降血脂药物对胆固醇颗粒形态的差异化作用

本研究的总体目标是使用噬菌斑阵列方法评估降脂药物在调节胆固醇颗粒形态学特征中的作用，并确定用于诊断动脉粥样硬化和确定药物作用的潜在生物标志物。降脂药物在调节胆固醇颗粒形成中的作用知之甚少。在这里，我们证明了降脂药物在改变胆固醇颗粒形成的概况和形态特征中起直接作用。

与其他颗粒检测方法相比，基于噬菌斑阵列的体外成像方法的主要优点是它能够可视化胆固醇颗粒，以评估血清中降脂药物的作用。Plaxgen 的实验室技术员 Jason Lundry 将演示我们如何使用化学分析仪设置噬菌斑阵列检测。Millipore Sigma 的高级科学家 Raymond Kong 将演示我们如何使用成像流式细胞术进行样品处理。

最后，Plaxgen 的实验室技术员 David Liu 将演示胆固醇颗粒图像的数据分析。使用化学分析仪-1 设置用于胆固醇颗粒形成的噬菌斑阵列测定。在整个检测过程中，将每个孔中的最终反应体积保持在 200 μL，并一式三份进行所有检测。

首先，将 194 点 5 微升磷酸盐缓冲盐水 （PDS） 加载到圆底、低蛋白结合 96 孔板的每个孔中。向每个孔中加入 2 点 5 微升每种降脂药物溶液，不向阴性对照样品中添加任何药物。然后，摇动板 30 秒，将其放在化学分析仪-1 反应板上，使药物均匀混合成溶液。

最后，向每个孔中加入两微升荧光标记的胆固醇聚集体溶液。像以前一样，将板放在化学分析仪-1 反应板上摇动板 30 秒。然后，将板在实验室摇床上孵育 2 小时，温度为 37 摄氏度，转速为 200 rpm。

孵育后，通过流式细胞术成像获取颗粒的图像。打开数据采集模板以加载正确的仪器设置。单击 文件（File），然后选择 加载模板（Load Template） 并选择模板文件。

单击 Load（加载），准备用于样品加载的仪器。当 Load Sample 对话框打开时，单击 OK（确定）将 50 μL 样品加载到成像流式细胞仪中。等到可以在成像区域实时看到颗粒。

当成像区域中的颗粒聚焦良好时，单击 Acquire（获取）以高通量方式同时获取每个物体的图像，包括暗场、明场、绿色荧光和黄色荧光。在采集结束时，单击 Return 按钮以返回样本。重复这些步骤，从每个样品中采集 5， 000 到 10， 000 个颗粒。

使用图像分析软件分析所有原始图像文件，以确定对象荧光强度和形态变化，如文本协议中所述。通过逐步加载试剂制备圆底低蛋白结合 96 孔板，使用每孔 200 微升的最终反应体积。首先，准备对照孔。

向每个孔中加载 193 微升 PBS。添加 2.5% 的患者血清，每孔仅上样一份血清样品。然后，将板放在化学分析仪反应板上摇晃板 30 秒。

接下来，向每个孔中加入两微升荧光标记的胆固醇聚集体溶液。再次将板放在化学分析仪-1 反应板上，摇动板 30 秒。要用药物制备孔，请向每个孔中加载 191 微升 PBS。

然后，每孔添加 2.5% 的每种患者血清，并将其放在化学分析仪-1 反应板上，摇动板 30 秒。向除阴性对照孔外的所有孔中加入两微升依折麦布、洛伐他汀、辛伐他汀或烟酸溶液。每孔仅添加一种药物。

像以前一样继续摇晃板 30 秒。接下来，在每个孔中加入 2 微升荧光标记的胆固醇聚集体溶液，然后摇动板 30 秒。然后，将板在实验室摇床中孵育 2 小时，温度为 37 摄氏度，转速为 200 rpm。

孵育后，按照与以前相同的设置通过流式细胞术成像获取样品。使用图像分析软件对所有图像文件进行批处理，如文本协议中所述。此处显示的代表性结果显示了通过非酶机制鉴定由他汀类药物诱导的球状和线性链状胆固醇颗粒。

证实了由其他降脂药物诱导的胆固醇颗粒形成的两种不同形态。包括依折麦布、烟酸、贝特类和 omega-3 脂肪酸。此处显示的是点图，其中 X 轴显示在绿色荧光通道中检测到的胆固醇颗粒光谱。

Y 轴显示侧向散射，门控显示荧光点图中检测到的极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白颗粒的区域。这些结果表明，在没有药物、依泽胺、洛伐他汀、辛伐他汀和烟酸存在的情况下，降脂作用如何改变纯化的 VLDL 和 LDL 胆固醇颗粒的谱。这里显示的是三种不同血清样品的筛选，用于鉴定各种降脂药物的不同作用，这些药物调节 VLDL、LDL 和 HDL 胆固醇颗粒形成的概况。

这些特征表明，三种不同血清样品之间的反应水平也存在差异。筛选血清样品 1 在没有药物的情况下和在各种降脂药物存在下形成的球状和线性胆固醇颗粒，证实了血清衍生胆固醇颗粒的两种不同形态，显示球状和线性链形状。因此，我们已经成功地证明了一种体外成像方法，用于鉴定降脂药物的作用，该方法调节与胆固醇颗粒形成的关系及其临床意义。

我们的初步结果很有希望，我们正在使用大规模临床样本进一步验证这种噬菌斑阵列检测。您的标准血脂检测试剂盒可测量血清中的 LDL 和 HDL 胆固醇水平。我们的斑块阵列检测，希望提高动脉粥样硬化风险的准确性，并使用血清预测降脂药物反应。