Djupa proteomet profilering av isobariska märkning, omfattande vätskekromatografi, masspektrometri och programvara-assisted kvantifiering
Summary
Vi presenterar ett protokoll för att exakt kvantifiera proteiner med isobariska märkning, omfattande fraktionering, bioinformatiska verktyg och kvalitetskontroll steg i kombination med vätskekromatografi kopplats ihop till en högupplöst masspektrometer.
Abstract
Många enastående framsteg har gjorts i masspektrometri (MS)-baserad proteomik, med särskilda tekniska framsteg i vätskekromatografi (LC) kopplat till tandem masspektrometri (LC-MS/MS) och isobariska märkning multiplexering kapacitet. Här introducerar vi ett deep-proteomik profilering protokoll som kombinerar 10-plex tandem mass tagg (TMT) märkning med en omfattande LC/LC-MS/MS-plattform, och efter MS computational störningar korrigering att exakt kvantifiera hela proteom. Detta protokoll omfattar följande huvudsteg: protein utvinning och matsmältning, TMT märkning, 2-dimensionell (2D) LC, högupplösande masspektrometri och computational databehandling. Åtgärder för kvalitetskontroll ingår för felsökning och utvärdering av experimentell variation. Mer än 10.000 proteiner i däggdjur prover kan vara tryggt quantitated med detta protokoll. Detta protokoll kan också tillämpas på kvantitering av inlägget translationella modifieringar med smärre ändringar. Multiplexering, robust metoden ger ett kraftfullt verktyg för proteomiska analys i en mängd komplexa prover, inklusive cellkultur, djurvävnader och mänskliga kliniska prover.
Introduction
Framsteg i nästa generations sekvensering teknik har lett till ett nytt landskap för att studera biologiska system och mänskliga sjukdomar. Detta har möjliggjort ett stort antal mätningar av genomet, transkriptom, proteomet, bröstmjölkssammansättningen och andra molekylära system att bli påtagliga. Masspektrometri (MS) är en av de mest känsliga metoderna i analytisk kemi och dess tillämpning i proteomik expanderat snabbt efter kartläggningen av det mänskliga genomet. I fältet proteomik, har de senaste åren gett stora tekniska framsteg i MS-baserade kvantitativa analyser, inklusive isobariska märkning och multiplexing förmåga i kombination med omfattande vätskekromatografi, förutom instrumentering förskott, vilket möjliggör snabbare, exaktare mätningar med mindre provmaterial krävs. Kvantitativ proteomik har blivit en mainstream strategi för profilering tiotusentals proteiner och posttranslationalen ändringar i mycket komplexa biologiska prover1,2,3,4 , 5 , 6.
Multiplexade isobariska märkning metoder såsom isobariska tagg för relativ och absolut kvantifiering (dvs., iTRAQ) och tandem mass tagg (TMT) MS har kraftigt förbättrat provkapacitet och ökade antalet prover som kan analyseras i en enda experiment1,6,7,8. Tillsammans med andra MS-baserad kvantitering metoder, såsom etikett-fri kvantifiering och stabil isotop märkning med aminosyror i cellkultur (dvs.SILAC), potentialen hos dessa tekniker i proteomik är fältet betydande9 ,10,11. Till exempel tillåter metoden TMT 10 protein prov som ska analyseras tillsammans i 1 experiment genom att använda 10-plex reagenser. Dessa strukturellt identisk TMT-Taggar har samma totala massan, men tunga isotoper är differentially fördelade på kol eller kväve atomer, vilket resulterade i en unik reporter ion under MS/MS fragmentering av varje tagg, vilket möjliggör relativ kvantifiering mellan de 10 proverna. TMT strategin används rutinmässigt för att studera biologiska spridningsvägar, sjukdomsprogression och cellulära processer12,13,14.
Betydande tekniska förbättringar har förstärkt vätskekromatografi (LC)-MS/MS system, både vad gäller LC separationer och MS parametrar, att maximera protein identifiering utan att offra kvantitering noggrannhet. Första-dimension separation av peptider genom en separation teknik med hög ortogonalitet till den andra dimensionen är avgörande i denna typ av hagelgevär proteomik metod för att uppnå maximalt resultat20. Hög-pH omvänd fas vätskekromatografi (Byt) ger bättre prestanda än konventionella stark katjon-exchange kromatografi20. När hög-pH Byt kombineras med en andra dimension av låg-pH Byt, både analytiska dynamiskt omfång och protein täckning förbättras, vilket resulterar i förmåga att identifiera huvuddelen av uttryckta proteiner när du utför hela-proteomet analyser15 ,16,17,18. Andra tekniska framsteg inkluderar små C18 partiklar (1,9 µm) och extended lång kolumn (~ 1 m)19. Andra anmärkningsvärda förbättringar är dessutom nya versioner av masspektrometrar med snabb scan priser, förbättrad känslighet och upplösning20och sofistikerade bioinformatik rörledningar för MS data mining21.
Här beskriver vi ett detaljerade protokoll som omfattar de senaste metoderna med ändringar för att förbättra både känslighet och genomströmning, medan du fokuserar på mekanismer för kvalitetskontroll i hela experimentet. Protokollet innehåller protein utvinning och matsmältning, TMT 10-plex märkning, grundläggande pH och syra pH Byt fraktionering, högupplösta MS upptäckt och MS databehandling (figur 1). Dessutom genomför vi flera kvalitetskontroll steg för felsökning och utvärdering av experimentell variation. Detta detaljerade protokoll är avsedd att hjälpa forskare nya till fältet rutinmässigt identifiera och korrekt kvantifiera tusentals proteiner från en lysat eller vävnad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver ett hög genomströmning protokoll för kvantitering av proteiner med en 10-plex isobariska märkning strategi, som har genomförts framgångsrikt i flera publikationer12,13,14,32 . I detta protokoll, kan vi analysera upp till 10 olika biologiska protein prover i 1 experiment. Vi kan rutinmässigt identifiera och kvantifiera väl över 10 000 proteiner med högt förtroende. Även …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar alla andra lab och anläggning medlemmar för bra diskussion. Detta arbete var delvis stöds av NI H beviljar R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 och ALSAC. MS analysen utfördes i St. Jude Children’s Research Hospital proteomik Facility, delvis stöds av NIH Cancer Center Support grant P30CA021765. Författarna vill tacka Nisha Badders för hjälp med redigering manuskriptet.
Materials
| 1220 LC system | Agilent | G4288B | |
| 50% Hydroxylamine | Thermo Scientific | 90115 | |
| Acetonitrile | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BB24-AU | |
| Butterfly Portfolio Heater | Phoenix S&T | PST-BPH-20 | |
| C18 tips | Harvard Apparatus | 74-4607 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 | |
| DMSO | Sigma | 41648 | |
| Formic acid | Sigma | 94318 | |
| Fraction Collector | Gilson | FC203B | |
| Glass Beads | Next Advance | GB05 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I6125 | |
| Lys-C | Wako | 125-05061 | |
| Methanol | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive HF | |
| nanoflow UPLC | Thermo Scientific | Ultimate 3000 | |
| ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um | Dr. Maisch GmbH | r119.aq.0003 | |
| Self Pck Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Speedva | Thermo Scientific | SPD11V | |
| TMT 10plex Isobaric label reagent | Thermo Scientific | 90110 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Applied Biosystems | 400003 | |
| Trypsin | Promega | V511C | |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Xbridge Column C18 column | Waters | 186003943 | |
| Ziptips C18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| SepPak 1cc 50mg | Waters | WAT054960 |
References
- Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
- Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).
- Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Bai, B., et al. Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling. Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run. Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Bai, B., et al. Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer’s disease. J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. Recent advances of proteomics applied to human diseases. J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).
- Churchman, M. L., et al. Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).
- Wang, X., et al. Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk. Nat Commun. 7, 10464 (2016).
- Mertz, J. L., et al. Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth. Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Wang, H., et al. An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Song, C., et al. Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides. Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).
- Wang, H., et al. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).
- Hebert, A. S., et al. The one hour yeast proteome. Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).
- Wang, X., et al. JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).
- Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
- Niu, M., et al. Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry. Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
- Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
- Wenger, C. D., et al. Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging. Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).
- McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes. Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
- Zhou, F., et al. Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry. Nat Commun. 4, 2171 (2013).
- Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
- Ahrne, E., et al. Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments. J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).
- Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
- Tan, H., et al. Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation. Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).
- Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells. Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).
- Tan, H., et al. Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome. Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).
- Li, Y., et al. JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells. J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).
- Yuan, Y., et al. Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types. Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).
- Nesvizhskii, A. I. Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies. Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).
- Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).
