本研究的目的是评估 体外 降脂药物对胆固醇颗粒形态的调节作用。不同降脂药物在调节胆固醇颗粒形态特征方面的效果存在差异。
本文内容
摘要
摘要
对血脂异常患者使用降脂药物可显著降低低密度脂蛋白（LDL）水平，并使血浆高密度脂蛋白（HDL）胆固醇水平出现轻度至中度升高。然而，这些药物在改变胆固醇颗粒形态和分布方面可能发挥的作用尚不明确。本文描述了 体外 使用斑块阵列法结合成像流式细胞术评估降脂药物对胆固醇颗粒形态特征的调节作用。对胆固醇颗粒的图像分析表明，洛伐他汀、辛伐他汀、依折麦布和阿托伐他汀可诱导球形及线状结构颗粒的形成，而烟酸、贝特类药物、氟伐他汀和瑞舒伐他汀仅诱导球形颗粒的形成。随后，将纯化的极低密度脂蛋白（VLDL）和低密度脂蛋白（LDL）颗粒与这些药物共同孵育，结果显示胆固醇颗粒亚群的形态和图像纹理发生改变。此外，对50份血清样本的筛查发现，血脂异常个体中线状高密度脂蛋白（HDL）胆固醇颗粒水平较高（平均为18.3%），高于年龄匹配的正常对照组（平均为11.1%）。我们还观察到不同降脂药物在减少血清样本中线状LDL和HDL胆固醇颗粒形成方面存在显著差异。这些结果表明，降脂药物除了通过细胞介导的降脂作用外，还可能通过非酶促机制直接调节胆固醇颗粒的形态。该研究结果有望为动脉粥样硬化的诊断以及优化降脂治疗方案提供依据。
引言
大量临床研究已证实，降脂药物在降低低密度脂蛋白（LDL）胆固醇血浆水平方面具有有益作用，同时可轻度至中度升高高密度脂蛋白（HDL）胆固醇水平，从而预防动脉粥样硬化相关的心血管不良事件的初发和再发1,2,3,4,5。他汀类药物是一类HMG-CoA还原酶抑制剂，通过抑制肝脏内源性胆固醇的合成，继而降低血液中循环的LDL胆固醇水平6,7。同样，烟酸的降脂作用是通过直接且非竞争性地抑制肝细胞中的二酰基甘油酰基转移酶-2（diacylglycerol acyltransferase-2）实现的，该酶是甘油三酯合成过程中的关键肝脏酶8。相比之下，依折麦布通过与小肠上皮细胞中的Niemann-Pick C1样1（NPC1L1）蛋白结合，限制外源性胆固醇的吸收，从而降低LDL的血浆水平9。非诺贝特是另一种降脂药物，主要通过过氧化物酶体增殖物激活受体通路显著降低血浆甘油三酯浓度，并中度降低LDL胆固醇水平10。此外，有报道称ω-3脂肪酸因其能够降低LDL胆固醇的血浆水平而具有抗动脉粥样硬化作用11。
降脂药物除了降低低密度脂蛋白胆固醇的主要作用外，还具有多种有益的多效性作用，包括提高高密度脂蛋白水平、改善内皮功能、减轻炎症反应以及抑制血小板聚集。12,13,14然而，这些药物在增加高密度脂蛋白（HDL）胆固醇颗粒并修饰其结构特征方面的潜在机制尚未完全阐明。由于这些药物被广泛用于治疗动脉粥样硬化相关的心血管疾病（CVDs），进一步研究其在决定脂质颗粒形态特征和分布方面可能发挥的作用显得尤为重要。人类血浆脂质组包含约600种不同的脂质以及22种不同分子类型的胆固醇，这些成分存在于多种大小、形状、密度和组成的脂质颗粒中。15,16,17分析方法（如超速离心、核磁共振和梯度凝胶电泳）用于表征低密度脂蛋白和高密度脂蛋白颗粒及其亚组分18,19然而，这些方法的应用仅限于旨在确定药物对脂质颗粒形态和组装调控作用的研究。基于流式细胞仪的斑块阵列是一种功能性的生化检测方法，用于检测和可视化血清来源的脂质及淀粉样斑块颗粒。20. 该方法的优点包括 体外 本研究中描述的成像方法能够识别脂质调节药物对缓冲液和血清样本中胆固醇颗粒形态及分布的影响。
方案
1. 荧光标记胆固醇及降脂药物的制备
注意：荧光标记的胆固醇聚集体和他汀类药物的制备方法详见我们之前发表的文章21。有关本研究中使用的试剂、成像流式细胞仪、化学分析仪和数据分析软件的详细信息，请参见材料表。
- 将荧光标记的冻干胆固醇（1 mg，激发/发射波长 = 495 nm/507 nm）粉末溶于 1 mL 100% 酒精中。
- 将样品在 2,040 × g 条件下离心 3 分钟，取上清液用于斑块阵列实验，其中含有可溶性荧光标记胆固醇聚集体。
- 药物配制时，分别将辛伐他汀、洛伐他汀、阿托伐他汀、依折麦布和 omega-3 脂肪酸的粉末（各 2 mg）溶于 1 mL 100% 酒精中。
- 在 2,040 × g 条件下离心 3 分钟后，取含药物的上清液用于实验。
- 同样，分别将氟伐他汀、瑞舒伐他汀、烟酸和贝特类药物的粉末（各 2 mg）溶于 1 mL 去离子水中，配制成 2 mg/mL 的储备液。
- 在 2,040 × g 条件下离心 3 分钟后，取含药物的上清液用于斑块阵列实验。
2. 用于检测的斑块阵列实验 体外 胆固醇颗粒的形成
- 使用化学分析仪-1（见材料表）建立胆固醇颗粒形成的斑块阵列检测。在圆底、低蛋白结合的96孔板中进行检测，使用第1节中配制的试剂。每孔最终反应体积保持在200 µL，并且所有检测均设三个重复。
- 首先，向每孔加入194.5 µL磷酸盐缓冲液（PBS）。
- 向每孔加入2.5 µL（5 µg）每种降脂药物溶液，并将板置于化学分析仪-1反应板上振荡30秒，使药物充分混匀。阴性对照样品中不添加药物。
