Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Sanntid skjelvende-indusert konvertering analysen for påvisning av CWD prioner i Fecal materiale

Published: September 29, 2017 doi: 10.3791/56373
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 3, 1
1Dept. of Ecosystem and Public Health, Calgary Prion Research Units, Faculty of Veterinary Medicine, University of Calgary, 2Dept. of Molecular Biology, University of Wyoming, 3Canadian Food Inspection Agency, Lethbridge Laboratories
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å beskrive en enkel, rask og effektiv prion forsterkning teknikk, sanntid skjelvende-indusert (RT-QuIC) konverteringsmetoden.

Abstract

RT-QuIC teknikken er en følsom i vitro celle-fri prion forsterkning analysen basert hovedsakelig på seeded misfolding og aggregering av rekombinant prion protein (PrP) substrat bruke prion frø som mal for konvertering. RT-QuIC er en høy gjennomstrømming teknikken som er analoge til sanntids polymerasekjedereaksjons (PCR). Påvisning av amyloid fibril vekst er basert på fargestoff Thioflavin T, som fluoresces på bestemt interaksjon med ᵦ ark rik proteiner. Amyloid formasjon kan dermed oppdages i sanntid. Vi forsøkte å utvikle en pålitelig ikke-invasiv screening test for å oppdage kronisk herjer sykdom (CWD) prioner i fecal ekstrakt. Her har vi spesielt tilpasset RT-QuIC teknikken å avsløre PrPSc seeding aktivitet i avføringen til CWD infisert cervids. I utgangspunktet var seeding aktiviteten av fecal ekstrakter vi forberedt relativt lav i RT-QuIC, muligens på grunn av potensielle analysen hemmere i fecal materiale. Å forbedre seeding aktivitet av avføring ekstrakter og fjerne potensielle analysen hemmere, homogenisert vi fecal prøvene i en buffer som inneholder vaskemidler og proteasehemmere. Sendte vi også prøver å forskjellige metoder å satse PrPSc basert på protein nedbør natrium phosphotungstic syre og sentrifugalkraften. Til slutt, avføring ekstrakter ble testet av optimalisert RT-QuIC som inkluderte substrat erstatning i protokollen å forbedre følsomheten til gjenkjenning. Dermed har vi etablert en protokoll for følsom påvisning av CWD prion seeding aktivitet i avføringen til prekliniske og kliniske cervids av RT-QuIC, som kan være et praktisk verktøy for ikke-invasiv CWD diagnose.

Introduction

Prionsykdommer eller smittsomme kugalskap Anne encephalopathies (TSE) er nevrodegenerative lidelser inkludert Creutzfeldt - Jakobssykdom (CJD) hos mennesker, kugalskap (BSE) i storfe, Skrapesyke sauer og geiter og kronisk sløse sykdom (CWD) i cervids 1,2. TSEs kjennetegnes av særegne kugalskap Anne utseende og tap av nerveceller i hjernen. Ifølge hypotesen "bare protein" består prioner hovedsakelig av PrPSc ("Sc" for Skrapesyke) 3, en misfolded isoformen av vert-kodet mobilnettet prion protein, PrPC. PrPSc resultat av konvertering av PrPC i en konformasjon beriket i ᵦ-ark 4,5,6 som kan fungere som et frø å binde og konvertere andre PrPC molekyler. Nyopprettede PrPSc molekylene er innlemmet i et voksende polymer 7,8 som bryter inn i mindre oligomers, noe som resulterer i høyere antall smittsomme kjerner. PrPSc er utsatt for aggregering og delvis motstandsdyktige mot proteaser 9,10.

CWD påvirker ville og Oppdrettede elg (Cervus canadensis), muldyr hjort (Odocoileus hemionus), Hvithalehjort (WTD; Odocoileus virginianus), elg (av av) og reinsdyr (gode tarandus tarandus) 11,12,13. Det anses mest smittsom prion sykdommen med vannrette overføring foretrekkes av cervid vekselsvirkningene og miljømessige utholdenhet infectivity 14,15. I motsetning til andre prionsykdommer der PrPSc akkumulering og infectivity er begrenset til hjernen, i CWD finnes disse også i perifere vev og kroppsvæsker f.eks spytt, urin og avføring 16,17, 18.

Immunohistochemistry regnes gullstandarden for CWD diagnose å oppdage PrPSc distribusjon og kugalskap Anne lesjoner 19,20. ELISA og i mer sjeldne tilfeller western blot brukes også for CWD diagnostikk. Dermed er gjeldende prion sykdom diagnose hovedsakelig basert på oppdage prioner obduksjon vev. Ante-mortem diagnose for CWD er tilgjengelig ved å ta mandlene eller recto-anal mucosa-assosiert lymfoid vev (RAMALT) biopsier; men denne prosedyren er invasiv og krever erobringen av dyrene. Dermed ville bruk av lett tilgjengelig prøver, som urin og avføring, være en praktisk måte for CWD prion gjenkjenning. Men disse ekskrementer harbor relativt lave konsentrasjoner av prioner under gjenkjenning grensen på gjeldende diagnostiske metoder. Derfor er et mer følsom og høy gjennomstrømning diagnostisk verktøy nødvendig. In vitro konvertering systemer, for eksempel protein misfolding syklisk forsterkning analysen (PMCA) 21, amyloid seeding analysen, og sanntids skjelvende-indusert konvertering (RT-QuIC) analysen 22,23, 24 er svært kraftige verktøy å utnytte PrPSc selv-forplanter evnen til å etterligne i vitro prion konverteringen, og dermed forsterke tilstedeværelsen av minutt mengder PrPSc til Detektbart nivåer 25 ,26. Metoden RT-QuIC imidlertid tar nytte av det faktum at konvertering produktet beriket β arks sekundære struktur kan spesielt binde thioflavin T (Th-T). Derfor vokser rekombinant PrP (rPrP) på frø konvertering til amyloid fibrils som binder Th-T og dermed kan oppdages i sanntid ved å måle fluorescens av Th-T uttrykt som relative fluorescens enheter (RFU) over tid. Når overvåket, kan RFU brukes til å evaluere relativ seeding aktiviteter og kvantitative parametere som lag fasen. Lag fasen representerer klokkeslettet (h) kreves for å nå terskelen, under hvilke rPrP konvertering på et tidlig stadium av reaksjonen er under gjenkjenning grensen på Th-T fluorescens. Slutten av den tilsynelatende lag fasen, samtidig til dannelsen av en tilstrekkelig amyloid kjerne (nucleation/forlengelse), oppstår når Th-T fluorescens overskrider terskelen nivået og positivt. Veksten av amyloid fibrils kan oppdages i sanntid og første PrPSc eller seeding aktivitet i prøven forsterkes av segmentering som genererer flere frø. Disse frø indusere igjen en rask eksponentiell vekstfase amyloid fiber.

