德移液管的反向末端，将脑片转移至标记为DS 2的35 mm培养皿中。
10. 使用从毛细管拉制的玻璃针剥离皮层组织并去除软脑膜。
11. 将皮层组织切成0.5-1 mm长的小块。
12. 将酶解液（ES）通过连接在5 cc注射器上的0.2 µm滤器过滤至35 mm培养皿中。
13. 将皮层组织小块转移至含有过滤后酶解液（ES）的培养皿中。
14. 在37°C条件下孵育30分钟。

在此期间：

1. 清理超净台、振动切片机和解剖工具。
2. 向一个60 mm培养皿中加入5 ml温热的NBM/B27培养基。

孵育 30 分钟后：

1. 将组织转移至 10 ml DS 中，静置 1 分钟。
2. 将组织转移至第一管 Hi 中，涡旋混匀，静置 2–3 分钟。
3. 转移至第二管 Hi，重复上述步骤。
4. 转移至第一管 Li，重复上述步骤。
5. 转移至第二管 Li，重复上述步骤。
6. 转移至第三管 Li，重复上述步骤。
7. 将组织转移至含有培养基的 60 mm 培养皿中。

在解剖显微镜下：

1. 清除组织中的碎片，并通过轻轻吹打经过拉制的玻璃移液管（使用逐渐减小的孔径）来机械解离组织块，以充分分散组织。
2. 将细胞悬液转移至含有剩余NBM+B27的15 ml锥形管中（对于24孔板，总体积为13 ml；对于5–35 mm培养皿，总体积为11 ml）。轻柔混匀，静置以使较大的组织碎片沉降。
3. 将细胞悬液接种至培养板中（24孔板每孔0.5 ml，35 mm培养皿每皿2 ml）。
4. 若使用玻璃盖玻片，每张盖玻片加入80 µl细胞悬液，置于细胞培养箱中孵育1小时，待细胞贴附后，再向培养腔内添加足量的NBM/B27培养基。
5. 将培养物维持在37°C、5% CO₂的培养箱中。

第二天

24孔板：每孔加入0.5 ml非神经元细胞条件化NBM/B27培养基（cNBM/B27；cNBM/B27培养基的制备方案见下文）

35 mm 培养皿：加入 0.5 ml cNBM/B27 培养基进行替换。

每2-3天将0.5 ml培养基更换为新鲜的cNBM/B27，以维持培养。

尽管培养基不会促进胶质细胞增殖，但如果需要，可在培养第3至第5天用5 µM FDU（5-氟-2'-脱氧尿苷，Sigma F0503）处理培养物，以进一步减少胶质细胞数量。

解剖与培养的准备工作

将解剖工具在70%乙醇中灭菌或进行高压灭菌：

• 剪刀（中号和小号） 抹刀（中号和小号）
• 镊子（中号和小号） 剃刀刀片
• 振动切片机刀片 缓冲液浴槽
• 用于刀片的小型金属楔块 脑组织支撑架

其他材料：

• 培养皿（60 mm）
• 培养皿（35 mm）
• 滤纸
• 玻璃移液管，10 ml
• 无菌一次性移液管，5、10 和 25 ml
• 注射器滤器，0.2 µm
• 注射器，5 cc
• 离心管，15 ml
• 无菌巴斯德玻璃移液管
• 多聚-D-赖氨酸（PDL）包被的培养皿或玻璃盖玻片

标记六个15 ml离心管，并按以下步骤进行准备：

试管 #1：酶溶液：

向含有以下成分的 5 ml DS 中加入 50 U 木瓜蛋白酶（Worthington LS 03126）：

• 100 µl L-半胱氨酸（0.8 mg）
• 7 µl 0.1 N NaOH
• 50 µl APV（5 mM）

将溶液置于室温下静置至澄清。注意，酶溶液最初会呈现“浑浊”状态，使用前需静置至澄清。

 

第2管和第3管：Hi酶抑制剂：

3 ml DS + 300 µl BSA/Ti + 30 µl APV (5 mM)。

轻轻混匀以避免产生气泡，然后分成两份，每份 1.5 ml。

 

第4至第6管：低酶抑制剂：

8 ml DS + 80 µl BSA/Ti + 80 µl APV (5 mM)。

轻轻混匀以避免产生气泡，分装成三份，每份 2.6 ml。

 