- 最后，向每孔加入2 µL（2 µg）荧光标记的胆固醇聚集体溶液，并将板置于化学分析仪-1反应板上振荡30秒。
- 将板置于摇床中，在37 °C、200 rpm条件下孵育2小时。
- 孵育结束后，通过成像流式细胞术获取颗粒图像。
3. 使用成像流式细胞术捕获胆固醇颗粒的图像
- 打开数据采集模板以加载正确的仪器设置。点击“File”，然后选择“Open Template…”，并选择模板文件。
- 点击“Flush, Lock, Load”以准备仪器进行样本加载。
- 当“Load Sample”对话框打开时，点击“OK”以从第2节中准备的每个孔中加载50 µL样本至成像流式细胞仪。
- 点击“Run|Setup”以实时查看成像区域中的颗粒。
- 当成像区域中的颗粒处于良好聚焦状态时，点击“Run|Acquire”以高通量方式同时获取每个对象的暗场（侧向散射/SSC）、明场（BF）、绿色荧光和黄色荧光图像。
- 重复步骤3.2–3.5，从每个样本中获取5,000–10,000个颗粒。
- 使用图像分析软件分析所有原始图像文件，以确定对象的荧光强度和形态学变化。
- 在图像分析软件顶部点击“Tools”按钮，然后从下拉菜单中选择“Batch Data Files”，这将打开“Batches”窗口。
- 在“Batches”窗口中，点击“Add Batch”按钮，这将打开“Define a Batch”窗口。
- 在“Define a Batch”窗口中，点击“Add Files”按钮并选择原始图像文件，点击“Template”按钮并选择适当的数据分析模板文件，然后选择“OK”和“Submit Batches”以开始对原始图像文件进行处理和分析。
4. 基于斑块阵列检测法评估降脂药物对纯化胆固醇颗粒的作用
- 如步骤 2.1 所述，使用纯化的 VLDL、LDL 和 HDL 脂蛋白/颗粒进行胆固醇颗粒形成实验。在 96 孔板中进行斑块阵列实验。
- 首先，向所有孔中加入 PBS；每孔终体积为 200 µL。
- 作为阴性对照，分别向各孔中加入 4 µg 的 VLDL、LDL 或 HDL 蛋白/颗粒，不加药物，并将板在振荡器上震荡 30 秒。
- 为检测降脂药物的作用，分别向各孔中加入 4 µg 的 VLDL、LDL 或 HDL 蛋白/颗粒，并将板在振荡器上震荡 30 秒。
- 对于已加入 4 µg VLDL、LDL 或 HDL 的孔，加入 2.5 µL（5 µg）的依折麦布、洛伐他汀、辛伐他汀或烟酸溶液，并将板置于化学分析仪-1 上震荡 30 秒。
- 最后，向所有孔中加入 2 µL（2 µg）荧光标记的胆固醇聚集体溶液，并将板置于化学分析仪-1 反应板上震荡 30 秒。
- 将板置于设定为 37 °C 和 200 rpm 的实验室摇床中孵育 2 小时。
- 按照步骤 3.1 至 3.5 使用成像流式细胞术采集样本。
- 按照步骤 3.7 所述，使用图像分析软件分析原始图像文件。
- 在分析模板中，使用以下设门策略来鉴定胆固醇颗粒亚群。
- 在绿色通道饱和像素数（x 轴）与暗场通道饱和像素数（y 轴）的图中，排除在任一通道中具有一个或多个饱和像素的对象。
- 使用绿色通道强度（x 轴）与 SSC 强度（y 轴）绘制无饱和像素的对象/颗粒：根据其绿色通道和 SSC 强度，对象落入三个区域之一（VLDL、LDL、HDL）。
注：这些设门基于使用纯化的 VLDL、LDL 和 HDL 颗粒/蛋白在无药物条件下进行的对照实验所生成的数据。
- 为确定每份样本中降脂药物的作用，计算总脂蛋白颗粒浓度以及各亚群（VLDL、LDL、HDL）所占百分比，方法如步骤 6.5 所述。
- 使用以下公式计算颗粒浓度（颗粒/mL）：
![颗粒浓度公式，[颗粒] = 颗粒数/(样本流速×采集时间)。](/files/ftp_upload/56596/56596eq1.jpg "figure-protocol-1")
注：荧光散点图中的 VLDL、LDL 和 HDL 设门区域可检测到各自亚群约 80% 的颗粒，其余约 20% 的颗粒与其他设门区域存在重叠。
- 使用以下公式计算颗粒浓度（颗粒/mL）：
5. 血清样本中脂质浓度的测定
- 使用年龄匹配的正常个体和血脂异常个体的血清样本，通过化学分析仪-2测定低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、胆固醇和甘油三酯的浓度。
- 根据血清样本中低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、胆固醇和甘油三酯的浓度超出其上下参考值范围的情况，定义其浓度异常。
- 遵循试剂制造商推荐的正常参考值：胆固醇（4 - 200 mg/dL）、高密度脂蛋白（HDL）（3.0 - 65 mg/dL）、低密度脂蛋白（LDL）（4 - 100 mg/dL）和甘油三酯（9 - 200 mg/dL）。
- 将胆固醇和甘油三酯浓度低于下限参考值或高于上限参考值的血清样本识别为异常样本，并用于在有或无降脂药物存在条件下的筛选。
