Summary
Viene presentato un metodo per analisi spettrometria totale di peptidi endogeni in umana del liquido cerebrospinale (CSF). Impiegando la filtrazione di cut-off di peso molecolare, cromatografica pre-frazionamento, analisi spettrometria totale e una successiva combinazione di strategie di identificazione del peptide, è stato possibile ampliare il noto peptidome di CSF quasi dieci volte rispetto per gli studi precedenti.
Abstract
Questo protocollo descrive un metodo sviluppato per identificare peptidi endogeni in umana del liquido cerebrospinale (CSF). Per questo scopo, un metodo precedentemente sviluppato basato su filtrazione di cut-off (MWCO) di peso molecolare e analisi spettrometria totale è stato combinato con un passo di pre-frazionamento di HPLC in linea fase inversa di alto pH.
Secrezione nel CSF è la via principale per la rimozione di molecole capannone da cellule del sistema nervoso centrale. Così, molti processi nel sistema nervoso centrale si riflettono nel CSF, rendendolo un prezioso fluido diagnostico. CSF ha una composizione complessa, contenente proteine che coprono una gamma di concentrazione di 8-9 ordini di grandezza. Oltre a proteine, studi precedenti hanno dimostrato anche la presenza di un gran numero di peptidi endogeni. Mentre meno estesamente studiato rispetto alle proteine, questi potrà inoltre detenere potenziale interesse come biomarcatori.
Peptidi endogeni sono stati separati dal contenuto di proteina di CSF attraverso filtrazione MWCO. Rimuovendo una maggioranza del contenuto proteico del campione, è possibile aumentare il volume del campione studiato e quindi anche l'importo totale dei peptidi endogeni. La complessità della miscela peptide filtrato è stato risolto includendo una fase inversa (RP) HPLC pre-frazionamento passo a pH alcalino prima dell'analisi LC-MS. Il frazionamento è stato combinato con un sistema di concatenazione semplice dove 60 frazioni sono state riunite in 12, quindi potrebbe essere ridotto consumo di tempo di analisi, evitando ancora in gran parte co-eluizione.
Identificazione automatica del peptide è stato effettuato tramite tre programmi di software di identificazione di diversi peptidi/proteine e successivamente combinando i risultati. I diversi programmi erano complementari piuttosto che paragonabile con meno del 15% delle identificazioni sovrapposti tra i tre.
Introduction
Biomarcatori nel liquido cerebrospinale (CSF) ricerca attualmente stanno trasformando processi neurodegenerativi. Nel morbo di Alzheimer, la più comune malattia neurodegenerativa, che interessa oltre 60 milioni persone in tutto il mondo1,2, un tripletto di biomarcatore costituito l'amiloide beta peptide, stabilizzazione dei microtubuli proteina tau e un fosforilato forma di tau, con alta sensibilità e specificità in grado di rilevare la malattia ed è stato incluso nei criteri diagnostici ricerca3. In altre malattie neurodegenerative, come il morbo di Parkinson e la sclerosi multipla, studi di proteomica sono identificati numerosi candidati di biomarcatore, alcuni dei quali sono attualmente in corso di valutazione in studi clinici4,5 ,6.
A fianco di proteine, CSF contiene anche un'abbondanza di peptidi endogeni7,8,9,10,11,12. Che costituiscono i prodotti di clivaggio di molte proteine di cervello-derivato, questi peptidi rappresentano anche una fonte potenzialmente importante di biomarker di malattia. Per aumentare l'inventario dei peptidi endogeni identificati in CSF umano e attivare analisi di endopeptidomic di CSF in studi clinici, è stato sviluppato un metodo per la preparazione dei campioni e analisi LC-MS (una combinazione di protocollo breve è stato incluso nella Figura 1 ). L'applicazione di questo metodo in un recente studio ha provocato l'identificazione di quasi 16.400 peptidi endogeni di CSF in campioni di CSF riuniti da parecchi individui della diagnosi aspecifiche, espandendo il noto endopeptidome di CSF hanno decuplicato13. Il metodo può essere utilizzato facoltativamente in combinazione con approccio etichettatura isobarica per quantificazione.