Fordi denne analysen er kjøpedyktig merker så lavt som 1 fg PrPSc 24, høy følsomhet kvalifiserer denne teknikken å oppnå ante mortem eller ikke-invasiv diagnose av oppdager PrPSc i ulike perifere vev, ekskrementer eller andre typer prøven skjuler lave nivåer av infectivity. RT-QuIC absolutt gir fordeler over andre analyser for reproduserbarhet, praktiske, hurtighet (mindre enn 50 h) og lave kostnader i forhold til bioassay. Det unngår tekniske kompleksiteten som sonication brukt i PMCA; også er det utført i en tape-forseglet microplate som reduserer risikoen for Aerosolforurensning i hver brønn. Flere godt formatet gjør det mulig for analyse av opptil 96 prøvene i samme eksperiment. For å motvirke tilbakevendende problemet med falske positiver og spontan konvertering av rPrP i i vitro konvertering analyser er gjennomføringen av en terskel (cut-off) i RT-QuIC svært nyttig. Faktisk defineres basert på resultatene av kontrollen negative (gjennomsnittlig RFU negative prøver 5 SD 27), en grunnlinje som diskriminering mellom positive og negative eksempler kan gjøres. Bruk av fire gjentak for hvert utvalg kan dermed bidra til å definere et utvalg som positive når minst 50% av replikat viser et positivt signal, kors dvs cut-off 28. Homologi mellom frø og underlaget er ikke nødvendig i RT-QuIC, som f.eks i en tidligere studie, hamster rPrP ble funnet å være en mer sensitivt underlag sammenlignet med homologe underlaget i menneskelig PrPvCJD seeded og sauer Skrapesyke seeded reaksjoner 29. hamster-sauer chimeric rPrP ble også foreslått for å være et mer egnet medium enn menneskelig rPrP å oppdage menneskelige varianten CJD prioner 30. Dermed er bruk av rPrP underlag fra ulike arter svært vanlig i denne analysen. Denne analysen har blitt aktivert for flere prionsykdommer, som sporadisk CJD 31,32,33, genetikk prion sykdommer 34, BSE 35,36,37, Skrapesyke 23,36og CWD 38,39,40,41, 42. Studier med behandlet Cerebrospinalvæske, hele blod, spytt og urin som frø i RT-QuIC klarte alle å oppdage PrPSc 38,39,40,41, 42. å fremme oppdagelsen evnen i prøver som blodplasma som kan inneholde hemmere av amyloid formasjon, Orrú et al. (2011) utviklet en strategi for å fjerne potensielle hemmere av amyloid dannelsen av gre PrPSc immunoprecipitation (IP) trinn og RT-QuIC, kalt "forbedret QuIC" analysen (eQuIC). I tillegg ble et substrat erstatning skritt ansatt etter ~ 24 h reaksjon for å forbedre følsomheten. Til slutt, som lavt som 1 ag i PrPSc var detectable av eQuIC 30.

For å rense avføring ekstrakter og fjerne mulig analysen hemmere i avføring, ble fecal prøver innsamlet på prekliniske og kliniske stadier fra elg på eksperimentell oral smitte homogenisert buffer inneholder vaskemidler og proteasehemmere. Avføring ekstrakter ble ytterligere sendt til ulike metoder til å konsentrere PrPSc i eksemplene bruker protein nedbør via natrium phosphotungstic syre (NaPTA) nedbør. Metoden NaPTA nedbør, først beskrevet av Safar et al. 43, brukes til å konsentrere PrPSc i test prøver. Inkubasjonstiden for NaPTA prøven resultatene i fortrinnsrett nedbør PrPSc i stedet for PrPC. Molekylær mekanismen er imidlertid uklart. Dette trinnet hjalp også inneholder og hindre spontan konvertering av rPrP, som er observert i noen tilfeller. Til slutt, avføring ekstrakter ble testet av optimalisert RT-QuIC bruker musen rPrP (aa 23-231) som et substrat og inkludert substrat erstatning i protokollen å forbedre følsomheten til gjenkjenning.

Resultater her viser at denne forbedret metoden finner svært lave konsentrasjoner av CWD prioner og øker følsomheten til gjenkjenning og spesifisitet i fecal prøver i forhold til en protokoll uten NaPTA nedbør og underlaget erstatning. Denne metoden potensielt kan brukes til andre vev og kroppsvæsker og kan være av stor bruk for CWD overvåking i vill og fange cervids.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. RT-QuIC bruker Fecal materiale