6. 分析药物对血清样本中胆固醇颗粒形成的影响
- 使用化学分析仪-1 建立血清样本中胆固醇颗粒形成的斑块阵列检测。在圆底、低蛋白结合的 96 孔板中进行该检测。每孔最终反应体积为 200 µL，所有检测均设三个重复。
- 逐步加入试剂以准备酶标板。
- 准备对照孔。
- 向每孔加入 193 µL PBS。
- 加入 2.5%（v/v）患者血清（每孔仅加一个血清样本），并将酶标板置于化学分析仪反应板上振荡 30 秒。
- 向每孔加入 2 µL（2 µg）荧光标记的胆固醇聚集体溶液，并将酶标板置于化学分析仪-1 反应板上振荡 30 秒。
- 准备含药物的孔。
- 向每孔加入 191 µL PBS。
- 加入 2.5%（v/v）患者血清（每孔仅加一个血清样本），并将酶标板置于化学分析仪-1 反应板上振荡 30 秒。
- 向除阴性对照孔外的所有孔中加入 2 µL 依折麦布、洛伐他汀、辛伐他汀或烟酸溶液（4 µg）。每孔仅加一种药物，并将酶标板置于化学分析仪-1 反应板上振荡 30 秒。
- 向每孔加入 2 µL 荧光标记的胆固醇聚集体溶液（2 µg），并将酶标板置于化学分析仪-1 反应板上振荡 30 秒。
- 仅在所有孔（对照和药物处理组）均已加入相应血清样本后，再加入药物，并在此步骤最后加入荧光标记的胆固醇。
- 将酶标板置于设定为 37 °C 和 200 rpm 的实验室摇床中孵育 2 小时。
- 按照步骤 3.1 - 3.6 中所述设置，使用成像流式细胞仪采集样本数据。
- 使用图像分析软件，采用与步骤 3.7 中所述相同的模板对所有图像文件进行批量处理。
- 按照步骤 4.5 和 4.6 中所述方法，在图上绘制门控区域进行数据分析。
- 为确定每个样本的降脂药物效应/反应（低、中、高），需计算总脂蛋白颗粒浓度，以及 VLDL、LDL 和 HDL 亚群占总颗粒的百分比。
- 将 VLDL、LDL 和 HDL 群体绘制在物体明场图像的直方图上，以长度减去宽度（length - width）为参数，并划分为球形或线性区域：(length - width) ≤2 µm 的物体归入球形区域，用于计算球形和线性颗粒的百分比。
- 比较每种血清样本在有无每种药物孵育条件下所识别出的球形和线性 LDL 与 HDL 胆固醇颗粒的百分比。对于每个血清样本获得的三个重复值，采用落在均值 ±2 SD 范围内的球形和线性 LDL 与 HDL 颗粒百分比来确定药物效应。
结果
基于斑块阵列分析法研究降脂药物对胆固醇颗粒形成的影响：
为评估他汀类药物对胆固醇颗粒形态的调节作用，将荧光标记的胆固醇聚集体分别与洛伐他汀（lovastatin）、辛伐他汀（simvastatin）、阿托伐他汀（atorvastatin）、瑞舒伐他汀（rosuvastatin）和氟伐他汀（fluvastatin）在缓冲液中单独孵育。所有样本均采用成像流式细胞术获取图像，以进行胆固醇颗粒的形态学分析，如图1和图2所示。有趣的是，分析药物在缓冲液中对胆固醇颗粒形成的影响发现，洛伐他汀、辛伐他汀和阿托伐他汀可诱导形成一群形态异质的胆固醇颗粒，表现出多样化的尺寸和形状，如图3a-c所示。相反，在瑞舒伐他汀、氟伐他汀以及阴性对照（无药物）条件下形成的胆固醇颗粒在形状和形态上均较为均一，如图3d-f所示。此外，观察到洛伐他汀、辛伐他汀和阿托伐他汀可诱导形成具有球状和线状结构的胆固醇颗粒，而瑞舒伐他汀和氟伐他汀仅诱导形成具有球状形态的胆固醇颗粒。他汀类药物诱导线状结构形成的作用比例分别为：洛伐他汀16%，辛伐他汀2%，阿托伐他汀0.2%。
为了进一步评估降脂药物对颗粒形成的影响，将荧光标记的胆固醇聚集体分别与依折麦布、贝特类药物、烟酸和ω-3脂肪酸单独孵育。与他汀类药物类似，这些药物均诱导形成了大小和形状各异的胆固醇颗粒，如图4a-d所示。其中，依折麦布诱导形成的胆固醇颗粒呈现球状和线状纤维结构，而贝特类药物、烟酸和ω-3脂肪酸仅诱导形成球状胆固醇颗粒。因此，这些药物对线状纤维结构胆固醇颗粒形成的影响依次为：依折麦布3%，贝特类药物0%，烟酸0%，ω-3脂肪酸0%。
形态学分析显示，每个球状或线状的胆固醇颗粒均由多个较小的颗粒连接而成。所鉴定的荧光阳性球状胆固醇颗粒的大小范围约为 ~2 - 30 µm2，而线状颗粒的大小范围约为 ~2 - 60 µm2。
分析降脂药物对纯化VLDL和LDL颗粒的影响：
为了进一步研究在载脂蛋白存在下胆固醇颗粒的形成，将荧光标记的胆固醇聚集体分别与纯化的VLDL、LDL和HDL蛋白/颗粒共同孵育。结果显示，与LDL和HDL颗粒孵育相比，与VLDL蛋白孵育的胆固醇聚集体产生了更多的胆固醇颗粒，图5。此外，在VLDL群体中观察到两个主要的胆固醇颗粒组分，提示在与荧光标记的胆固醇聚集体孵育过程中，部分胆固醇聚集体转化为LDL组分。颗粒的图像分析表明，在VLDL、LDL和HDL群体中均存在球状（约97%）和线状（约3%）颗粒。球状颗粒的大小范围约为2 - 30 µm2，而线状颗粒的大小范围约为2 - 60 µm2。