Preparazione del campione
La principale fonte di massa di proteine nel liquido Cerebrospinale è costituenti del plasma (albumina e immunoglobuline) passando sopra il sangue cervello barriera14,15. Loro elevata abbondanza ostacola la rilevazione di componenti del campione, basso-abbondante e cervello-derivato. Peptidi endogeni possono essere facilmente separati dalle proteine ad alta-abbondanti, consentendo in tal modo un volume significativamente più grande di CSF peptide estratto per essere utilizzati per l'analisi LC-MS, consentendo la rilevazione di peptidi inferiore-abbondanti.
Nel protocollo presentato qui, filtrazione di cut-off (MWCO) peso molecolare è stato utilizzato per separare i peptidi di CSF dalla frazione proteica; un metodo che è stato utilizzato in diversi precedenti studi8,9,10,11,12,16. Il passo di filtrazione è stato seguito da un passo di pre-frazionamento RP HPLC in linea eseguito sopra un gradiente di fase mobile alto pH. Eseguendo due passaggi di RP HPLC in tandem, con pH essendo la principale distinzione, la differenza di selettività tra i due passaggi risultati principalmente da ritenzione di peptide alterata in conseguenza di peptidi differenti stati di carica. L'applicazione di pre-frazionamento ad alta pH peptide prima di LC-MS in condizioni acide ha dimostrato efficace nell'aumento del peptide identificazione17,18e anche di essere superiore a questo scopo nei complessi biologici campioni rispetto ad altre modalità separazione ortogonale19, come scambio forte gatto-ionico (SCX) e RP20. Per accorciare il tempo di analisi, è stato utilizzato uno schema di concatenazione, pool di ogni frazione dith 12 (ad es., frazioni 1, 13, 25, 37 e 49), che, a causa di alto potere risolutivo di RP HPLC, ancora in gran parte evitato co-eluizione di peptidi da diversi frazioni in LC-MS passaggio20,21.
Identificazione del peptide
Identificazione del peptide in studi peptidomica differisce da quella di studi di proteomica, in quanto nessuna scissione enzimatica può essere specificato nella ricerca nel database, e di conseguenza, tassi di identificazione sono solitamente inferiore11. Un recente studio13 ha mostrato che i tassi di identificazione per peptidi endogeni ottenuti con Sequest e mascotte sono stati migliorati sostanzialmente quando il valore predefinito algoritmo del programma rispettivo software di punteggio è stato modificato utilizzando le marcature adattivo algoritmo Percolator, che indica che il punteggi ottimali algoritmi per peptidi endogeni differiscano da quella di peptidi triptico13. In quanto Studio, identificazione basata sul sequenziamento de novo peptide automatico utilizzando il software picchi (BSI) è stato trovato per essere complementari ai motori di ricerca basati su impronte digitali agli ioni due frammento, risultante in un insieme significativamente maggiore di identificato peptidi.
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Protocol
Il protocollo descritto di seguito è una versione raffinata di quello usato in uno studio precedente dove una grande quantità di peptidi endogeni sono stati identificati in umano CSF15. Aggiornamenti per il protocollo originale comportano alterazioni minori per il pre-trattamento chimico di CSF nonché ottimizzazione della sfumatura utilizzata per il non in linea pre-frazionamento di alto pH RP HPLC.
Considerazioni etiche
Tutti gli studi dei materiali paziente e controllo svedese sono stati approvati dai comitati etici: Göran St (Rif. 2005-554-31/3). I campioni di CSF della coorte di demenza di Amsterdam e campioni raccolti all'ospedale nazionale per neurologia e neurochirurgia, Londra sono stati utilizzati per la ricerca con il consenso scritto di tutti i pazienti partecipanti e approvazione da comitati etici regionali. Il materiale qui utilizzato principalmente consiste di CSF di avanzi da campioni prelevati ai fini della diagnosi ed è stato de-identificato prima di essere inclusi nei nostri studi. Non c'è nessuna possibilità di risalire il campione a qualsiasi donatore individuale o gruppo di donatori.
1. estrazione di umana del liquido cerebrospinale (CSF):
- Estrarre il CSF attraverso la puntura lombare (deve essere eseguita da un medico addestrato) utilizzando un protocollo standardizzato22.
- Rimuovere i detriti cellulari e altro materiale non solubile mediante centrifugazione a 2.500 x g per 20 min.
- Ispezionare visivamente i campioni di CSF per sbiadimento che può indicare la contaminazione di sangue derivanti da puntura sanguinamento. La concentrazione nella proteina significativamente più alta nel sangue e la presenza di proteasi può notevolmente influenzare i risultati analitici.