  1. utarbeidelse av cervid avføring ekstrakter
    1. gjør fecal homogenate ved å legge 1 g av fecal materiale til 10 mL av avføring ekstra buffer (20 mM natrium fosfat, pH 7.1, 130 mM NaCl, 0,05% mellom 20, 1 mM PMSF og 1 x komplett proteasehemmere, EDTA-fri) å gi en endelig konsentrasjon på 10% (w/v). Homogenisering bufferen kan være forberedt før utnyttelse og lagret på -20 ° C.
    2. Homogenize fecal pellets (1 g) og buffer (10 mL) i rør (f.eks gentleMACS M rør) bruker en dissociator med en pre-set program fra produsenten for proteiner i 1 min i romtemperatur. Gjenta dette trinnet to til tre ganger til fecal prøvene er helt homogenisert i bufferen.
    3. Forsegle rør med parafilm og plassere dem på en rocking plattform eller roterende shaker for en 1t inkubasjon ved romtemperatur.
    4. Sentrifuge rørene på 18 000 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
    5. Samle supernatants som inneholder proteinet ut og aliquot dem til 1,5 mL rør. Dele kan lagres på-80 ° C for videre søknader.
  2. Konsentrasjon av PrP Sc i avføring ekstrakter
    Merk: for å konsentrere seg CWD prioner i avføring ekstrakt prøvene, og dermed bedre følsomheten til oppdagelsen av RT-QuIC, legges et protein nedbør skritt i protokollen.
    1. NaPTA nedbør metoden
    2. legge til 250 µL av 10% (w/v) av N-lauryl sarcosinate (sarkosyl) til 1 mL av fecal protein pakke for å gi en endelig konsentrasjon av sarkosyl på 2% (v/v).
    3. Tette rørene som inneholder prøvene med parafilm og ruge på 37 ° C i 30 min under konstant rister på 1400 rpm i en thermomixer.
    4. Juster blanding av fecal protein ekstrakt og sarkosyl med en lagerløsning 10 prosent (w/v) av natrium phosphotungstic syre og 170 mM magnesiumklorid, pH 7.4 å få en endelig konsentrasjon av 0,3% (w/v) natrium phosphotungstic syre i prøvene.
    5. Ruge prøvene ved 37 ° C i 2 timer med konstant rister på 400 rpm.
    6. Sentrifuge prøvene ved 14 ° C for 30 min på 15,800 x g. fjerner supernatants nøye.
    7. Vask pellets ved resuspending dem i vaskebuffer (10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0,5% Triton-X 100, 10 mM EDTA, 0,5% natrium deoxycholate (w/v) og 0,1% sarkosyl (w/v)).
    8. Sentrifuge prøvene ved 14 ° C for 15 min på 15,800 x g. fjerner supernatants nøye.
    9. Resuspend pellets i 100 µL (1/10 av det originale volumet av fecal protein ekstrakt) RT-QuIC fortynning bufferen.
      Merk: RT-QuIC fortynning buffer (20 mM natrium fosfat, pH 6,9 130 mM NaCl, 0,1% SDS (w/v) og 1 X N2 supplement) forberedes før bruk. Et totalt volum på 10 mL er filtrert gjennom et 0,2 µm acrodisc sprøyte filter bruker en sprøyte og deretter lagret på 20 ° C før bruk.
    10. Lagre NaPTA behandlet prøver på 20 ° C til utnytte dem i RT-QuIC analysen.
  3. RT-QuIC analysen
    1. forberede en fersk 10 mM Th-T lagerløsning (0.032 g av Th-T i 10 mL av double destillert H 2 O).
    2. Gjør en fortynning av 1:10 Th-t lagerløsning i double destillert H 2 O for å gjøre en siste konsentrasjon av Th-T 1 mm filteret gjennom 0,2 µm acrodisc sprøyte filtrere ved hjelp av en sprøyte.
    3. Tine musen rekombinant PrP (rPrP, aa 23-231) substrat (10 µg/mL per RT-QuIC reaksjon) lagret på-80 ° C på ice.
    4. Last 500 µL rPrP substrat samtidig i 100 kDa størrelse utelukkelse filteret microtubes og sentrifuge 14.000 x g for 5 min ved romtemperatur (ett rør/filter kan brukes opptil to ganger).
    5. Overføre eluted underlaget i en bakteriefri 1.5 mL tube og holde det ved 4 ° C før bruk.
    6. Tine RT-QuIC fortynning buffer lagret på -20 ° C.
    7. Gjør fortynninger av frø (fecal protein ekstrakt) i RT-QuIC fortynning buffer:
      Ufortynnet eksempel: bruke fecal protein ekstrakt ufortynnet
      utvannet 2 x 10 -1
      utvannet 2 x 10 -2
      utvannet 2 x 10 -3
    8. forberede lager løsninger RT-QuIC reaksjonsblandingen:
      fosfat-bufret saltvann ( PBS): 5 X
      NaCl: 2 M lager løsning av NaCl i double destillert H 2 O.
      EDTA: 100 mM lagerløsning av EDTA i dobbel destillert H 2 O.
    9. Før utnyttelse av alle løsningene (trinn 1.3.8), filtrere hver løsning separat gjennom et 0,2 µm acrodisc sprøyte filter bruker en sprøyte og holde dem sterile i romtemperatur.
    10. Forberede et totalt volum på RT-QuIC reaksjonsblandingen av antall prøver (98 µL volumet av reaksjon per prøve og fire replikerer per prøve) brukes pluss 10% av volumet for å sikre at du har nok blanding for alle reaksjonene.
      1. Bruk en 15 mL tube å forberede RT-QuIC reaksjonsblandingen (20 mM natrium fosfat, pH 6,9 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 µM Th-T, 10 µg/mL rPrP substrat og dobbel destillert vann justere rPrP siste konsentrasjonen i reaksjonen) bruker lager sol utions.
      2. Blande alle løsningene godt av pipettering opp og ned bruker en pipette med filter tips. Unngå så mye som mulig bruk av vortex.
      3. Hell blandingen i en 50 mL disponibel pipettering reservoaret.
      4. Bruker en flerkanals pipette laste inn 98 µL av RT-QuIC reaksjonsblandingen i hver brønn av en 96-brønns optisk bunnplaten.
    11. Legge til hver RT-QuIC reaksjon 2 µL av ufortynnet eller 10 ganger serielt utvannet fecal protein ekstrakt. Test hvert utvalg i fire gjentak.
      Merk: I hvert eksperiment, seriell fortynninger av fecal prøver (alt fra ufortynnet til 2 x 10 -3) fra CWD-negativ og bekreftet CWD-positive dyr brukes som negative og positive kontroller, henholdsvis.
    12. Forsegle platen med en tetting tape før incubating inne en plate leser på 42 ° C i 25t med gjentatte sykluser av 1 min dobbel orbital risting (700 rpm) og 1 min hviler hele inkubasjon.
    13. Definere fluorescens måleinnstillinger:
      Eksitasjon: 450 nm
      utslipp: 480 nm
      bunnen lese, antallet blinker: 20
      manuell gevinst: 1000 (avhenger på apparat)
      integrasjon tid: 20 µs
    14. fjerne plate fra platen leseren på slutten av den 25 h.
    15. Spinne ned platen 3000 x g for 3 min å unngå potensielle forurensning mellom brønnene.
    16. Fjern forseglingen fra platen.
    17. Forberede en ny 96-brønns plate ved å legge til 90 µL av RT-QuIC reaksjonsblandingen inneholder ferske substrat og frisk fluorescens fargestoff Th-T som beskrevet i delen 1.3.1 til 1.3.6.
    18. Overføre 10 µL fra hver brønn av første plate til den nylig forberedt 96 godt plate.
    19. Forsegle den nye platen og fortsette RT-QuIC analysen ytterligere 50 h følge fremgangsmåten i trinn 1.3.13. Dette ekstra trinnet i 50 h vil gjøre totale reaksjonstid på 75 t.
      Merk: Alle prosedyrer for RT-QuIC analysen er gjort under biosikkerhet cab.
    20. Samle data.
      1. Lese og dokumentet Th-T fluorescens signalet fra hver brønn hver 15 min.
      2. Samle data totalt sykluser med dataanalyse programvare og overføring til et regneark med gjennomsnittet av quadruplicate reaksjoner.
      3. Plot gjennomsnitt for dataene. X-aksen tilsvarer reaksjonstid av RT-QuIC (h) og y-aksen tilsvarer relative fluorescens enheter (RFU). Hver kurve tilsvarer en fortynning av et kjent eksempel.
      4. i hvert eksperiment, avgrense en terskel ved å beregne de høyeste gjennomsnittlige verdiene i kontrollen negative pluss 5 standard avvik som beskrevet i gjeldende publisert litteratur 41.
        MERK: Alle replikater som definerte dørterskelen anses positiv. Hvis minst to av fire gjentak krysser terskelen, prøven er så vurdert positivt.