将编号为 #2 至 #6 的试管置于冰上。将 #1 号试管（酶溶液）留在室温下。

溶液与分装

• 溶液 A（缓冲盐水）Sigma 配方，重量 500 ml [浓度]
• 氯化钠 NaCl S-9625 58.45 80.0g 137mM
• 氯化钾 KCl P-4504 74.56 4.0g 5.4mM
• 无水磷酸氢二钠 Na₂HPO₄ S-0876 142.0 0.24g 0.17mM
• 无水磷酸二氢钾 KH₂PO₄ P-5379 136.09 0.3g 0.22mM

称取所有成分，加入400 ml超滤水搅拌至完全溶解，加水定容至500 ml。转移至洁净瓶中，高压灭菌。4°C保存，并标记为“DS溶液A”。

• 溶液B（Hepes）Sigma 配方，分子量 250 ml [浓度]
• Hepes Hepes H-3375 283.3 20.97g 9.9mM

加入超纯水至200 ml，搅拌至溶解，再加水定容至250 ml。置于洁净瓶中，高压灭菌。4°C保存，并标记为“DS溶液B”。

• 工作液 500 ml [浓度]
• 超滤水 400 ml
• 储备液 A 25 ml
• 储备液 B 14 ml
• D-(+)-葡萄糖 Sigma G-8270 3.0 g 33.3 mM
• 蔗糖 Sigma S-0389 7.5 g 43.8 mM

用1N NaOH调节pH至7.4，用超滤水定容至500 ml。倒入洁净的玻璃瓶中，高压灭菌。4°C保存。标记为“解剖液”。

聚-D-赖氨酸制备：

1. 用无菌 H₂O 配制 10 倍浓度的多聚-D-赖氨酸（PDL；Sigma P-7280）储存液，浓度为 1 mg/ml。
2. 分装成每份 1.0 ml。该溶液可在 -20°C 下保存长达 3 个月。

媒体

1. 向500 ml NBM瓶（Neurobasal Medium，Gibco 21103-049）中加入10 ml B-27 Supplement（Gibco 17504-044）。
2. 分装为40 ml每份，4°C保存。

APV

1. 向含有10 mg APV（2-氨基-5-膦酰戊酸，Sigma A-5282）的西林瓶中加入10 ml无菌H₂O，并充分混匀。
2. 分装为180 µl每份，于-20°C保存。

BSA/Ti

1. 将1 g BSA（牛血清白蛋白，Sigma A-7030）和1 g胰蛋白酶抑制剂（Sigma T-9253）溶于10 ml DS中。
2. 用1N NaOH调节pH至7.4。
3. 通过0.2 µm针头滤器过滤除菌。
4. 分装为400 µl每份，于-20°C保存。

L-半胱氨酸

在 1.5 mL 离心管中，将 0.6 mg L-半胱氨酸（Sigma C-7755）溶于 200 µl DS 中。

琼脂糖（4%）

1. 将 4 g Bacto Agar（Difco 0140-01）溶解于 100 ml 无菌水中。使用前置于 4°C 保存。
2. 微波加热琼脂至融化，倒入 35 mm 培养皿中。静置冷却并使其凝固。

木瓜蛋白酶（Worthington LS 03126）

NUNC 培养瓶中的非神经元培养

包被培养瓶（4 个 Nunc 瓶）

1. 向3个装有10倍浓缩PDL的试管中各加入9 mL无菌水，配制成1倍浓度PDL。
2. 将30 mL 1倍浓度PDL转移至第一个瓶子中。
3. 轻轻移动瓶子，直至所有生长表面均被覆盖，静置1分钟。
4. 将1倍浓度PDL转移至第二个瓶子中，静置1分钟。
5. 对第三和第四个瓶子重复上述操作。
6. 用150 mL无菌H₂O对全部四个瓶子进行两次冲洗。

制备酶溶液（ES）：

1. 在0.6 ml离心管中称取0.8 mg L-半胱氨酸（Sigma C7755），加入150 µl DS，涡旋振荡至晶体完全溶解。
2. 将5 ml DS转移至15 ml锥形管中，然后加入150 µl L-半胱氨酸。
3. 加入50单位木瓜蛋白酶。（Worthington LS 03126）
4. 加入7 µl 0.1 N NaOH。

配制 MEM（GIBCO # 11090-081）

1. 从500 ml MEM瓶中移除65 ml液体，保留10 ml用于配制葡萄糖溶液。
2. 加入5 ml青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep，Gibco #15070-063）。
3. 加入10 ml 1M葡萄糖溶液（Sigma G-8270）（1.8 g/10 ml MEM）。
4. 加入50 ml胎牛血清（Fetal Bovine Serum，Gibco #16140-071）或小牛血清（Bovine Calf Serum，Omega BC-04）。
5. 充分混匀，分装后于4°C保存。