为研究降脂药物对纯化颗粒的作用，将VLDL和LDL颗粒分别与依折麦布、洛伐他汀、辛伐他汀和烟酸共同孵育。结果显示，与未加药物的对照实验相比，依折麦布、辛伐他汀、洛伐他汀和烟酸对VLDL颗粒形成的影响更为显著。经药物孵育后的LDL颗粒呈现主要的单一组分，且依折麦布、辛伐他汀、洛伐他汀和烟酸对颗粒形成的影响也更为明显，图6。
降脂药物对血清样本中胆固醇颗粒分布影响的差异：
先前的实验在含有纯化脂蛋白的缓冲溶液中进行，以评估药物效果。因此，在下一步中，使用从25名血脂异常患者和25名年龄匹配的健康对照者采集的50份血清样本，检测了降脂药物对胆固醇颗粒形成的有效性。每份血清样本的药物反应通过在有药和无药条件下胆固醇颗粒形成谱的变化来评估。在斑块阵列实验中，每份血清样本分别与依折麦布、洛伐他汀、辛伐他汀和烟酸进行检测。结果显示，这些药物在调节血清样本中VLDL、LDL和HDL颗粒分布方面存在差异，尤其体现在降低LDL和增加HDL胆固醇颗粒形成的作用上。三种表现出对降脂药物独特反应的血脂异常血清样本代表性结果如图7所示。
药物对血清来源的低密度脂蛋白和高密度脂蛋白胆固醇颗粒形态调控作用的鉴定：
血清来源胆固醇颗粒的表型分析显示，存在线性链状以及球状的VLDL、LDL和HDL亚群，从而证实了在缓冲液中以及使用纯化脂蛋白颗粒进行的实验中所观察到的相似形态，如图8所示。然而，在血脂异常患者与年龄匹配的正常受试者之间，球状和线性链状胆固醇颗粒亚群的分布存在广泛差异。值得注意的是，未使用药物的对照实验显示，血脂异常组（平均2.0%）与年龄匹配的正常组（平均1.3%）血清样本中线性链状LDL胆固醇颗粒的分布存在差异。类似地，与年龄匹配组（平均11.1%）相比，血脂异常样本中线性链状HDL胆固醇颗粒水平升高（平均18.3%）。相应地，在血脂异常血清样本中加入药物的实验显示，辛伐他汀（平均8.3%）、依折麦布（平均11.5%）和洛伐他汀（平均11.7%）可显著减少线性链状HDL胆固醇颗粒的形成，而烟酸则无减少作用（平均18.3%）。此外，当血脂异常血清样本与表1中列出的药物共同孵育时，线性链状LDL胆固醇颗粒的形成也有所减少。
此外，在年龄匹配的对照血清样本中加入药物进行检测后显示，辛伐他汀（平均降低5.0%）、依折麦布（平均降低8.2%）、洛伐他汀（平均降低8.7%）和烟酸（平均降低10.8%）均显著减少了线状高密度脂蛋白胆固醇颗粒，如图所示 表2两种血脂异常和年龄匹配的正常血清样本在药物诱导下均表现出线性LDL和HDL胆固醇颗粒减少，同时球形胆固醇颗粒相对增加（数据未显示）。
图1：展示该过程的示意图 体外 胆固醇颗粒形态的观察 (a, b缓冲液或血清样本中添加降脂药物。c) 向样品中加入荧光标记的可溶性胆固醇聚集体。d) 使用成像流式细胞术获取所得样品，用于不溶性胆固醇颗粒的形态学分析。比例尺 = 10 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 2：利用成像流式细胞术鉴定胆固醇颗粒的两种不同形态。（a）根据明场图像的纹理分析，将颗粒分为线性或球状群体。具体而言，均一性均值H（x轴）与熵均值H（y轴）的散点图中包含两个设门区域，用于识别球状（红色）和线状（蓝色）胆固醇颗粒。（b）在群体1中鉴定出的球状颗粒的形态图像。（c）在群体2中鉴定出的线状颗粒的形态图像。（d）显示所有荧光阳性胆固醇颗粒分布的直方图，用于确定其浓度及亚群。比例尺 = 10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：图像图集展示他汀类药物对胆固醇颗粒形成调控作用的效果。 明场对应于传统流式细胞仪中的FSC区域。绿色通道表示在505 - 560 nm范围内检测到的荧光发射，黄色通道表示在560 - 595 nm范围内检测到的荧光发射。(a-e) 图像图集分别展示在洛伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和氟伐他汀存在下形成的胆固醇颗粒的形态。(f) 无他汀类药物时胆固醇颗粒的形成（阴性对照）。比例尺 = 10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：展示降脂药物在调节胆固醇颗粒形成中的差异性作用。（a-d）图像集，分别显示在依折麦布、烟酸、贝特类药物和ω-3脂肪酸存在下形成的胆固醇颗粒的形态。绿色通道指在505 - 560 nm范围内检测到的荧光发射，黄色通道指在560 - 595 nm范围内检测到的荧光发射。比例尺 = 10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：在无药物条件下VLDL、LDL和HDL胆固醇颗粒形成的分析。 散点图：X轴显示在绿色荧光通道（505 - 560 nm）中检测到的胆固醇颗粒谱，Y轴显示侧向散射信号。门控显示在荧光散点图中检测到的VLDL、LDL和HDL颗粒区域。（a）在纯化VLDL存在下胆固醇颗粒的形成。（b）VLDL颗粒的代表性图像。（c）在纯化LDL存在下胆固醇颗粒的形成。（d）LDL颗粒的代表性图像。