2. Rensing av rekombinant Prion Protein (rPrP)

  1. bakteriell lager og uttrykk for rPrP
    Merk: Escherichia coli (E. coli) belastning Rosetta (DE3) forvandlet med vektor pET-24 koding på musen PrP (rester 23-231) ble brukt til å forberede til rPrP.
    1. Tine glyserol lager av Rosetta (DE3) forvandlet pEt-24 mPrP(23-231) på ice.
    2. Strek LB (Luria Bertani) plater med en siste konsentrasjon av kanamycin 50 µg/ml og ruge over natten i en 37 ° C inkubator. Kontroller at platene er opp ned å unngå fuktighet kondens i solid media som inneholder bakterier. Forbereder to platene til pass på at veksten i minst én av de to platene.
    3. Forberede 1 L LB og autoklav den slik at den sterile.
    4. Supplement 1 L av sterile LB media med 1 mL av kanamycin (50 mg/mL) og 1 mL av chloramphenicol (34 mg/mL).
    5. Velge en koloni av hver plate med en engangs inokuleringen sløyfe for å vaksinere 3 mL LB medium som inneholder kanamycin og chloramphenicol.
    6. Sted mini-kulturer i en inkubator ved 37 ° C med konstant rister på 225 rpm for 5-6 h.
    7. Legge til mini-kulturene til resten av den opprinnelige 1 l LB medier med Express Autoinduction System 1 for induksjon av protein uttrykk.
    8. Sted kulturen i 2 L kolbe, eller større, i en inkubator ved 37 ° C med konstant rister på 200 rpm for 20-24 h.
    9. Delt 1 L kulturen i 4 x 250 mL sentrifuge rør.
    10. Spinne ned rør som inneholder kulturen 3,750 x g for 20 min ved romtemperatur.
    11. Forkaste nedbryting og samle bakteriell pellets i 50 mL sentrifuge rør, deretter fryse dem ved-80 ° C før videre behandling. Resulterende pellets har veid 3 til 4 g for en god protein avkastning.
  2. Utarbeidelse av inkludering kroppen
    1. tine frosne pellet (3 til 4 g) på 37 ° C i minuttene.
    2. Fryse pellet en gang i 10 min ved-80 ° C og tine igjen. Gjenta dette trinnet for fryses to ganger.
    3. Resuspend den bakterielle pellet i 1 X lysis reagens (f.eks BugBuster Master Mix) av pipettering grundig. Bruke 5 mL av reagens for 1 g bakteriell pellets. Sørg for å helt homogenize blandingen.
    4. Ruge homogenate på en rocker i 20 minutter ved romtemperatur.
    5. Sentrifuge homogenate 16.000 x g for 20 min ved romtemperatur.
    6. Forkaste supernatants av forsiktig helle den av
    7. Homogenize pellets i samme volum 1 X lysis reagens som brukes i forrige trinn.
    8. Ruge homogenate i 15 min på en rocker ved romtemperatur.
    9. Legge til en tilstrekkelig mengde 1:10 (0,1 x) lysis reagens å få en total homogenate volum på 40 mL. Blandingen av inversjon sørge til homogenize vel.
    10. Sentrifuge homogenate 7.900 x g i 15 min 4 ° C.
    11. Forkaste nedbryting av forsiktig helle det.
    12. Resuspend pellet i 40 mL 0,1 x lysis reagens.
    13. Sentrifuge homogenate 16.000 x g i 15 min 4 ° C.
    14. Forkaste nedbryting nøye ved å helle det og lagre pellet med inkludering likene på 20 ° C før videre behandling.
  3. Protein rensing
    1. tine inkludering organer ved romtemperatur.
    2. Oppløse tinte inkludering likene i 14 mL av 8 M guanidine-HCl (38 g Guanidine hydroklorid i 0.1 M NaPO 4 pH 8.0 og fyll suspensjon med H 2 O til 50 mL; ikke endre pH endelige løsning) til solubilize proteiner.
    3. Sørg for å homogenize godt av pipettering opp og ned.
    4. Incubate lysate på en rocker ved romtemperatur for 50 min.
    5. Forberede 18 g av Ni-NTA harpiks perler (18 g for 3 til 4 g bakteriell pellet), skyll med 100 mL vann ved hjelp av vakuum og et 100 mL 0.22 µm flaske topp filter.
      1. Sted den 18 g av Ni-NTA harpiks perler i 50 mL tube og legge tilstrekkelig volum av denaturing buffer (100 mM natrium fosfat, 10 mM Tris, pH 8.0, 6 M guanidine hydroklorid, pH 8) for å gjøre det siste bindet opptil 50 mL.
      2. Equilibrate perlene i denaturing bufferen for 50 min på en rocker ved romtemperatur.
    6. Sentrifuge inkludering kroppen lysate 16.000 x g i 5 min å fjerne uløselig rusk.
    7. Legge til nedbryting equilibrated perler og kast pellets.
    8. Sette blandingen på en rocker for 40 min ved romtemperatur å tillate protein binding til Ni-NTA harpiks.
      Merk: Nikkel chelate perler brukes til å rense PrP av sin nikkel affinitet. Regionen histidin-rik N-terminal PRP gjengir affinitet til nickel(II), som tillater protein binde til nikkel ioner uten alle hans-tag.
    9. Vask FPLC med vann til å rense ut begge linjene (A og B).
    10. Kjøre denaturing buffer (100 mM natrium fosfat, 10 mM Tris, pH 8.0, 6 M guanidine hydroklorid, pH 8) gjennom begge linjene (A og B) Prime systemet (kolonnen ikke er koblet.)
    11. Laste harpiks på kolonnen. Sørg for å minimere luftbobler.
    12. Legge kolonnen til i FPLC og kjøre en lineær gradient fra 100% denaturing buffer A og 0% refolding bufferen B (100 mM natrium fosfat, 10 mM Tris, pH 8.0) først til 0 denaturing buffer og 100% refolding buffer på slutten. Dette gradvis skiftet drives på en flow rate på 0.75 mL/min i 240 minutter og er nødvendig for riktig folding PRP.
      Merk: Under en brukt kromatografiske renselsesprosess, denaturert PrP er først sakte refolded på harpiks ved å bruke en lineær gradient refolding buffer for å erstatte denaturing bufferen. Dette trinnet fjerner også den chaotropic guanidine-HCl.
    13. Sørg 100% refolding buffer fortsetter å strømme gjennom kolonnen for en ytterligere 30 min på 0,75 mL/min.
    14. Skyll linje A med vann etterfulgt av elueringsbufferen (100 mM natrium fosfat, 10 mM Tris, 500 mM imidazole, pH 5,8) omgåelsen kolonnen. Dette vil rense denaturing bufferen som er erstattet nå med elueringsbufferen i AKTA systemet.
    15. Elute proteiner til 2 mL/min ved å kjøre en lineær forløpning i 40 min fra 100% refolding buffer B og 0% elueringsrør buffer A først til 0% refolding buffer og 100% elueringsrør buffer.
      Merk: Den høye konsentrasjonen av imidazole i elueringsbufferen vil konkurrere PrP ' s binding til nickel(II). Den primære protein toppen skal begynne å elute ca 1/3 av veien gjennom graderingen.
      1. Se chromatogram for OD 280 nm øke.
    16. Samle bare rør som inneholder proteinet i sentrum av store toppen.
      Merk: Eluted fraksjoner 2 ml er samlet inn i 15 mL rør.
    17. Fortynne protein i rør umiddelbart med ca 1/3 volum (1 mL) dialyse bufferen (10 mM natrium fosfat, pH 5,8).
    18. Umiddelbart plassere rør på ice.
    19. Pool eluted proteinet i rørene.
    20. Dårlig protein i dialyse kassetter (molekylvekt cut-off 10 kDa).
    21. Sette kassettene i pre kjølt dialyse buffer (3,6 L) for 2t 4 ° c, og deretter overføre kassettene til en frisk dialyse buffer (3,6 L) for overnatting. Gjøre at dialyse bufferen er under konstant agitasjon.
    22. Filtrerer protein etter dialyse gjennom et 0,2 µm acrodisc sprøyte filter bruker en sprøyte.
    23. Måle protein konsentrasjonen med en BCA protein analysen kit.
    24. Konsentrat eller fortynne eventuelt justere protein konsentrasjonen til 0,3 mg/mL.
      Merk: Bekreft renhet av SDS-side og Coomassie blå flekker.
    25. 1 mL dele protein i microcentrifuge rør og umiddelbart lagre ved-80 ° C før videre bruk som beskrevet i RT-QuIC protokollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CWD fecal ekstrakter forberedt på 10% (w/v) kunne frø RT-QuIC reaksjon, men følsomheten til gjenkjenning var lav 27. Bruke en bestemt buffer for fecal homogenisering var et kritisk steg til unngå høye fluorescens i RT-QuIC reaksjoner samtidig bruk av mus rPrP underlaget i stedet for hjort rPrP som kan få mer spesifikke resultater 27. Tillegg av NaPTA nedbør redusert spontan konvertering av rPrP i RT-QuIC (figur 1) uten å hemme forsterkning seeding aktivitet av reaksjoner (figur 2). Selv om bedre forsterkning ble observert på NaPTA behandling, var resulterende fluorescens signaler CWD-positive fecal prøvene fortsatt lav (figur 1). I tillegg nådd prion forsterkning av eksempler et konstant platå på lav fluorescens nivåer. Angir metningen til reaksjoner, som kan skyldes nedbrytning/denaturering av rPrP eller dannelse av av veien aggregater som forbruker rPrP bassenget 30. For å ytterligere forbedre forsterkning av prioner og øke sensitiviteten av gjenkjenning, ble et substrat erstatning skritt innlemmet i protokollen. Innføring av underlaget erstatning for RT-QuIC protokollen (figur 2) økt følsomhet (77%; 14 av 18 prøver RT-QuIC var positiv) og spesifisitet (100%, ingen negative kontrollene i RT-QuIC slått positivt) av deteksjon (se Tabell 1 fra Cheng et al. 27). til slutt, alle disse trinnene (Figur 3) førte til optimalisering av en pålitelig og følsom protokoll RT-QuIC deteksjon av CWD prioner, bruker prøven med lave nivåer av infectivity.