2. trattamento preliminare del CSF (1,5 mL Volume di campione, nessuna quantificazione):
- Sgelare 1,5 mL di aliquote di CSF a temperatura ambiente (TA), trasferire il contenuto di provette in polipropilene da 10 mL e aggiungere 80 µ l di 1 M Triethylammonium bicarbonato (TEAB) come un agente tampone.
- Aggiungere il cloridrato di guanidinium 0,65 mL 8 M (GdnHCl) (concentrazione attiva GdnHCl: 2,4 M) e vortex delicatamente a temperatura ambiente per 10 min.
Nota: L'agente caotropici, GdnHCl, sia influisce sulla viscosità del solvente e interagisce con la catena polipeptidica, che si traduce in proteina dispiegarsi essere energeticamente favorevoli23. Così, GdnHCl dissolve aggregati proteici e aumenta il recupero di peptidi endogeni durante la successiva filtrazione. - Aggiungere 60 µ l di 200 mM di acquosa tris(2-carboxyethyl) cloridrato fosfina (TCEP) (concentrazione attiva TCEP: 6 mM) e incubare a 55 ° C per 1 h per ridurre Bisolfuri di cisteina.
- 35 µ l di 400mm iodoacetamide (IAA) (concentrazione attiva IAA: 4 mM) e incubare a RT nel buio per 30 minuti a alchilata cisteine. L'aggiunta di un gruppo alchilico assicura che residui di cisteina non possono spontaneamente formare nuovi ponti disolfuro in qualsiasi punto durante la preparazione del campione successivo.
- Aggiungere 3,25 mL di acqua deionizzata e vortexare brevemente per diluire il campione prima della filtrazione MWCO, risultante in un volume di campione totale di 5,5 mL. Questo passaggio serve a diluire GdnHCl a inferiore a 1 M come una concentrazione maggiore è stata osservata per causare talvolta la lisciviazione delle sostanze polimeriche dai dispositivi di filtro.
3. trattamento preliminare del CSF (10 x 150 µ l di campione, etichettatura-quantificazione isobarico):
- Scongelare i 150 µ l di aliquote di CSF da 10 individui a RT e successivamente trasferire il contenuto di provette da centrifuga micro basso-associazione individuale 1,5 mL e aggiungere 8 µ l di 1 M TEAB come un agente tampone.
- Aggiungere 65 µ l di 8 M GdnHCl (concentrazione attiva GdnHCl: 2,4 M) e vortex delicatamente a temperatura ambiente per 10 min.
- Aggiungere 6 µ l di 200 mM di TCEP acquosa (concentrazione attiva TCEP: 6 mM) e incubazione a 55 ° C per 1 h per ridurre Bisolfuri di cisteina.
- Aggiungere 3,5 µ l 400 mM acquosa IAA (concentrazione attiva IAA: 6 mM) e incubare a RT e oscurità per 30 min per alchilare cisteine.
- Preparare il kit etichettatura isobarico (ad es., reagente di etichettatura isobarico 10plex Tandem massa Tag). Consentire i flaconi di reagente di etichettatura isobarico raggiungere RT prima di aprirli per evitare idratazione reagente inutili, 41 µ l di acetonitrile di grado HPLC (AcN) e sciogliere di movimentazione delicata per 5 min.
- Trasferire 30 µ l di soluzione di reagente di etichettatura isobarica all'esempio corrispondente e incubare per 1h a RT in agitazione delicata. Il reagente di etichettatura isobarico include un gruppo di NHS-estere che reagisce con le ammine primarie presenti al peptide N-termini nonché con residui di lisina.
- Aggiungere 8 µ l di 5% idrossilammina (idrossilammina concentrazione attiva: 0,16%) e agitare delicatamente a RT per 20 min per placare la reazione di etichettatura. Poiché i campioni etichettati separatamente devono essere combinati, in modo che l'etichettatura reazione è spenta. Tramite l'aggiunta di un'abbondanza dei gruppi amminici sottoforma di idrossilammina, il reagente restante di etichettatura isobarico è consentito di reagire ed è così resi inerte.
- Combinare il contenuto di ciascuno dei 10 campioni etichettati singolarmente in un tubo in polipropilene singolo 15 mL.
- Aggiungere 6,4 mL di acqua deionizzata al campione combinato e vortice brevemente per ridurre la concentrazione di AcN dal 12% al 3% e alla concentrazione di GdnHCl GdnHCl a inferiore a 1 M come una concentrazione maggiore è stato osservato per causare talvolta la lisciviazione delle sostanze polimeriche dai dispositivi di filtro.