（e）在纯化HDL存在下胆固醇颗粒的形成。（f）HDL颗粒的代表性图像。比例尺 = 10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：展示降脂药物对纯化的VLDL和LDL胆固醇颗粒的作用效果。（a）未加药物的VLDL颗粒。（b）与依折麦布共同孵育的VLDL颗粒。（c）与洛伐他汀共同孵育的VLDL颗粒。（d）与辛伐他汀共同孵育的VLDL颗粒。（e）与烟酸共同孵育的VLDL颗粒。（f）未加药物的LDL颗粒。（g）与依折麦布共同孵育的LDL颗粒。（h）与洛伐他汀共同孵育的LDL颗粒。（i）与辛伐他汀共同孵育的LDL颗粒。（j）与烟酸共同孵育的LDL颗粒。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：荧光点图显示降脂药物对血清样本中VLDL、LDL和HDL胆固醇颗粒形成的不同调节作用。 上排为血清1的筛查结果，显示药物反应水平较低，HDL颗粒形成增加0至15%；中排为血清2的筛查结果，显示药物反应水平中等，HDL颗粒形成增加16至50%；下排为血清3的筛查结果，显示药物反应水平较高，HDL颗粒形成增加51至100%。(a, f, k) 未加药物的血清样本。(b, g, l) 与依折麦布共同孵育的血清样本。(c, h, m) 与洛伐他汀共同孵育的血清样本。(d, i, n) 与辛伐他汀共同孵育的血清样本。(e, j, o) 与烟酸共同孵育的血清样本。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 8：显示血清样本 1 中鉴定出的胆固醇颗粒形态的图像图集。 绿色通道显示颗粒荧光发射的图像；侧向散射（青色通道）显示颗粒对激发激光的散射光图像。（a）未添加药物时形成的球状和线状胆固醇颗粒。（b, c, d, e）分别在依折麦布、洛伐他汀、辛伐他汀和烟酸存在下形成的胆固醇颗粒。比例尺 = 10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 血清编号 | 无药物（对照） | 含依折麦布 | 含洛伐他汀 | 含辛伐他汀 | 含烟酸 | |||||
| % 线性，LDL 颗粒 | % 线性，HDL 颗粒 | % 线性，LDL 颗粒 | % 线性，HDL 颗粒 | % 线性，LDL 颗粒 | % 线性，HDL 颗粒 | % 线性，LDL 颗粒 | % 线性，HDL 颗粒 | % 线性，LDL 颗粒 | % 线性，HDL 颗粒 | |
| PNDS-01 | 1.73 | 45.2 | 0.81 | 18.1 | 0.61 | 16.1 | 0.59 | 13.9 | 2.26 | 33.6 |
| PNDS-02 | 2.86 | 35.9 | 1.26 | 30.9 | 1.27 | 22.7 | 0.73 | 15.2 | 3.03 | 37.7 |
| PNDS-03 | 2.04 | 35.8 | 0.87 | 4.82 | 1.02 | 4.14 | 0.36 | 3.06 | 0.45 | 9.57 |
| PNDS-04 | 2.56 | 32.9 | 1.15 | 21.8 | 1.12 | 18.6 | 0.77 | 17.2 | 3.37 | 36.5 |
| PNDS-05 | 0.42 | 29.2 | 0.24 | 5.62 | 0.22 | 8.72 | 0.16 | 9.91 | 0.35 | 22.2 |
| PNDS-06 | 1.8 | 28.1 | 0.4 | 16.8 | 0.62 | 15 | 0.42 | 9.27 | 2.28 | 38.4 |
| PNDS-07 | 1.8 | 26.5 | 0.85 | 10.5 | 1.18 | 19.9 | 0.62 | 7.32 | 1.29 | 23.4 |
| PNDS-08 | 0.98 | 22.8 | 0.86 | 7.28 | 1.55 | 10.2 | 0.14 | 5.98 | 0.59 | 13.3 |
| PNDS-09 | 3.87 | 22.1 | 1.98 | 9.56 | 1.87 | 10.3 | 1.46 | 7.96 | 2.86 | 9.88 |
| PNDS-10 | 4.46 | 21.9 | 2.57 | 13.6 | 4.04 | 17.1 | 2.28 | 11.9 | 0.71 | 25.7 |
| PNDS-11 | 1.57 | 19.2 | 1.15 | 9.24 | 1.37 | 6.98 | 0.74 | 5.03 | 1.37 | 16 |
| PNDS-12 | 1.06 | 16.7 | 0.66 | 4.38 | 0.7 | 4.74 | 0.99 | 6.36 | 1.14 | 4.73 |
| PNDS-13 | 4.85 | 16.6 | 1.28 | 30.4 | 1.4 | 32.6 | 0.8 | 16.6 | 4.02 | 31 |