Substrat erstatning ble introdusert etter første 25 h RT-QuIC reaksjon, ved å fylle reaksjon bufferen som inneholder ferske substrat og frisk fluorescens fargestoff Th-T. Ved å introdusere substrat erstatning trinnet i protokollen, ble RT-QuIC reaksjonstid utvidet fra 50 h til 75 h. Som vist i figur 2 med innlemmelse av underlaget erstatning, ble en betydelig forbedring prion forsterkning observert.

Figure 1
Figur 1: redusert spontan konvertering av musen rPrP underlaget i RT-QuIC plantet med renset CWD-negativ fecal homogenate. Fekal homogenates av ikke-infiserte hjort (C181-006) eller muldyr hjort ble homogenisert i avføring ekstrakt buffer for å få en endelig konsentrasjon på 10% (w/v). For rensing, var disse fecal homogenates behandlet og 10 ganger konsentrert av NaPTA nedbør. De urenset fecal homogenates (en), NaPTA-renset og konsentrert skjemaer (b) utvannet som angitt ble brukt til frø quadruplicate RT-QuIC reaksjoner med musen rPrP som et substrat. De y-akser viser relative Th-T fluorescens enheter, x-axes skildrer reaksjonstid. En reduksjon av spontane konverteringer ble sett i NaPTA-renset fecal prøver (b). Data fra Cheng et al. 27. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Forbedret påvisning av CWD prioner i avføring bruker substrat erstatning. Fecal homogenates av personlige elg (C051-05, C052-05) muntlig infisert med CWD prioner ble renset og konsentrert av NaPTA nedbør. NaPTA-behandlet prøver ble utvannet mellom 2 x 10-1 til 2 x 10-3 til frø quadruplicate RT-QuIC reaksjoner med musen rPrP substrat. RT-QuIC analysen ble utført uten substrat erstatning (en) i en fast tidsperiode 50 h eller med innlemmelse av underlaget erstatning for en utvidet inkubasjonstid 75 h (b). For sistnevnte substrat erstatning ble introdusert etter første 25 h RT-QuIC reaksjon. Nitti prosent av reaksjon volumet ble fjernet og erstattet av nylagde RT-QuIC reaksjonsblandingen inneholder rPrP substrat og Th-T. Ved å introdusere substrat erstatning trinnet i protokollen, ble RT-QuIC reaksjonstid utvidet fra 50 h til 75 h. Data fra Cheng et al. 27. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: dataflytskjema beskriver PrPSc fecal utvinning fra CWD-infiserte cervids og seeding aktivitet og prion forsterkning med RT-QuIC analysen. Fecal prøver fra CWD-infiserte dyr er homogenisert i en fecal utvinning buffer, sendt til NaPTA nedbør metoden og testet av RT-QuIC analysen. Sistnevnte ble utført ved å innføre et substrat erstatning skritt. Innlemmelse av NaPTA og underlaget erstatning trinn resulterte i en reduksjon av spontane konvertering og sterk forbedring i seeding aktivitet og prion forsterkning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

RT-QuIC var tidligere ansatt å oppdage CWD prioner i urin og avføring ekstrakter av muntlig infiserte Hvithalehjort og muldyr hjort 38. Systemet vist i dette manuskriptet er en tilpasset RT-QuIC analysen. Forholdsregler ble innlemmet i "klassiske" RT-QuIC analysen å forbedre gjenkjenning og følsomhet til analysen for CWD prioner i fecal materiale av infiserte dyr.

Lav følsomheten til gjenkjenning i avføring ekstrakter ledet oss til forbedring av RT-QuIC protokollen. For å oppnå følsom i vitro påvisning av prioner i avføring, ble avgjørende skritt lagt for eksempel forberedelser for å fjerne komponenter som forstyrrer prion konvertering og/eller overføring og forbedre følsomheten til gjenkjenning. Innlemming substrat utskifting i protokollen av RT-QuIC og NaPTA/sarkosyl behandling var avgjørende for å oppdage seeding aktivitet i prekliniske og kliniske CWD-infiserte elg, og for å forbedre gjenkjenning grensene av prion konvertering i avføring ekstrakter .

NaPTA nedbør er en vanlig teknikk vanligvis ledsaget av sarkosyl utvinning å isolere og konsentrere PrPSc til et synlig nivå. NaPTA er kjent for å utløse fortrinnsvis PrPSc over PrPC 43 mens sarkosyl er et vaskemiddel kjent forenkler prion konvertering ved lave konsentrasjoner i en celle gratis system 44. I tråd med dette, kan en kombinasjon av NaPTA og sarkosyl generere en høyere avkastning av fibrillar aggregater i vitro som vist før 45,46,47. Denne metoden har blitt innarbeidet tidligere i RT-QuIC analysen å oppdage perifere CWD prioner vellykket i prøven som renset spytt 39 og fullblod 40. Vår studie gir første bevis som omfatter NaPTA/sarkosyl rensing i protokollen av fecal eksemplar forberedelse gir CWD prion gjenkjenning av RT-QuIC. Videre med denne metodikken var vi kjøpedyktig nedskrive spontan konvertering av rPrP underlaget i CWD-negativ fecal homogenates i RT-QuIC analysen.

En potensiell mekanisme har blitt foreslått å forklare effekten av underlaget erstatning 30. I de første rundene reaksjon (før tillegg av fersk substrat) legges bare en liten mengde frø til RT-QuIC reaksjoner. Mens bare en del av rPrP er innlemmet i seeded reaksjonene, resten av underlaget kan enten brukes av samspill med vegger av reaksjon plate til skjemaet ikke-amyloid aggregat, eller endres til et skjema som er mindre utsatt for konverteres ved se Ded RT-QuIC produkter i stedet for de opprinnelige frø. Som et resultat, inkorporering av rPrP med frø er langsom, og fibril dannelsen er ikke synlig i lag fase. Som seeded RT-QuIC produktene vokst i lag fase er endelig langstrakt for å nå en "rask montering scene", kan prioner være forsterket raskt av segmentering gjennom risting eller sideutsikt tillegg av mindre mengder. På dette stadiet, er frisk underlaget lagt til reaksjonen lett innlemmet i seeded produkter i stedet for danner uspesifikke aggregat. Innlemmelse av underlaget erstatning trinnet i våre protokollen var en endring som økte følsomhet; Det var nyttig å oppdage prion frø i prøver med en svært lav mengde PrPSc fra pre-klinisk dyr og/eller inneholder hemmende forbindelser.