神经基础培养基/B-27 添加剂 (NBM/B27)
NBM，500 ml (Gibco #21103-049)；B-27 (50X)，10 ml (Gibco #17504-044)

1. 将 B-27 小瓶中的全部内容物加入 NBM 瓶中并混匀。
2. 分装后于 4°C 保存。

脑组织解剖

1. 解剖前将解剖工具从70%乙醇中取出晾干。
2. 将10 ml DS分别加入3-15 ml离心管中，每管10 ml。
3. 选取P0至P3日龄的小鼠幼崽，每4瓶需要3个脑组织。
4. 向35 mm培养皿中加入冰冷的DS溶液。
5. 断头处死小鼠幼崽，并取出脑组织。
6. 将脑组织放入盛有冰冷DS溶液的培养皿中。
7. 将组织切成小块，大小需足以通过玻璃移液管。

酶解离

1. 用巴氏吸管尽可能去除培养皿中的 DS。
2. 将 ES 通过 0.2 µm 滤膜和 5 cc 注射器过滤。
3. 将 ES 加入含有组织的培养皿中。
4. 将组织置于 37°C 培养箱（无 CO₂）中孵育 30 分钟。

组织洗涤

1. 用玻璃移液管将组织转移至第一支DS管中，注意尽量减少ES的带入。
2. 在1500 rpm下离心30秒。
3. 转移组织，并重复此步骤两次。

吹打

1. 将38 ml MEM/FBS加入50 ml离心管中
2. 向35 mm培养皿中加入3 ml MEM/FBS，并将组织转移至该培养皿中。
3. 使用1000 µl移液枪头轻轻吹打，使组织解离。
4. 将细胞悬液转移至含有38 ml MEM/FBS的离心管中，充分混匀。

铺板

1. 将培养瓶直立放置，以确保每个瓶中的细胞悬液和培养基体积相等。
2. 在每个培养瓶中加入 90 ml MEM/FBS 培养基。
3. 在每个瓶中加入 10 ml 细胞悬液。
4. 标记：非神经元细胞、 initials 和日期。在 37°C、5% CO₂ 条件下培养。

喂养

1. 第3天或第4天，用预热的MEM/FBS培养基更换细胞培养液（倒掉全部旧培养基，加入100 ml MEM/FBS）。细胞培养可能需要7–10天达到汇合状态。
2. 第7–10天，更换为NBM/B27培养基。
3. 次日，收集培养上清液，用0.22 µm滤膜过滤。
4. 将滤液分装为每份40 ml，然后用MEM/FBS培养基继续培养细胞。
5. 接下来的2至3天，更换为NBM/B27培养基。
6. 次日，收集 并重复上述操作。
7. 持续收集培养上清液约2周时间。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-氟-2’-脱氧尿苷	Sigma-Aldrich	F0503
氯化钠	Sigma-Aldrich	S9625
振动切片机	Campden Instruments
氯化钾	Sigma-Aldrich	P4504
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S0876
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P5379
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
蔗糖	Sigma-Aldrich	S0389
聚-D-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P7280
B27 添加剂	Invitrogen	17504-044
Neurobasal 培养基 (NBM)	Invitrogen	21103-049
2-氨基-5-磷酰戊酸	Sigma-Aldrich	A5282
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7030
胰蛋白酶抑制剂	Sigma-Aldrich	T9253
氢氧化钠，1N 溶液	Fisher Scientific	SS266-1
L-半胱氨酸	Sigma-Aldrich	C7755
细菌培养用琼脂	Difco Laboratories	0140-01
木瓜蛋白酶	Worthington Biochemical	LS 03126
无菌 0.2 μm 注射器滤器	Fisher Scientific	DDA02025S0
玻璃盖玻片，No1，12 mm	Bellco Glass	1943-00012
最低必需培养基 (MEM)	Invitrogen	11090-081	含 Earle’s 盐，不含 L-谷氨酰胺，用于非神经元细胞培养
青霉素/链霉素	Invitrogen	15070-063	用于非神经元细胞培养
胎牛血清	Invitrogen	16140-071	非神经元细胞培养所需
Nunclon "三联培养瓶" 组织培养瓶	Fisher Scientific	12-565-25	用于非神经元细胞培养。在制备 "条件化 Neurobasal 培养基/B27" 时非常方便，但也可使用其他组织培养瓶或培养皿替代。
玻璃底 "成像培养皿"	MatTek Corp.	P35G-1.5-10-C	玻璃底 35 mm 培养皿，适用于倒置显微镜系统下的钙离子或钠离子成像，但价格较高！