| PNDS-14 | 2.08 | 16 | 0.68 | 15.4 | 0.64 | 16.5 | 1.97 | 10.2 | 1.25 | 20.11 |
| PNDS-15 | 1.5 | 11.9 | 1.14 | 13.3 | 1.21 | 11.4 | 0.8 | 6.12 | 1.38 | 4.59 |
| PNDS-16 | 1.82 | 10.4 | 2.04 | 9.59 | 1.24 | 5.62 | 0.91 | 5.38 | 1.31 | 7.61 |
| PNDS-17 | 1.05 | 10.3 | 1.02 | 4.7 | 1.78 | 15.1 | 0.93 | 7.81 | 1.27 | 13 |
| PNDS-18 | 1.11 | 8.76 | 0.54 | 3.68 | 0.61 | 3.51 | 1.01 | 5.03 | 1.02 | 6.69 |
| PNDS-19 | 1 | 8.52 | 0.75 | 6.67 | 0.76 | 5.86 | 0.91 | 8.36 | 1.22 | 11.9 |
| PNDS-20 | 3.54 | 7.92 | 3.78 | 12 | 3.56 | 5.81 | 3.28 | 8.28 | 3.44 | 12.3 |
| PNDS-21 | 1.88 | 7.69 | 2.12 | 11.4 | 1.73 | 9.54 | 1.77 | 8.34 | 2.32 | 16.7 |
| PNDS-22 | 1.64 | 7.17 | 0.35 | 5.75 | 0.56 | 13.2 | 0.14 | 4.33 | 1.23 | 17.8 |
| PNDS-23 | 1.54 | 6.27 | 1.25 | 7.24 | 1.02 | 6.12 | 0.73 | 3.58 | 1.42 | 6.69 |
| PNDS-24 | 0.53 | 6.22 | 0.52 | 4.49 | 0.91 | 5.57 | 0.54 | 4.01 | 0.65 | 10.5 |
| PNDS-25 | 2.97 | 5.1 | 1.59 | 11 | 1.88 | 9 | 1.03 | 6.54 | 2.61 | 29.1 |
表1：在斑块阵列实验中对血脂异常血清样本的筛选显示了降脂药物的不同作用效果。 与未加药物的对照组（第2、3列）相比，加入依折麦布（第4、5列）、洛伐他汀（第6、7列）、辛伐他汀（第8、9列）和烟酸（第10、11列）孵育的血清样本在诱导线性形态的低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）胆固醇颗粒形成方面表现出差异。
| 血清编号 | 无药物 | 含依折麦布 | 含洛伐他汀 | 含辛伐他汀 | 含烟酸 | |||||
| % 线性，LDL 颗粒 | % 线性，HDL 颗粒 | % 线性，LDL 颗粒 | % 线性，HDL 颗粒 | % 线性，LDL 颗粒 | % 线性，HDL 颗粒 | % 线性，LDL 颗粒 | % 线性，HDL 颗粒 | % 线性，LDL 颗粒 | % 线性，HDL 颗粒 | |
| PNAN-01 | 2.05 | 26.8 | 0.62 | 11.9 | 0.56 | 16.9 | 0.52 | 9.28 | 1.4 | 11.9 |
| PNAN-02 | 1.35 | 26.3 | 1.68 | 21.8 | 2.59 | 23.6 | 0.79 | 6.92 | 2.16 | 29.7 |
| PNAN-03 | 2.4 | 24.9 | 0.53 | 7.54 | 0.57 | 13.8 | 0.55 | 5.82 | 1.7 | 4.71 |
| PNAN-04 | 1.99 | 21.5 | 1.54 | 9.45 | 1.56 | 8.25 | 0.31 | 3.74 | 2.88 | 20.8 |
| PNAN-05 | 1.77 | 18.8 | 1.49 | 6.03 | 1.65 | 5.5 | 0.54 | 4.67 | 1.2 | 8.19 |
| PNAN-06 | 1.12 | 15.2 | 0.67 | 4.42 | 2.68 | 13.3 | 0.5 | 2.37 | 1.54 | 16.3 |
| PNAN-07 | 1.03 | 14.4 | 0.79 | 6.83 | 1.45 | 7.91 | 0.67 | 5.36 | 1.57 | 12 |
| PNAN-08 | 0.98 | 14.3 | 0.88 | 4.48 | 2 | 7.1 | 0.19 | 2.66 | 1.02 | 18.1 |
| PNAN-09 | 2.85 | 14.1 | 1.95 | 12.6 | 2.34 | 12.5 | 0.7 | 6.24 | 1.84 | 18.7 |
| PNAN10 | 1.01 | 10.4 | 0.8 | 5.07 | 0.51 | 5.9 | 0.87 | 6.5 | 1.63 | 10.9 |
| PNAN-11 | 0.92 | 12.4 | 0.21 | 9.94 | 0.29 | 3.31 | 0.29 | 6.52 | 0.58 | 10.4 |
| PNAN-12 | 0.6 | 10.5 | 0.56 | 5.78 | 1.06 | 4.74 | 0.4 | 3.32 | 0.91 | 11.8 |
| PNAN-13 | 1.25 | 10.3 | 0.45 | 3.79 | 0.67 | 6.53 | 0.27 | 3.17 | 0.8 | 6.28 |
| PNAN-14 | 1.03 | 9.86 | 1.12 | 8.51 | 1.05 | 6.91 | 0.6 | 5.94 | 1.05 | 8.14 |
| PNAN-15 | 2.28 | 8.1 | 1.93 | 10.4 | 2.14 | 8.86 | 1.56 | 6.84 | 2.31 | 8.61 |
| PNAN-16 | 1.98 | 7.69 | 0.45 | 4.36 | 1 | 5.46 | 0.27 | 2.89 | 0.49 | 4.12 |
| PNAN-17 | 1.72 | 6.72 | 0.75 | 14.8 | 0.74 | 9.26 | 0.49 | 5.58 | 1.98 | 12.8 |
| PNAN-18 | 2.45 | 6.38 | 0.85 | 16.8 | 0.89 | 14.2 | 0.58 | 5.9 | 1.8 | 20.6 |
| PNAN-19 | 1.67 | 5.12 | 0.58 | 8.63 | 0.65 | 5.7 | 0.64 | 8.8 | 1.88 | 2.08 |
| PNAN-20 | 1.17 | 4.41 | 0.85 | 7.77 | 0.91 | 6.43 | 0.69 | 5.08 | 1.21 | 6.12 |
| PNAN-21 | 0.31 | 4.18 | 0.48 | 6.95 | 0.19 | 5.09 | 0.15 | 2.1 | 0.29 | 5.93 |
| PNAN-22 | 0.77 | 4.02 | 1.24 | 7.41 | 0.61 | 5.02 | 0.29 | 3.49 | 0.42 | 3.98 |
| PNAN-23 | 0.4 | 1.25 | 0.75 | 6.25 | 0.88 | 5.91 | 0.9 | 5.06 | 0.82 | 6.71 |
| PNAN-24 | 0.45 | 1.1 | 0.63 | 2.5 | 0.55 | 5.32 | 0.9 | 4.3 | 0.71 | 3.5 |
| PNAN-25 | 0.36 | 1 | 0.73 | 2.4 | 0.66 | 5.1 | 0.82 | 4 | 0.7 | 3.4 |
表2：在斑块阵列实验中对年龄匹配的对照血清样本进行筛选，显示了降脂药物的不同作用效果。 与未使用药物的对照组（第2、3列）相比，经依折麦布（第4、5列）、洛伐他汀（第6、7列）、辛伐他汀（第8、9列）和烟酸（第10、11列）处理的血清样本在诱导线性形状的LDL和HDL胆固醇颗粒形成方面表现出差异。
讨论
通常，血液中VLDL、LDL和HDL胆固醇颗粒的分布及其功能特性主要由代谢、遗传、流行病学、 细胞和血浆因素决定22,23。本研究在缓冲液中考察了调脂药物的作用，发现高脂溶性药物（如依折麦布、洛伐他汀、辛伐他汀和阿托伐他汀）对胆固醇颗粒形态的影响更为显著，相比之下，高水溶性的瑞舒伐他汀和氟伐他汀则影响较小。这些结果与我们先前的研究结果一致，此前研究描述了他汀类药物通过非酶促机制影响缓冲液和血清样本中LDL和HDL胆固醇颗粒形成的效应21。因此，本研究结果揭示了依折麦布、烟酸、贝特类药物以及omega-3脂肪酸药物可能通过非酶促作用机制，直接参与调控胆固醇颗粒的形成。药物与胆固醇聚集体之间的相互作用可能导致形成尺寸为2–60 µm2的较大胆固醇颗粒，呈现球状和线状纤维形态。
此外，使用纯化的脂蛋白颗粒获得的结果表明，胆固醇聚集体与血浆因子（包括极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的蛋白质）之间存在相互作用，这些相互作用可能改变胆固醇颗粒的组成和形态特性。涉及纯化脂蛋白颗粒的药物处理结果显示，这些药物对极低密度脂蛋白颗粒形成的影响程度高于其对低密度脂蛋白胆固醇颗粒形成的影响。洛伐他汀、辛伐他汀和依折麦布作为前体药物使用，其在检测中的剂量可能高于生理浓度。
有趣的是，血清样本的筛选显示，药物在改变VLDL、LDL和HDL胆固醇颗粒形成谱方面存在差异，尤其是对线状LDL和HDL颗粒形成的影响。这些药物在血脂异常和年龄匹配的正常血清样本中均诱导了线状LDL和HDL胆固醇颗粒形成的减少。在辛伐他汀、依折麦布、洛伐他汀和烟酸中，观察到的抑制线状颗粒形成的作用更为显著。在正常和血脂异常血清样本中鉴定出具有球状和线状结构形态的胆固醇颗粒，提示具有相似形态的颗粒可能在in vivo条件下形成。既往研究已鉴定出在人及ApoE-/-和LDLR-/-小鼠模型的动脉粥样硬化斑块中存在盘状和针状胆固醇晶体24,25,26,27,28。
血液中循环的高密度脂蛋白（HDL）颗粒具有异质性混合物的特征，其中小尺寸和大尺寸HDL颗粒的水平及其功能活性，是通过逆向胆固醇转运途径发挥心脏保护作用的重要因素29,30。近期研究强调了鉴定HDL胆固醇颗粒亚组分的重要性，以阐明其在胆固醇外排、抗炎、抗血栓和抗氧化等多种生物学功能中的作用31。此外，多项研究已报道降脂治疗对提高血浆中低至中等水平HDL的影响1,5,21。因此，本研究结果为胆固醇颗粒的形态学特征提供了新的见解。值得注意的是，在血脂异常受试者的血清样本中检测到较高水平的线性HDL胆固醇颗粒，提示其可能作为诊断以及评估患者调脂药物疗效的可靠生物标志物。然而，仍需利用更大规模的临床样本进一步研究，以更深入理解具有不同形态的胆固醇颗粒及其与心血管疾病（CVD）的关联。
在用于检测药物对胆固醇颗粒组装影响的斑块阵列实验中，我们使用了2 µg荧光标记的胆固醇聚集体和每种药物5 µg，原因如下：（1）药物会竞争性地结合荧光标记的胆固醇以及血清样本中存在的内源性脂质；（2）从每个样本中我们获得了5,000至10,000个组装成较大尺寸和形状的胆固醇颗粒，其面积范围约为~2 - 60 µ2；（3）我们观察到不同血清样本在与药物（剂量为300 ng至5 µg）孵育后，药物反应存在广泛差异，其中约1 - 5%的样本在高剂量药物孵育后，胆固醇颗粒形成谱型未显示出可检测的变化；（4）胆固醇聚集体与降脂药物之间的相互作用由非酶促过程介导。因此，实验中所用试剂的浓度可能高于其生理水平。
总之，我们已成功展示了以下优势： 体外 本研究中描述的成像方法可用于确定多种降脂药物对胆固醇颗粒形态和组成调控作用的影响。通过采用一系列图像分析算法对脂质颗粒形态进行可视化和定量分析，该方法可能有助于动脉粥样硬化的诊断以及评估患者降脂治疗的疗效。
披露
Madasamy 博士获得了 Plaxgen 公司的资助，并存在竞争性财务利益。其他作者没有需要披露的竞争性财务利益。
致谢
本工作由授予 SM 的 Plaxgen 研究基金（PLX-1008）资助。我们感谢帕洛阿尔托医学研究基金会研究所根据机构审查委员会批准，收集动脉粥样硬化受试者的血清样本。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| TopFluor 荧光胆固醇 | Avanti Polar lipids | 将 100 µl 分装样品于 -20 °C 保存 | |
| 辛伐他汀（前药） | Cayman Chemicals | 将 100 µl 分装样品于 -20 °C 保存 | |
| 洛伐他汀（前药） | Cayman Chemicals | 将 100 µl 分装样品于 -20 °C 保存 | |
| 瑞舒伐他汀 | Cayman Chemicals | 将 100 µl 分装样品于 -20 °C 保存 | |
| 阿托伐他汀 | Cayman Chemicals | 将 100 µl 分装样品于 -20 °C 保存 | |
| 氟伐他汀 | Cayman Chemicals | 将 100 µl 分装样品于 -20 °C 保存 | |
| 依折麦布（前药） | Cayman Chemicals | 将 100 µl 分装样品于 -20 °C 保存 | |
| 烟酸 | MilliporeSigma | 将 100 µl 分装样品于 -20 °C 保存 | |
| 贝特类药物 | MilliporeSigma | 将 100 µl 分装样品于 -20 °C 保存 | |
| ω-3 脂肪酸 | MilliporeSigma | 将 100 µl 分装样品于 -20 °C 保存 | |
| 纯化的 VLDL 蛋白/颗粒 | Lee Bio | ||
| 纯化的 LDL 蛋白/颗粒 | Lee Bio | ||
| 纯化的 HDL 蛋白/颗粒 | Lee Bio | ||
| 人源年龄匹配血清 | Dx Biosamples | ||
| 人源动脉粥样硬化血清 | Bioserve | ||
| 人源正常血清 | Stanford Blood center | ||
| LDL 检测试剂盒 | Roche Diangostics | ||
| HDL 检测试剂盒 | Roche Diangostics | ||
| 总胆固醇检测试剂盒 | Roche Diangostics | ||
| 96 孔微孔板 | |||
| 甘油三酯检测试剂盒 | Roche Diangostics | ||
| Amnis 成像流式细胞仪 | Amnis Inc | ||
| IDEAS 图像分析软件 | Amnis Inc | ||
| 化学分析仪-1，ChemWel 2902 | Awarness Technology | ||
| 化学分析仪-2，Intergra 400 | Roche Diangostics |
参考文献
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