Bruke RT-QuIC analysen i stedet for PMCA, som er det første i vitro proteinet misfolding forsterkning analysen beskrevet 21har flere fordeler. PMCA er rør ruges og sonicated i et vannbad i sonicator; rør plassert i utkanten av sonicator viser mindre effekten av forsterkning forhold til rør i center 48. RT-QuIC systemet rystelser synes å være lettere å kontrollere. Bruk av en 96 godt format er en stor fordel av RT-QuIC, men mb-PMCA utviklet av Moudjo et al. 49 , 50, viste lignende fordeler, men fortsatt er mindre brukt i PMCA.

Som underlaget bruker RT-QuIC rekombinant rPrP for konvertering; derimot bruker PMCA i de fleste tilfeller normal hjerne homogenate. I tillegg i RT-QuIC er ingen sekvens homologi nødvendig mellom frø og underlaget 51-53.

Sluttproduktet er smittsomme kofaktorer er nødvendig for prion replikasjon i PMCA. Men i RT-QuIC analysen er forsterket PrP ikke smittsomme. I i vitro forsterkning analyser er forekomsten av false positiv reaksjonene sannsynligvis på grunn av spontane konvertering PRPC et tilbakevendende problem. Derfor var til analysen og betingelsene i denne studien skreddersydd for å minimere slike forstyrrelser for å maksimere forskjellen mellom seeded rPrP-konvertering og spontan konvertering.