4. peso molecolare cut-off filtrazione
- Al fine di rimuovere potenziali contaminanti, condizione il MWCO filtri caricando 10 mL di acquosa 1 M GdnHCl, 25mm TEAB e centrifugazione per 15 min a 2.500 x g e RT, scartare il flusso continuo (FT).
- Caricare il volume intero campione sul filtro (5ml non etichettati CSF (punto 2.5) o 10 mL isobarically-labelled CSF (punto 3.9)) e centrifugare per 30 min a 2.500 x g e RT, lasciare il flusso continuo (FT) nel contenitore di raccolta. Il risultato della filtrazione è che peptidi e proteine di piccole dimensioni sono separati da detriti cellulari più grandi proteine e residuo. Questo passaggio può essere visto come l'equivalente all'uso di digestione proteolitica delle proteine peptidomica per generare peptidi in esperimenti di proteomica.
- Caricare 5 mL di 25mm TEAB (acquosa) sui filtri e centrifugare per 15 min 2.500 x g e RT, al fine di aumentare il recupero dei peptidi.
- Vortice FTs combinato nei due passaggi precedenti (un totale 10 mL di non etichettati o 15 mL isobarically etichettato campione) e procedere all'acidificazione del campione.
5. de-salatura e campione Clean-up di estrazione in fase solida
- Acidificare il campione filtrato dal passo 4.4 prima dell'estrazione in fase solida (SPE). L'acidificazione è eseguita al fine di migliorare l'interazione di soluto (peptide) con la fase stazionaria della SPE-cartuccia.
- Per l'esempio non etichettati (volume 10 mL): 550 µ l di 1% di acido trifluoroacetico (TFA) - volume totale del campione: 10,55 mL con 0,05% TFA.
- Per l'esempio isobarica-etichettati (volume 15 mL): aggiungere 20 mL 0,1% TFA per acidificare e ridurre la concentrazione di AcN dal 3% al 1% - volume totale del campione: 30 mL con 0,066% TFA.
Nota: Il TFA è aggiunto anche per la sua funzione come un reagente di abbinamento dello ione, che migliora il ritegno dei peptidi non se stessi in grado di interazione idrofobica sufficientemente forte con il materiale di imballaggio della cartuccia SPE devono essere conservati. - Se pH > 3, titolare il campione con acido fosforico al 20%, fino a quando il pH del campione è < 3.
- Condizionare le cartucce SPE aggiungendo 1 mL di 84% AcN, 0,1% di acido formico (FA) e scartare il FT. Ripetere una volta. Condizionamento della cartuccia del filtro è necessaria per rimuovere sostanze indesiderate che sarebbero altrimenti eluire con i peptidi nei passaggi successivi; ulteriormente, condizionata aumenta permeabilità del filtro.
- Equilibrare la cartuccia SPE aggiungendo 1 mL di 0,1% TFA, scartare FT. Ripeti una volta. Assicurarsi che il filtro non viene eseguito a secco dopo l'ultimo passo di equilibrazione - tenere un piccolo volume sulla parte superiore del filtro. Equilibratura del filtro cartuccia viene eseguita al fine di preparare il filtro che trattiene peptidi rimuovendo la sostanza idrofoba (acetonitrile) lasciato dalla fase di condizionamento.
- Caricare il volume intero campione (10,55 mL per campioni non etichettati o 30 mL per campioni etichettati isobarically), in varie porzioni, se necessario e lasciate che il FT in rifiuti. Assicurarsi che la cartuccia non funzionare a secca tra turni di carico del campione o dopo l'ultimo volume di campione è stato caricato - tenere un piccolo volume sulla parte superiore del filtro.
- Passare 1 mL di 0,1% TFA sopra i filtri per rimuovere sali e reagenti e scartare la ripetizione FT. una volta. Assicurarsi che la cartuccia non viene eseguito a secco dopo ogni fase di lavaggio - tenere un piccolo volume di liquido sopra la cartuccia.
- 1.5 luogo di micro obbligatoria bassa mL Centrifugare i tubi sotto la cartuccia ed eluire il campione mediante il passaggio di 1 mL di 84% AcN, 0,1% FA sopra la cartuccia.
- Rimuovere i solventi dall'esempio de-salata per evaporazione in una centrifuga vuoto eseguita senza riscaldamento attivo finché non si asciuga, conservare a-80 ° C o procedere immediatamente al frazionamento di alto pH.
6. offline ad alta pH invertire fase HPLC campione frazionamento
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Preparare le fasi mobili acquosa ad alta pH (HpH):
HpH Buffer a: Acqua pura
HpH Buffer b: 84% AcN
HpH Buffer c: 25mm NH4OH
Buffer di caricamento HpH: 2,5 mM NH4OH, 2% AcN
Nota: Il tampone di caricamento HpH è utilizzato come buffer di esempio e la soluzione di trasporto - Ri-sciogliere il campione in 16 µ l di tampone di caricamento HpH di movimentazione delicata per 20 min
- Caricare 15 µ l del campione su un sistema HPLC con un collezionista di frazione interna per piastre da 96-profondo-pozzetti configurato secondo Mohammed et al. 20 con piccole modifiche. Frazionare un flusso di 100 µ l/min su una colonna di separazione pH-stabile (C18 3,5 µm, 2,1 mm x 250 mm) e raccogliere una frazione al minuto su una sfumatura lineare 60 min.
- Utilizzare i seguenti gradienti tempo-punti: t = 0 min, B = 1%, C = 10%; t = 4 min, B = 1%, C = 10%, inizio raccolta della frazione; t = 76 min, B = 70%, C = 10%; raccolta della frazione fine; t = 76,5 min, B = 85%, C = 10%; t = 80 min, B = 85%, C = 10%; t = 80,5 min, B = 1%, C = 10% e t = 90 min, B = 1%, C = 10%.
- Raccogliere le frazioni in modo ripetitivo a 12 pozzetti in un modello circolare, quindi concatenando frazioni intervallate da 12 min, conseguente 12 frazioni, ognuna contenente 6 sub-frazioni concatenate.
- Togliere il solvente da campioni mediante centrifugazione vuoto a RT e 3000 giri/min fino a secco e conservare i campioni a-80 ° C prima dell'analisi LC-MS.
7. LC-MS
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Preparare le fasi acquose mobile:
Tampone a: 0,1% FA
Buffer b: FA 0,1%, 84% AcN
Tampone di caricamento: 0.05% TFA, 2% AcN
Nota: Tampone di caricamento viene utilizzato come soluzione di trasporto, tampone e fase mobile per la pompa di carico. - Ri-sciogliere ciascuna delle 12 frazioni con aggiunta di 6 µ l tampone di caricamento e agitazione a temperatura ambiente per 20 min
- Carico 5 µ l campione su un nano-flusso HPLC, operano in configurazione trap colonna (colonna di trappola: 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å formato del poro, dimensione delle particelle di 3 µm; colonna di separazione: C18, 75 µm x 500 mm, 100 Å formato del poro, 2 µm granulometria e di eseguire la separazione del peptide ad una portata di 150 nL/min utilizzando il seguente gradiente: t = 0 min, B = 2%; t = 10 min, B = 2%; t = 11 min, B = 7%; t = 100 min, B = 26%; t = 170 min, B = 45%; t = 175 min, B = 80%; t = 181 min, B = 2% e t = 210 min, B = 2%.
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Eseguire MS su uno spettrometro di massa ibrido ad alta risoluzione collegato per l'HPLC tramite un'interfaccia di nano-ESI. Registrare spettri di scansione completa in modalità MS a un'impostazione di risoluzione di 120.000 (2.0e5 destinazione AGC) sopra la gamma di m/z 350-1.400.
- Azionare lo spettrometro di massa in modalità di acquisizione dati-dipendente, selezionare spettri MS/MS da top dieci picchi più intensi con m/z > 150 ed entro la gamma di intensità 1.0e4-1.0e5 per analisi dello ione di frammento. Isolare gli ioni precursore utilizzando una finestra di isolamento di quadrupolo di 1 m/z, tempo di iniezione massima di 100 ms e la lente di RF al 60%.
- Applicare l'esclusione dinamica con un tempo di esclusione di 15 s e una m/z tolleranza di ± 10 ppm. Eseguire la frammentazione nella cella di dissociazione (HCD) di energia di collisione superiore e registrare MS/MS acquisizioni in orbitrap a un'impostazione di risoluzione di 50.000 (valore di destinazione AGC di 5.0e4).
8. peptide identificazione
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Per identificazione del peptide presentano i RAW-file risultanti dall'analisi spettrometria di massa a un motore di ricerca di proteomica applicando le seguenti impostazioni:
Nota: Nel nostro precedente studio15, tre motori di ricerca; V 2.4 mascotte, Sequest HT e v 7.5 picchi sono stati utilizzati in parallelo e le impostazioni qui specificate sono state impiegate per tutti i tre motori di ricerca, se non diversamente specificato. La maggior parte delle impostazioni regolabili è universale per l'identificazione di peptidi/proteine e dovrebbe avere le impostazioni corrispondenti in qualsiasi motore di ricerca fornito.
Selettore di spettro:
Precursore di min. massa: Da 350
Max. precursore massa: Da 5.000
Tipo di scansione: completo
Soglia di segnale/rumore: 1.5
Ricerca di sequenza di database
Database: UniProt_SwissProt [version2015_11]
Tassonomia: Homo sapiens
Enzima: nessuno
Max. perso fenditure: 0
Strumento (mascotte solo): ESI-trappola
Lunghezza minima del peptide (solo SequestHT): 6
Max. lunghezza del peptide (solo SequestHT): 144
Tolleranza di massa precursore: 15 ppm
Frammento di tolleranza di massa: Da 0,05
Modifiche statiche: Carbamidomethyl (C); [Se etichettati] TMT10plex (N-termine)
Modifiche dinamiche: ossidazione (M); [Se etichettati] TMT10plex (K)
Peptide-spettro corrispondono validator (PSM)
Caffettiera a filtro (mascotte e Sequest HT solo) o Decoy Fusion (picchi solo)
FDR di destinazione: 0,01
Convalida basata su: q-valore
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Representative Results
Il metodo qui descritto è stato applicato e valutato in tre studi prima dell'introduzione del pre-frazionamento del campione (tabella 1). Il primo studio utilizzato non in linea LC per avvistare le frazioni CSF su una zolla di destinazione MALDI e 730 identificati peptidi endogeni11ha provocato. Nei due studi seguenti, etichettatura isobarica è stato impiegato. Soprattutto in un caso/controllo lo studio simultaneo per l'identificazione e caratterizzazione di biomarcatori potenziali nel CSF endopeptidome e proteoma24e nel secondo studio isobarica etichettatura è stato utilizzato per monitorare gli effetti del trattamento in vivo di un inibitore della γ-secretasi sull'espressione del peptide in CSF oltre 36 h16. Nello studio di caso/controllo 437 peptidi endogeni sono stati identificati, 64 di cui significativamente alterato in concentrazione tra individui con l'annuncio e controlli sani. Il terzo, studio sul trattamento, identificato peptidi endogeni 1798, 11 dei peptidi monitorati potrebbe essere indicato per rispondere al trattamento.
Nel quarto studio, lo scopo era di aumentare il numero di identificati peptidi di CSF, particolarmente per identificare peptidi inferiore-abbondanti. Di conseguenza, pre-frazionamento del peptide di cromatografia HpH-RP era inclusa e un volume di campione 10 volte più grande di CSF è stato utilizzato, con conseguente identificazione di 16.395 peptidi. In questo studio, è stata eseguita alcuna etichettatura isobarica. Oltre al frazionamento del campione, lo studio più recente ha impiegato un'identificazione del peptide combinato approccio, mentre nei primi tre studi è stata effettuata solo una ricerca di singolo database, che per alcuni conti di misura per il maggior numero di peptidi identificato. Confrontando i risultati ottenuti dai motori di ricerca individuali (mascotte, Sequest HT o picchi) dallo studio più recente indica che gli algoritmi utilizzati sono in qualche misura complementari da una quantità relativamente piccola, meno del 15% (2440), di peptidi sono identificato da tutti i tre motori di ricerca (Figura 2). Ulteriormente, la de novo-sequenziamento ricerca motore vette era il più efficiente nella identificazione di peptidi endogeni, ma più di 5.400 peptidi non sarebbero stati identificati se solo vette erano stato utilizzato (Figura 2). L'applicazione di diversi motori di ricerca sullo stesso materiale ha un potenziale più problemi test e questo è stato affrontato con un test di identificazione correttezza13. I dati grezzi acquisiti di MS/MS, come pure tutti i risultati ottenuti nelle ricerche di proteomica dalla prova più recente sono stati resi disponibili nel repository di dati orgoglio via ProteomeXchange con identificatore PXD004863.
Figura 1: una combinazione di protocollo visualizzare i passaggi principali del metodo. Estrazione di liquido cerebrospinale dalla puntura lombare, seguita da centrifugazione per rimuovere il materiale non solubile, 2) aggiunta di GdnHCl al campione per dissociare aggregati di peptide-proteici, aumentando il recupero di peptidi endogeni; riduzione e alchilazione di Bisolfuri di cisteina; filtrazione di peso molecolare isobarica etichettatura per la quantificazione del peptide (opzionale) 3) per separare i peptidi endogeni da proteine, 4) estrazione in fase solida per rimuovere sali e altri contaminanti polari, 5) pre-frazionamento RP HPLC, alcalina gradiente di fase mobile e la concatenazione di ogni frazione dith 12, 6) gradiente fase mobile RP HPLC-MS/MS, acidulo, ogni frazione concatenati eseguire consecutivamente, 7) identificazione del peptide eseguita inviando i dati di MS/MS da tutte le esecuzioni di analisi 12 come un singolo campione per i motori di ricerca, successivamente gli ID del peptide sono stati confrontati e una sommatoria di tutte unica peptide IDs è stato effettuato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Sommario di studio | TMT etichettatura (y/n) | Frazionamento di HpH-RP (y/n) | Corrispondente volume di CSF per MS-analisi (µ l) | Numero dei peptidi identificati | Commento | Riferimento |
| Analisi esplorativa di CSF peptidome | n | n | 500 | 730 | Preparazione di offline LC MALDI destinazione, MALDI-MS; valutazione di MWCO filtri | 4 |
| Confronto quantitativo dei peptidi di CSF; campioni da 20 + Ctrl 8 | y | n | 200 | 437 | HPLC-ESI MS; peptidomica combinato e protocollo di proteomica | 25 |
| Studio sul trattamento dell'inibitore AD gamma secretasi | y | n | 300 | 1798 | HPLC-ESI MS; CSF estratte a sei punti di tempo dopo il trattamento | 17 |
| Il peptidome di CSF in espansione | n | y | 750-1000 | 18.031 | HPLC-ESI MS; combinazione di software di identificazione del peptide | 15 |
Tabella 1: Una compilation di recenti studi condotti da questo gruppo che si applica di filtrazione di peso molecolare e analisi di spettrometria di massa per l'identificazione di peptidi endogeni in CSF umano.
Figura 2: un diagramma di Venn confrontando i risultati di identificazione di peptidi ottenuti da ciascuno dei tre motori di ricerca mascotte, Sequest HT e cime. Un totale di 16.395 peptidi endogeni sono stati identificati. De novo-sequenziamento picchi di motore di ricerca identificati 10.967 peptidi endogeni; motori di ricerca di basati su impronte digitali agli ioni frammento mascotte e Sequest HT identificati peptidi endogeni 8118 e 7304 rispettivamente. Il consenso di identificazione tra tutti i motori di ricerca tre ammontava a 2440 peptidi endogeni o 14,8%. C'era una sovrapposizione di identificazione relativamente grande tra mascotte e Sequest HT, pari al 70% delle relative identificazioni di peptide combinato. PICCHI avevano un'identificazione comparativamente piccola sovrapposizione con mascotte e la Sequest HT; 20,5% e del 18,9% rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'introduzione di un passaggio di pre-frazionamento di RP HPLC alto pH per un protocollo precedentemente sviluppato per il recupero di peptidi endogeni di peso molecolare ultrafiltrazione11 ridotta complessità relativa del campione e quindi consentito per un 5 volte maggiore volume di campione da studiare. Questo, a sua volta, ha aumentato la concentrazione del sottoinsieme di peptidi presenti in ogni frazione e quindi migliorato la probabilità di rilevare peptidi abbondanti bassi.
Eseguendo una strategia di identificazione per peptidi endogeni che impiegava tre software di proteomica in parallelo, è stato possibile ampliare il noto endopeptidome di CSF più di 10 volte. Un totale di 16.395 peptidi endogeni sono stati identificati in una prova preliminare su un materiale di campione di CSF in pool. Tra le identificazioni erano un gran numero di peptidi endogeni derivati da proteine precedentemente notati nel contesto delle patologie neurodegenerative. Diversi peptidi identificati negli studi sopra attualmente stanno valutandi come biomarcatori nel nostro laboratorio. Questo processo prevede diversi passaggi, compresa la verifica delle identità dei peptidi di chiodare CSF con analoghi sintetici etichettati con isotopi pesanti, istituzione di mirate analisi spettrometrihe di massa, valutare la stabilità del peptide durante lo stoccaggio e gelo-disgelo cicli e analizzare diverse coorti cliniche.
Il protocollo originale sono state apportate modifiche al fine di evitare l'introduzione di contaminanti (passaggi 2.5 e 3.5) in conseguenza di un'alta concentrazione di GdnHCl nel campione durante MWCO-filtrazione. È stato eseguito un aggiornamento al gradiente pre-frazionamento (punto 6.3.1), capacità prolungata, lineare sfumatura viene utilizzata.
Le principali cause di perdite di analita nel protocollo qui descritto possono essere attribuite per i due passaggi cromatografici RP così come la filtrazione MWCO e campione SPE ripulire il passaggio.
Il peptide perdite a causa dell'interazione con il MWCO-filtro, o proteine mantenuti su di esso, durante la filtrazione sono difficili da evitare e possono essere una fonte di inter campione variazione.
Ulteriori perdite selettive probabile presentano nei passaggi RP-cromatografica. Poiché idrofobicità del peptide è pH-dipendente, esecuzione di due passaggi cromatografici di RP consecutivi alle alte e basse pH, rispettivamente, possono portare a perdite del sottoinsieme di peptidi che sono troppo idrofila a pH ≥9 devono essere conservati sulla colonna e allo stesso modo un secondo sottoinsieme troppo idrofila a pH ≤ 3 devono essere conservati.
Rispetto ai metodi precedenti l'occupazione di pre-frazionamento ha portato ad un aumento di 10 volte nell'identificazione di peptidi endogeni. Ha permesso per rilevamento di successo di un gran numero di peptidi precedentemente non identificati e pertanto è uno strumento prezioso nello studio e nell'esplorazione del peptidome di CSF e possibilmente altri campioni biologici complessi pure.
Combinato con una etichettatura isobarica multiplex, che il protocollo è destinato a essere applicati per identificare i candidati biomarcatore per vari disordini neurodegenerative in CSF, sangue e tessuto cerebrale.
Recupero variabile nei passaggi di preparazione del campione contribuisce alla variazione analitica per l'analisi di CSF proteine e peptidi mediante LC-MS. esecuzione isobarica etichettatura di peptidi in una fase iniziale nel campione preparazione diminuisce l'influenza di tali variazione notevolmente. Rispetto ai protocolli di preparazione del campione precedentemente segnalati, l'implementazione di pre-frazionamento peptide di fase inversa ad alta pH aumentato il numero dei peptidi identificati di un fattore 5. Identificazione di peptidi endogeni da MS/MS-dati è stato migliorato in modo significativo quando si combinano i programmi di software di identificazione diversi peptidi, che impiegano algoritmi di ricerca diversi.
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Disclosures
Interessi concorrenti, finanziari o di altro, tra gli autori non sono stati segnalati.
Acknowledgments
Molte grazie Tanveer Batth e colleghi per la consulenza in impostare il metodo di pre-frazionamento.
Quest'opera è stata sostenuta da finanziamenti dal Consiglio svedese della ricerca, la Wallström e Sjöblom Foundation, la pistola e Bertil Stohne Fondazione Stiftelse, la Fondazione di Bergwall Magnus, Åhlén Foundation, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor, Knut e Alice Wallenberg Foundation, Frimurarestiftelsen e FoU-Västra Götalandsregionen.
I principali destinatari dei finanziamenti per questo progetto erano Kaj Blennow, Henrik Zetterberg e Johan Gobom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
References
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al.
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).
- Spellman, D. S., et al. Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF. Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).
- Höglund, K., et al. Alzheimer's disease—Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria. Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).
- Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).
- Yuan, X., Desiderio, D. M.
- Berven, F. S., et al. Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome. Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).
- Zougman, A., et al. Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).
- Holtta, M., et al. Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS. PLoS One. 7 (8), e42555 (2012).
- Holtta, M., et al. An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).
- Hansson, K. T., et al.
- Guldbrandsen, A., et al. In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR). Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).
- Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics. J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).
- Hölttä, M., et al. A single dose of the γ-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans. Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11 (2016).
- Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes. J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).
- Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis. J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).
- Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains. J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).
- Hölttä, M., et al. An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).