I konklusjonen, NaPTA/sarkosyl behandling gjør fjerning av analysen hemmere i avføring og reduserer spontan konvertering. Interessant behandling ikke hemme seeding aktiviteten til precipitatedPrPSc. I tillegg ble følsomheten av oppdagelsen betydelig forbedret når substrat erstatning ble samtidig vedtatt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi er takknemlige for Dr. Byron Caughey (NIH Rocky Mountain Laboratories) for å gi opplæring og cervid PrP bakteriell uttrykk plasmider. SG støttes av programmet Canada forskning stol. Vi erkjenner finansiering for denne forskningen til SG fra Genome Canada, Alberta Prion Research Institute og Alberta jordbruk og skogbruk genomet Alberta og University of Calgary for å støtte dette arbeidet. Vi erkjenner et forskningsstipend fra Margaret Gunn Foundation for dyr forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Acrodisc seringe filters PALL 4652
amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit Millipore UCF901024
BD 10 ml seringe VWR CA75846-842
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Corning bottle-top vacuum filters Sigma-Aldrich 431118
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E4884
gentleMACS M Tube Miltenyi Biotec 130-093-236
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich G4505
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615
Luria-Bertani (LB) broth ThermoFisher Scientific 12780029
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M9272
N2 supplement (100X) ThermoFisher Scientific 15502048
N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) Sigma-Aldrich ML9150
Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K PALL OD100C34
Nunc sealing tapes ThermoFisher Scientific 232702
Parafilm M VWR 52858-000
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626
Protease inhibitor tablet Roche 4693159001
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Calbiochem 7910-OP
sodium phosphate Sigma-Aldrich 342483
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma-Aldrich S9763
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich S9638
Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA) Sigma-Aldrich 496626
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516
Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) Sigma-Aldrich T6066
Triton-100 Calbiochem 9410-OP
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949
Name Company Catalog Number Comments
Commercial buffers and solutions
BugBuster Master Mix Nogagen 71456-4
Ni-NTA superflow Qiagen 1018401
Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X) Life Technoligies P5493
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977015
Name Company Catalog Number Comments
Standards and commercial kits
Express Autoinduction System 1 Novagen 71300-4
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Name Company Catalog Number Comments
Equipment setup
AKTA protein purification systems FPLC GE Healthcare Life Sciences
Beckman Avanti J-25 Centrifuge Beckman Coulter
Beckman rotor JA-25.50 Beckman Coulter
Beckman rotor JA-10 Beckman Coulter
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Name Company Catalog Number Comments
Sofware
MARS Data Analysis BMG Labtech
GraphPad Prism6 GraphPad software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion diseases. PLoS Pathog. 2 (3), (2006).
  2. Wadsworth, J. D., Collinge, J. Update on human prion disease. Biochim Biophys Acta. 1772 (6), 598-609 (2007).
  3. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  4. Groveman, B. R., et al. Parallel in-register intermolecular beta-sheet architectures for prion-seeded prion protein (PrP) amyloids. J Biol Chem. 289 (35), 24129-24142 (2014).
  5. Vazquez-Fernandez, E., et al. The Structural Architecture of an Infectious Mammalian Prion Using Electron Cryomicroscopy. PLoS Pathog. 12 (9), e1005835 (2016).
  6. Wille, H., et al. Structural studies of the scrapie prion protein by electron crystallography. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3563-3568 (2002).
  7. Caughey, B. Prion protein conversions: insight into mechanisms, TSE transmission barriers and strains. Br Med Bull. 66, 109-120 (2003).
  8. Soto, C., Estrada, L., Castilla, J. Amyloids, prions and the inherent infectious nature of misfolded protein aggregates. Trends Biochem Sci. 31 (3), 150-155 (2006).
  9. Prusiner, S. B. Prions. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13363-13383 (1998).
  10. McKinley, M. P., Bolton, D. C., Prusiner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
  11. Benestad, S. L., Mitchell, G., Simmons, M., Ytrehus, B., Vikoren, T. First case of chronic wasting disease in Europe in a Norwegian free-ranging reindeer. Vet Res. 47 (1), 88 (2016).
  12. Williams, E. S., Young, S. Chronic wasting disease of captive mule deer: a spongiform encephalopathy. J Wildl Dis. 16 (1), 89-98 (1980).
  13. Gilch, S., et al. Chronic wasting disease. Top Curr Chem. 305, 51-77 (2011).
  14. Johnson, C. J., Pedersen, J. A., Chappell, R. J., McKenzie, D., Aiken, J. M. Oral transmissibility of prion disease is enhanced by binding to soil particles. PLoS Pathog. 3 (7), e93 (2007).
  15. Pritzkow, S., et al. Grass plants bind, retain, uptake, and transport infectious prions. Cell Rep. 11 (8), 1168-1175 (2015).
  16. Mathiason, C. K., et al. Infectious prions in the saliva and blood of deer with chronic wasting disease. Science. 314 (5796), 133-136 (2006).
  17. Tamguney, G., et al. Asymptomatic deer excrete infectious prions in faeces. Nature. 461 (7263), 529-532 (2009).
  18. Haley, N. J., Seelig, D. M., Zabel, M. D., Telling, G. C., Hoover, E. A. Detection of CWD prions in urine and saliva of deer by transgenic mouse bioassay. PLoS One. 4 (3), e4848 (2009).
  19. Spraker, T. R., et al. Validation of monoclonal antibody F99/97.6.1 for immunohistochemical staining of brain and tonsil in mule deer (Odocoileus hemionus) with chronic wasting disease. J Vet Diagn Invest. 14 (1), 3-7 (2002).
  20. Spraker, T., et al. Comparison of histological lesions and immunohistochemical staining of proteinase-resistant prion protein in a naturally occurring spongiform encephalopathy of free-ranging mule deer (Odocoileus hemionus) with those of chronic wasting disease of captive mule deer. Vet Pathol. 39 (1), 110-119 (2002).
  21. Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411 (6839), 810-813 (2001).
  22. Atarashi, R., et al. Simplified ultrasensitive prion detection by recombinant PrP conversion with shaking. Nature Methods. 5 (3), 211-212 (2008).
  23. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
  24. Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
  25. Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2), 175-178 (2011).
  26. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
  27. Cheng, Y. C., et al. Early and Non-Invasive Detection of Chronic Wasting Disease Prions in Elk Feces by Real-Time Quaking Induced Conversion. PLoS One. 11 (11), e0166187 (2016).
  28. Cramm, M., et al. Stability and Reproducibility Underscore Utility of RT-QuIC for Diagnosis of Creutzfeldt-Jakob Disease. Mol Neurobiol. 53 (3), 1896-1904 (2016).
  29. Orrú, C., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
  30. Orrú, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).
  31. Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2175-2178), (2011).
  32. Orrú, C. D., et al. A test for Creutzfeldt-Jakob disease using nasal brushings. N Engl J Med. 371 (19), 519-529 (2014).
  33. Orrú, C. D., et al. Rapid and sensitive RT-QuIC detection of human Creutzfeldt-Jakob disease using cerebrospinal fluid. MBio. 6 (1), (2015).
  34. Sano, K., et al. Early detection of abnormal prion protein in genetic human prion diseases now possible using real-time QUIC assay. PLoS One. 8 (1), e54915 (2013).
  35. Orrú, C., et al. Detection and discrimination of classical and atypical L-type bovine spongiform encephalopathy by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 53 (4), 1115-1120 (2015).
  36. Orrú, C. D., et al. Bank vole prion protein as an apparently universal substrate for RT-QuIC-based detection and discrimination of prion strains. PLoS Pathog. 11 (6), e1004983 (2015).
  37. Masujin, K., et al. Detection of Atypical H-Type Bovine Spongiform Encephalopathy and Discrimination of Bovine Prion Strains by Real-Time Quaking-Induced Conversion. J Clin Microbiol. 54 (3), 676-686 (2016).
  38. John, T. R., Schätzl, H. M., Gilch, S. Early detection of chronic wasting disease prions in urine of pre-symptomatic deer by real-time quaking-induced conversion assay. Prion. 7 (3), 253-258 (2013).
  39. Henderson, D. M., et al. Rapid antemortem detection of CWD prions in deer saliva. PLoS One. 8 (9), e74377 (2013).
  40. Elder, A., et al. In vitro detection of prionemia in TSE-infected cervids and hamsters. PLoS OnE. 8 (11), e80203 (2013).
  41. Haley, N. J., et al. Prion-seeding activity in cerebrospinal fluid of deer with chronic wasting disease. PLoS One. 8 (11), e81488 (2013).
  42. Haley, N., et al. Detection of chronic wasting disease in the lymph nodes of free-ranging cervids by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 52 (9), 3237-3243 (2014).
  43. Safar, J., et al. Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations. Nat Med. 4 (10), 1157-1165 (1998).
  44. Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
  45. Wille, H., et al. Surface charge of polyoxometalates modulates polymerization of the scrapie prion protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3740-3745 (2009).
  46. Lee, I. S., Long, J. R., Prusiner, S. B., Safar, J. G. Selective Precipitation of Prions by Polyoxometalate Complexes. J Am Chem Soc. 127 (40), 13802-13803 (2005).
  47. Levine, D. J., et al. Mechanism of scrapie prion precipitation with phosphotungstate anions. ACS Chem Biol. 10 (5), 1269-1277 (2015).
  48. Gonzalez-Montalban, N., et al. Highly efficient protein misfolding cyclic amplification. PLoS Pathog. 7 (2), e1001277 (2011).
  49. Moudjou, M., et al. Glycoform-independent prion conversion by highly efficient, cell-based, protein misfolding cyclic amplification. Sci Rep. 6, 29116 (2016).
  50. Moudjou, M., et al. Highly infectious prions generated by a single round of microplate-based protein misfolding cyclic amplification. MBios. 5 (1), (2013).
  51. Orru, C. D., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
  52. McGuire, L. I., et al. Real time quaking-induced conversion analysis of cerebrospinal fluid in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Ann Neurol. 72 (2), 278-285 (2012).
  53. Orru, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).

Tags

Immunologi problemet 127 prioner kronisk herjer sykdom RT-QuIC i vitro konvertering analysen diagnose gjenkjenning avføring
Sanntid skjelvende-indusert konvertering analysen for påvisning av CWD prioner i Fecal materiale
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, Y. C., Hannaoui, S., John, T. … More

Cheng, Y. C., Hannaoui, S., John, T. R., Dudas, S., Czub, S., Gilch, S. Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material. J. Vis. Exp. (127), e56373, doi:10.3791/56373 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter