Name: 降血脂药物对胆固醇颗粒形态的差异化作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 了解降血脂药物对胆固醇颗粒形态的差异化作用，使用斑块阵列方法进行体外成像分析。该研究有助于识别动脉粥样硬化的潜在生物标志物并评估药物疗效。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由授予 SM 的 Plaxgen 研究基金（PLX-1008）资助。我们感谢帕洛阿尔托医学研究基金会研究所根据机构审查委员会批准，收集动脉粥样硬化受试者的血清样本。

1. 荧光标记胆固醇及降脂药物的制备
注意：荧光标记的胆固醇聚集体和他汀类药物的制备方法详见我们之前发表的文章21。有关本研究中使用的试剂、成像流式细胞仪、化学分析仪和数据分析软件的详细信息，请参见材料表。
<ol>
	<li>将荧光标记的冻干胆固醇（1 mg，激发/发射波长 = 495 nm/507 nm）粉末溶于 1 mL 100% 酒精中。</li>
	<li>将样品在 2,040 × g 条件下离心 3 分钟，取上清液用于斑块阵列实验，其中含有可溶性荧光标记胆固醇聚集体。</li>
	<li>药物配制时，分别将辛伐他汀、洛伐他汀、阿托伐他汀、依折麦布和 omega-3 脂肪酸的粉末（各 2 mg）溶于 1 mL 100% 酒精中。</li>
	<li>在 2,040 × g 条件下离心 3 分钟后，取含药物的上清液用于实验。</li>
	<li>同样，分别将氟伐他汀、瑞舒伐他汀、烟酸和贝特类药物的粉末（各 2 mg）溶于 1 mL 去离子水中，配制成 2 mg/mL 的储备液。</li>
	<li>在 2,040 × g 条件下离心 3 分钟后，取含药物的上清液用于斑块阵列实验。</li>
</ol>
2. 用于检测的斑块阵列实验 体外 胆固醇颗粒的形成
<ol>
	<li>使用化学分析仪-1（见材料表）建立胆固醇颗粒形成的斑块阵列检测。在圆底、低蛋白结合的96孔板中进行检测，使用第1节中配制的试剂。每孔最终反应体积保持在200 µL，并且所有检测均设三个重复。
	<ol>
		<li>首先，向每孔加入194.5 µL磷酸盐缓冲液（PBS）。</li>
		<li>向每孔加入2.5 µL（5 µg）每种降脂药物溶液，并将板置于化学分析仪-1反应板上振荡30秒，使药物充分混匀。阴性对照样品中不添加药物。</li>
		<li>最后，向每孔加入2 µL（2 µg）荧光标记的胆固醇聚集体溶液，并将板置于化学分析仪-1反应板上振荡30秒。</li>
		<li>将板置于摇床中，在37 °C、200 rpm条件下孵育2小时。</li>
		<li>孵育结束后，通过成像流式细胞术获取颗粒图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用成像流式细胞术捕获胆固醇颗粒的图像
<ol>
	<li>打开数据采集模板以加载正确的仪器设置。点击“File”，然后选择“Open Template…”，并选择模板文件。</li>
	<li>点击“Flush, Lock, Load”以准备仪器进行样本加载。</li>
	<li>当“Load Sample”对话框打开时，点击“OK”以从第2节中准备的每个孔中加载50 µL样本至成像流式细胞仪。</li>
	<li>点击“Run|Setup”以实时查看成像区域中的颗粒。</li>
	<li>当成像区域中的颗粒处于良好聚焦状态时，点击“Run|Acquire”以高通量方式同时获取每个对象的暗场（侧向散射/SSC）、明场（BF）、绿色荧光和黄色荧光图像。</li>
	<li>重复步骤3.2–3.5，从每个样本中获取5,000–10,000个颗粒。</li>
	<li>使用图像分析软件分析所有原始图像文件，以确定对象的荧光强度和形态学变化。
	<ol>
		<li>在图像分析软件顶部点击“Tools”按钮，然后从下拉菜单中选择“Batch Data Files”，这将打开“Batches”窗口。</li>
		<li>在“Batches”窗口中，点击“Add Batch”按钮，这将打开“Define a Batch”窗口。</li>
		<li>在“Define a Batch”窗口中，点击“Add Files”按钮并选择原始图像文件，点击“Template”按钮并选择适当的数据分析模板文件，然后选择“OK”和“Submit Batches”以开始对原始图像文件进行处理和分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 基于斑块阵列检测法评估降脂药物对纯化胆固醇颗粒的作用
<ol>
	<li>如步骤 2.1 所述，使用纯化的 VLDL、LDL 和 HDL 脂蛋白/颗粒进行胆固醇颗粒形成实验。在 96 孔板中进行斑块阵列实验。
	<ol>
		<li>首先，向所有孔中加入 PBS；每孔终体积为 200 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>作为阴性对照，分别向各孔中加入 4 µg 的 VLDL、LDL 或 HDL 蛋白/颗粒，不加药物，并将板在振荡器上震荡 30 秒。
	<ol>
		<li>为检测降脂药物的作用，分别向各孔中加入 4 µg 的 VLDL、LDL 或 HDL 蛋白/颗粒，并将板在振荡器上震荡 30 秒。</li>
		<li>对于已加入 4 µg VLDL、LDL 或 HDL 的孔，加入 2.5 µL（5 µg）的依折麦布、洛伐他汀、辛伐他汀或烟酸溶液，并将板置于化学分析仪-1 上震荡 30 秒。</li>
		<li>最后，向所有孔中加入 2 µL（2 µg）荧光标记的胆固醇聚集体溶液，并将板置于化学分析仪-1 反应板上震荡 30 秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将板置于设定为 37 °C 和 200 rpm 的实验室摇床中孵育 2 小时。</li>
	<li>按照步骤 3.1 至 3.5 使用成像流式细胞术采集样本。</li>
	<li>按照步骤 3.7 所述，使用图像分析软件分析原始图像文件。</li>
	<li>在分析模板中，使用以下设门策略来鉴定胆固醇颗粒亚群。
	<ol>
		<li>在绿色通道饱和像素数（x 轴）与暗场通道饱和像素数（y 轴）的图中，排除在任一通道中具有一个或多个饱和像素的对象。</li>
		<li>使用绿色通道强度（x 轴）与 SSC 强度（y 轴）绘制无饱和像素的对象/颗粒：根据其绿色通道和 SSC 强度，对象落入三个区域之一（VLDL、LDL、HDL）。 
		注：这些设门基于使用纯化的 VLDL、LDL 和 HDL 颗粒/蛋白在无药物条件下进行的对照实验所生成的数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为确定每份样本中降脂药物的作用，计算总脂蛋白颗粒浓度以及各亚群（VLDL、LDL、HDL）所占百分比，方法如步骤 6.5 所述。
	<ol>
		<li>使用以下公式计算颗粒浓度（颗粒/mL）： 
		<img alt="颗粒浓度公式，[颗粒] = 颗粒数/(样本流速×采集时间)。" src="/files/ftp_upload/56596/56596eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation"> 
		注：荧光散点图中的 VLDL、LDL 和 HDL 设门区域可检测到各自亚群约 80% 的颗粒，其余约 20% 的颗粒与其他设门区域存在重叠。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 血清样本中脂质浓度的测定
<ol>
	<li>使用年龄匹配的正常个体和血脂异常个体的血清样本，通过化学分析仪-2测定低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、胆固醇和甘油三酯的浓度。</li>
	<li>根据血清样本中低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、胆固醇和甘油三酯的浓度超出其上下参考值范围的情况，定义其浓度异常。</li>
	<li>遵循试剂制造商推荐的正常参考值：胆固醇（4 - 200 mg/dL）、高密度脂蛋白（HDL）（3.0 - 65 mg/dL）、低密度脂蛋白（LDL）（4 - 100 mg/dL）和甘油三酯（9 - 200 mg/dL）。</li>
	<li>将胆固醇和甘油三酯浓度低于下限参考值或高于上限参考值的血清样本识别为异常样本，并用于在有或无降脂药物存在条件下的筛选。</li>
</ol>
6. 分析药物对血清样本中胆固醇颗粒形成的影响
<ol>
	<li>使用化学分析仪-1 建立血清样本中胆固醇颗粒形成的斑块阵列检测。在圆底、低蛋白结合的 96 孔板中进行该检测。每孔最终反应体积为 200 µL，所有检测均设三个重复。</li>
	<li>逐步加入试剂以准备酶标板。
	<ol>
		<li>准备对照孔。</li>
		<li>向每孔加入 193 µL PBS。</li>
		<li>加入 2.5%（v/v）患者血清（每孔仅加一个血清样本），并将酶标板置于化学分析仪反应板上振荡 30 秒。</li>
		<li>向每孔加入 2 µL（2 µg）荧光标记的胆固醇聚集体溶液，并将酶标板置于化学分析仪-1 反应板上振荡 30 秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备含药物的孔。
	<ol>
		<li>向每孔加入 191 µL PBS。</li>
		<li>加入 2.5%（v/v）患者血清（每孔仅加一个血清样本），并将酶标板置于化学分析仪-1 反应板上振荡 30 秒。</li>
		<li>向除阴性对照孔外的所有孔中加入 2 µL 依折麦布、洛伐他汀、辛伐他汀或烟酸溶液（4 µg）。每孔仅加一种药物，并将酶标板置于化学分析仪-1 反应板上振荡 30 秒。</li>
		<li>向每孔加入 2 µL 荧光标记的胆固醇聚集体溶液（2 µg），并将酶标板置于化学分析仪-1 反应板上振荡 30 秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>仅在所有孔（对照和药物处理组）均已加入相应血清样本后，再加入药物，并在此步骤最后加入荧光标记的胆固醇。</li>
	<li>将酶标板置于设定为 37 °C 和 200 rpm 的实验室摇床中孵育 2 小时。</li>
	<li>按照步骤 3.1 - 3.6 中所述设置，使用成像流式细胞仪采集样本数据。</li>
	<li>使用图像分析软件，采用与步骤 3.7 中所述相同的模板对所有图像文件进行批量处理。
	<ol>
		<li>按照步骤 4.5 和 4.6 中所述方法，在图上绘制门控区域进行数据分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为确定每个样本的降脂药物效应/反应（低、中、高），需计算总脂蛋白颗粒浓度，以及 VLDL、LDL 和 HDL 亚群占总颗粒的百分比。</li>
	<li>将 VLDL、LDL 和 HDL 群体绘制在物体明场图像的直方图上，以长度减去宽度（length - width）为参数，并划分为球形或线性区域：(length - width) ≤2 µm 的物体归入球形区域，用于计算球形和线性颗粒的百分比。</li>
	<li>比较每种血清样本在有无每种药物孵育条件下所识别出的球形和线性 LDL 与 HDL 胆固醇颗粒的百分比。对于每个血清样本获得的三个重复值，采用落在均值 ±2 SD 范围内的球形和线性 LDL 与 HDL 颗粒百分比来确定药物效应。</li>
</ol>

<ol><li>Pahan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-lowering+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipid-lowering drugs.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 1165-1178 (2006).</li>
<li>Laforest, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+low+high-density+lipoprotein+cholesterol+and+hypertriglyceridaemia+in+patients+treated+with+hypolipidaemic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Cardiovasc+Dis%22%5BJournal%5D)">Prevalence of low high-density lipoprotein cholesterol and hypertriglyceridaemia in patients treated with hypolipidaemic drugs.</a> Arch Cardiovasc Dis. 102, 43-50 (2009).</li>
<li>Roberts, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+and+arresting+coronary+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Preventing and arresting coronary atherosclerosis.</a> Am Heart J. 130, 580-600 (1995).</li>
<li>Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+cholesterol+and+coronaries%3A+from+plaques+to+genes+to+statins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A century of cholesterol and coronaries: from plaques to genes to statins.</a> Cell. 16, 161-172 (2015).</li>
<li>Drexel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins%2C+fibrates%2C+nicotinic+acid%2C+cholesterol+absorption+inhibitors%2C+anion-exchange+resins%2C+omega-3+fatty+acids%3A+which+drugs+for+which+patients%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Fundam+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Statins, fibrates, nicotinic acid, cholesterol absorption inhibitors, anion-exchange resins, omega-3 fatty acids: which drugs for which patients?</a> Fundam Clin Pharmacol. 23, 687-692 (2009).</li>
<li>Camelia, S., Anca, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins%3A+Mechanism+of+action+and+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell.Mol.Med%22%5BJournal%5D)">Statins: Mechanism of action and effects.</a> J.Cell.Mol.Med. 5, 378-387 (2001).</li>
<li>Schaefer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparisons+of+effects+of+statins+%28atorvastatin%2C+fluvastatin%2C+lovastatin%2C+pravastatin%2C+and+simvastatin%29+on+fasting+and+postprandial+lipoproteins+in+patients+with+coronary+heart+disease+versus+control+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Comparisons of effects of statins (atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, and simvastatin) on fasting and postprandial lipoproteins in patients with coronary heart disease versus control subjects.</a> Am J Cardiol. 93, 31-39 (2004).</li>
<li>Meyers, C. D., Kamanna, V. S., Kashyap, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niacin+therapy+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+in+Lipid%22%5BJournal%5D)">Niacin therapy in atherosclerosis.</a> Curr Opin in Lipid. 15, 659-665 (2004).</li>
<li>Phan, B. A., Dayspringm, T. D., Toth, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ezetimibe+therapy%3A+mechanism+of+action+and+clinical+update%5BTitle%5D)+AND+%22Vasc+Health+Risk+Mana%22%5BJournal%5D)">Ezetimibe therapy: mechanism of action and clinical update.</a> Vasc Health Risk Mana. 8, 415-427 (2012).</li>
<li>Leitersdorf, E., Fruchart, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+action+of+fibrates+on+lipid+and+lipoprotein+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Mechanism of action of fibrates on lipid and lipoprotein metabolism.</a> Circulation. 98, 2088-2093 (1998).</li>
<li>Backes, J., Anzalone, D., Hilleman, D., Catini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+relevance+of+omega-3+fatty+acids+in+the+management+of+hypertriglyceridemia%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">The clinical relevance of omega-3 fatty acids in the management of hypertriglyceridemia.</a> Lipids Health Dis. 15, 118(2016).</li>
<li>Davidson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Significance+of+Statin+Pleiotropic+Effects+Hypotheses+Versus+Evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Clinical Significance of Statin Pleiotropic Effects Hypotheses Versus Evidence.</a> Circulation. 111, 2280-2281 (2005).</li>
<li>Chinetti-Gbaguidi, G., Fruchart, J. C., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+effects+of+fibrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Atheroscler+Rep%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic effects of fibrates.</a> Curr Atheroscler Rep. 7, 396-401 (2005).</li>
<li>McTaggart, F., Jones, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Statins+on+High-Density+Lipoproteins%3A+A+Potential+Contribution+to+Cardiovascular+Benefit+Effects+of+Statins+on+High-Density+Lipoproteins%3A+A+Potential+Contribution+to+Cardiovascular+Benefit%5BTitle%5D)+AND+%22CardiovascDrugs+Ther%22%5BJournal%5D)">Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit.</a> CardiovascDrugs Ther. 22, 321-338 (2008).</li>
<li>Quehenberger, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Plasma+Lipidome%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The Human Plasma Lipidome.</a> N Engl J Med. 365, 1812-1823 (2011).</li>
<li>Lund-Katz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+responsible+for+the+compositional+heterogeneity+of+nascent+high+density+lipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms responsible for the compositional heterogeneity of nascent high density lipoprotein.</a> J. Biol Chem. 288, 23150-23160 (2013).</li>
<li>Krauss, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoprotein+subfractions+and+cardiovascular+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Lipidol%22%5BJournal%5D)">Lipoprotein subfractions and cardiovascular disease risk.</a> Curr Opin Lipidol. 21, 305-311 (2010).</li>
<li>Krauss, R. M., Burke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+subclasses+of+plasma+low+density+lipoproteins+in+normal+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple subclasses of plasma low density lipoproteins in normal humans.</a> J Lipid Res. 23, 97-104 (1982).</li>
<li>Rosenson, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL+measures%2C+particle+heterogeneity%2C+proposed+nomenclature%2C+and+relation+to+atherosclerotic+cardiovascular+Events%5BTitle%5D)+AND+%22Clinic+Chemi%22%5BJournal%5D)">HDL measures, particle heterogeneity, proposed nomenclature, and relation to atherosclerotic cardiovascular Events.</a> Clinic Chemi. 57, 392-410 (2011).</li>
<li>Madasamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque+array+method+and+proteomics-based+identification+of+biomarkers+from+Alzheimer%27s+disease+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Plaque array method and proteomics-based identification of biomarkers from Alzheimer's disease serum.</a> Clin Chim Acta. 441, 79-85 (2015).</li>
<li>Madasamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonenzymatic+Mechanism+of+Statins+in+Modulating+Cholesterol+Particles+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Nonenzymatic Mechanism of Statins in Modulating Cholesterol Particles Formation.</a> Am J Cardiol. 118, 1187-1191 (2016).</li>
<li>Peter, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+the+biochemical%2C+metabolic%2C+and+genetic+factors+that+influence+low-density+lipoprotein+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of the biochemical, metabolic, and genetic factors that influence low-density lipoprotein heterogeneity.</a> Am J Cardiol. 90, 30-47 (2002).</li>
<li>Weissglas-Volkov, D., Pajukanta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+causes+of+high+and+low+serum+HDL-cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic causes of high and low serum HDL-cholesterol.</a> J Lipid Res. 51, 2032-2057 (2010).</li>
<li>Abela, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+statins+on+cholesterol+crystallization+and+atherosclerotic+plaque+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effect of statins on cholesterol crystallization and atherosclerotic plaque stabilization.</a> Am J Cardiol. 107, 1710-1717 (2011).</li>
<li>Nidorf, S. M., Eikelboom, J. W., Thompson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cholesterol+crystal-induced+inflammation+for+the+secondary+prevention+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting cholesterol crystal-induced inflammation for the secondary prevention of cardiovascular disease.</a> Cardiovasc Pharmacol Ther. 19, 45-52 (2014).</li>
<li>Thacker, S. G., Zarzour, A., Chen,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+density+lipoprotein+reduces+inflammation+from+cholesterol+crystals+by+inhibiting+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol%22%5BJournal%5D)">High density lipoprotein reduces inflammation from cholesterol crystals by inhibiting inflammasome activation.</a> Immunol. 149, 306-319 (2016).</li>
<li>Kim, S. H., Lee, E. S., Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+coherent+anti-stokes+Raman+Spectroscopy+images+intact+atheromatous+lesions+and+concomitantly+identifies+distinct+chemical+profiles+of+atherosclerotic+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Multiplex coherent anti-stokes Raman Spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids.</a> Circ Res. 106, 1332-1341 (2010).</li>
<li>Lim, R. S., Suhalim, J. L., Miyazaki-Anzai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cholesterol+crystals+in+plaques+of+atherosclerotic+mice+using+hyperspectral+CARS+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of cholesterol crystals in plaques of atherosclerotic mice using hyperspectral CARS imaging.</a> J Lipid Res. 52, 2177-2186 (2011).</li>
<li>Rothblat, G. H., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+lipoprotein+heterogeneity+and+function+in+reverse+cholesterol+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Lipidol%22%5BJournal%5D)">High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport.</a> Curr Opin Lipidol. 21, 229-238 (2011).</li>
<li>Kontush, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL+particle+number+and+size+as+predictors+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">HDL particle number and size as predictors of cardiovascular disease.</a> Front in Pharmacol. , (2015).</li>
<li>Karathanasis, S. K., Freeman, L. A., Gordon, S. M., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+face+of+HDL+and+the+best+way+to+measure+it%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The changing face of HDL and the best way to measure it.</a> Clin. Chem. 63, 196-210 (2017).</li>
</ol>

Madasamy 博士获得了 Plaxgen 公司的资助，并存在竞争性财务利益。其他作者没有需要披露的竞争性财务利益。

通常，血液中VLDL、LDL和HDL胆固醇颗粒的分布及其功能特性主要由代谢、遗传、流行病学、&#160;细胞和血浆因素决定22,23。本研究在缓冲液中考察了调脂药物的作用，发现高脂溶性药物（如依折麦布、洛伐他汀、辛伐他汀和阿托伐他汀）对胆固醇颗粒形态的影响更为显著，相比之下，高水溶性的瑞舒伐他汀和氟伐他汀则影响较小。这些结果与我们先前的研究结果一致，此前研究描述了他汀类药物通过非酶促机制影响缓冲液和血清样本中LDL和HDL胆固醇颗粒形成的效应21。因此，本研究结果揭示了依折麦布、烟酸、贝特类药物以及omega-3脂肪酸药物可能通过非酶促作用机制，直接参与调控胆固醇颗粒的形成。药物与胆固醇聚集体之间的相互作用可能导致形成尺寸为2–60 µm2的较大胆固醇颗粒，呈现球状和线状纤维形态。
此外，使用纯化的脂蛋白颗粒获得的结果表明，胆固醇聚集体与血浆因子（包括极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的蛋白质）之间存在相互作用，这些相互作用可能改变胆固醇颗粒的组成和形态特性。涉及纯化脂蛋白颗粒的药物处理结果显示，这些药物对极低密度脂蛋白颗粒形成的影响程度高于其对低密度脂蛋白胆固醇颗粒形成的影响。洛伐他汀、辛伐他汀和依折麦布作为前体药物使用，其在检测中的剂量可能高于生理浓度。
有趣的是，血清样本的筛选显示，药物在改变VLDL、LDL和HDL胆固醇颗粒形成谱方面存在差异，尤其是对线状LDL和HDL颗粒形成的影响。这些药物在血脂异常和年龄匹配的正常血清样本中均诱导了线状LDL和HDL胆固醇颗粒形成的减少。在辛伐他汀、依折麦布、洛伐他汀和烟酸中，观察到的抑制线状颗粒形成的作用更为显著。在正常和血脂异常血清样本中鉴定出具有球状和线状结构形态的胆固醇颗粒，提示具有相似形态的颗粒可能在in vivo条件下形成。既往研究已鉴定出在人及ApoE-/-和LDLR-/-小鼠模型的动脉粥样硬化斑块中存在盘状和针状胆固醇晶体24,25,26,27,28。
血液中循环的高密度脂蛋白（HDL）颗粒具有异质性混合物的特征，其中小尺寸和大尺寸HDL颗粒的水平及其功能活性，是通过逆向胆固醇转运途径发挥心脏保护作用的重要因素29,30。近期研究强调了鉴定HDL胆固醇颗粒亚组分的重要性，以阐明其在胆固醇外排、抗炎、抗血栓和抗氧化等多种生物学功能中的作用31。此外，多项研究已报道降脂治疗对提高血浆中低至中等水平HDL的影响1,5,21。因此，本研究结果为胆固醇颗粒的形态学特征提供了新的见解。值得注意的是，在血脂异常受试者的血清样本中检测到较高水平的线性HDL胆固醇颗粒，提示其可能作为诊断以及评估患者调脂药物疗效的可靠生物标志物。然而，仍需利用更大规模的临床样本进一步研究，以更深入理解具有不同形态的胆固醇颗粒及其与心血管疾病（CVD）的关联。
在用于检测药物对胆固醇颗粒组装影响的斑块阵列实验中，我们使用了2 µg荧光标记的胆固醇聚集体和每种药物5 µg，原因如下：（1）药物会竞争性地结合荧光标记的胆固醇以及血清样本中存在的内源性脂质；（2）从每个样本中我们获得了5,000至10,000个组装成较大尺寸和形状的胆固醇颗粒，其面积范围约为~2 - 60 µ2；（3）我们观察到不同血清样本在与药物（剂量为300 ng至5 µg）孵育后，药物反应存在广泛差异，其中约1 - 5%的样本在高剂量药物孵育后，胆固醇颗粒形成谱型未显示出可检测的变化；（4）胆固醇聚集体与降脂药物之间的相互作用由非酶促过程介导。因此，实验中所用试剂的浓度可能高于其生理水平。
总之，我们已成功展示了以下优势： 体外 本研究中描述的成像方法可用于确定多种降脂药物对胆固醇颗粒形态和组成调控作用的影响。通过采用一系列图像分析算法对脂质颗粒形态进行可视化和定量分析，该方法可能有助于动脉粥样硬化的诊断以及评估患者降脂治疗的疗效。

大量临床研究已证实，降脂药物在降低低密度脂蛋白（LDL）胆固醇血浆水平方面具有有益作用，同时可轻度至中度升高高密度脂蛋白（HDL）胆固醇水平，从而预防动脉粥样硬化相关的心血管不良事件的初发和再发1,2,3,4,5。他汀类药物是一类HMG-CoA还原酶抑制剂，通过抑制肝脏内源性胆固醇的合成，继而降低血液中循环的LDL胆固醇水平6,7。同样，烟酸的降脂作用是通过直接且非竞争性地抑制肝细胞中的二酰基甘油酰基转移酶-2（diacylglycerol acyltransferase-2）实现的，该酶是甘油三酯合成过程中的关键肝脏酶8。相比之下，依折麦布通过与小肠上皮细胞中的Niemann-Pick C1样1（NPC1L1）蛋白结合，限制外源性胆固醇的吸收，从而降低LDL的血浆水平9。非诺贝特是另一种降脂药物，主要通过过氧化物酶体增殖物激活受体通路显著降低血浆甘油三酯浓度，并中度降低LDL胆固醇水平10。此外，有报道称ω-3脂肪酸因其能够降低LDL胆固醇的血浆水平而具有抗动脉粥样硬化作用11。
降脂药物除了降低低密度脂蛋白胆固醇的主要作用外，还具有多种有益的多效性作用，包括提高高密度脂蛋白水平、改善内皮功能、减轻炎症反应以及抑制血小板聚集。12,13,14然而，这些药物在增加高密度脂蛋白（HDL）胆固醇颗粒并修饰其结构特征方面的潜在机制尚未完全阐明。由于这些药物被广泛用于治疗动脉粥样硬化相关的心血管疾病（CVDs），进一步研究其在决定脂质颗粒形态特征和分布方面可能发挥的作用显得尤为重要。人类血浆脂质组包含约600种不同的脂质以及22种不同分子类型的胆固醇，这些成分存在于多种大小、形状、密度和组成的脂质颗粒中。15,16,17分析方法（如超速离心、核磁共振和梯度凝胶电泳）用于表征低密度脂蛋白和高密度脂蛋白颗粒及其亚组分18,19然而，这些方法的应用仅限于旨在确定药物对脂质颗粒形态和组装调控作用的研究。基于流式细胞仪的斑块阵列是一种功能性的生化检测方法，用于检测和可视化血清来源的脂质及淀粉样斑块颗粒。20. 该方法的优点包括 体外 本研究中描述的成像方法能够识别脂质调节药物对缓冲液和血清样本中胆固醇颗粒形态及分布的影响。

<table><tbody><tr><td>TopFluor 荧光胆固醇</td><td>Avanti Polar lipids</td><td></td><td>将 100 &amp;micro;l 分装样品于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>辛伐他汀（前药）</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>将 100 &amp;micro;l 分装样品于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>洛伐他汀（前药）</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>将 100 &amp;micro;l 分装样品于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>瑞舒伐他汀</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>将 100 &amp;micro;l 分装样品于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>阿托伐他汀</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>将 100 &amp;micro;l 分装样品于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>氟伐他汀</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>将 100 &amp;micro;l 分装样品于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>依折麦布（前药）</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>将 100 &amp;micro;l 分装样品于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>烟酸</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>将 100 &amp;micro;l 分装样品于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>贝特类药物</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>将 100 &amp;micro;l 分装样品于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>ω-3 脂肪酸</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>将 100 &amp;micro;l 分装样品于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>纯化的 VLDL 蛋白/颗粒</td><td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纯化的 LDL 蛋白/颗粒</td><td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纯化的 HDL 蛋白/颗粒</td><td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人源年龄匹配血清</td><td>Dx Biosamples</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人源动脉粥样硬化血清</td><td>Bioserve</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人源正常血清</td><td>Stanford Blood center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LDL 检测试剂盒</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDL 检测试剂盒</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>总胆固醇检测试剂盒</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 孔微孔板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>甘油三酯检测试剂盒</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amnis 成像流式细胞仪</td><td>Amnis Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IDEAS 图像分析软件</td><td>Amnis Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>化学分析仪-1，ChemWel 2902</td><td>Awarness Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>化学分析仪-2，Intergra 400</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

调节胆固醇颗粒形态的降脂药物差异效应

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

对血脂异常患者使用降脂药物可显著降低低密度脂蛋白（LDL）水平，并使血浆高密度脂蛋白（HDL）胆固醇水平出现轻度至中度升高。然而，这些药物在改变胆固醇颗粒形态和分布方面可能发挥的作用尚不明确。本文描述了 体外 使用斑块阵列法结合成像流式细胞术评估降脂药物对胆固醇颗粒形态特征的调节作用。对胆固醇颗粒的图像分析表明，洛伐他汀、辛伐他汀、依折麦布和阿托伐他汀可诱导球形及线状结构颗粒的形成，而烟酸、贝特类药物、氟伐他汀和瑞舒伐他汀仅诱导球形颗粒的形成。随后，将纯化的极低密度脂蛋白（VLDL）和低密度脂蛋白（LDL）颗粒与这些药物共同孵育，结果显示胆固醇颗粒亚群的形态和图像纹理发生改变。此外，对50份血清样本的筛查发现，血脂异常个体中线状高密度脂蛋白（HDL）胆固醇颗粒水平较高（平均为18.3%），高于年龄匹配的正常对照组（平均为11.1%）。我们还观察到不同降脂药物在减少血清样本中线状LDL和HDL胆固醇颗粒形成方面存在显著差异。这些结果表明，降脂药物除了通过细胞介导的降脂作用外，还可能通过非酶促机制直接调节胆固醇颗粒的形态。该研究结果有望为动脉粥样硬化的诊断以及优化降脂治疗方案提供依据。

本研究的目的是评估 体外 降脂药物对胆固醇颗粒形态的调节作用。不同降脂药物在调节胆固醇颗粒形态特征方面的效果存在差异。

血脂异常患者接受降脂药物治疗可显著降低低密度脂蛋白（LDL）水平，并使心血管事件风险降至较低甚至更低水平。

本研究的总体目标是利用斑块阵列方法评估降脂药物对胆固醇颗粒形态特征的调节作用，并识别可用于诊断动脉粥样硬化及确定药物效应的潜在生物标志物。目前，降脂药物在调节胆固醇颗粒形成方面的作用尚不明确。本文展示了降脂药物在改变胆固醇颗粒形成的谱型及形态特征方面具有直接作用。基于斑块阵列的体外成像方法相较于其他颗粒检测方法的主要优势在于，它能够实现对胆固醇颗粒的可视化，从而评估降脂药物在血清中的作用效果。Plaxgen 公司的实验室技术员 Jason Lundry 将演示我们如何使用化学分析仪建立斑块阵列检测。Millipore Sigma 公司的高级科学家 Raymond Kong 将演示我们如何利用成像流式细胞术进行样本处理。最后，Plaxgen 公司的实验室技术员 David Liu 将演示胆固醇颗粒图像的数据分析。使用化学分析仪-1 建立用于胆固醇颗粒形成的斑块阵列检测。在整个检测过程中，每个孔中的最终反应体积应维持在 200 µL，并且所有检测均需设三个重复孔。首先，向圆底、低蛋白结合力的96孔板的每个孔中加入194.5 µL磷酸盐缓冲液（PBS）。向每个孔中加入2.5 µL每种降脂药物溶液，阴性对照样品中不添加任何药物。然后，将该板置于化学分析仪-1反应板上，振荡30秒，使药物充分混匀于溶液中。最后，向每个孔中加入两微升荧光标记的胆固醇聚集体溶液。将板置于化学分析仪-1反应板上，像之前一样振荡30秒。然后，在37摄氏度、200 rpm条件下，于实验室摇床中孵育该板2小时。孵育后，通过成像流式细胞术获取颗粒的图像。打开数据采集模板以加载正确的仪器设置。单击“文件”，然后选择“加载模板”并选择模板文件。单击“加载”，以准备仪器进行样本加载。当“加载样本”对话框打开时，单击“确定”将 50 微升样本加载到成像流式细胞仪中。等待直至可在成像区域实时观察到颗粒。当成像区域内的颗粒处于良好聚焦状态时，点击“采集”按钮，以高通量方式同时获取每个物体的暗场、明场、绿色荧光和黄色荧光图像。采集完成后，点击“返回”按钮将样品归位。重复上述步骤，从每个样品中采集 5,000 至 10,000 个颗粒。使用图像分析软件分析所有原始图像文件，以确定目标物的荧光强度和形态学变化，具体操作如文本方案所述。准备一个圆底低蛋白结合96孔板，按步骤逐次加入试剂，每孔终反应体积为200 µL。首先，设置对照孔。向每个孔中加入193微升PBS。加入2.5%的患者血清，每孔仅加一个血清样本。然后将板置于化学分析仪反应板上，震荡30秒。接下来，向每个孔中加入两微升荧光标记的胆固醇聚集体溶液。再次将该板置于化学分析仪-1反应板上，振荡30秒。为制备含药物的孔，向每个孔中加入191微升磷酸盐缓冲液（PBS）。然后，每孔加入2.5%的每位患者血清，并将该反应板置于化学分析仪-1反应板上振荡30秒。除阴性对照孔外，向其余各孔中加入2微升依折麦布、洛伐他汀、辛伐他汀或烟酸溶液，每孔仅加入一种药物。继续像之前一样震荡平板30秒。接着，在每孔中加入2 µL荧光标记的胆固醇聚集体溶液，然后再次震荡平板30秒。随后，将平板置于实验室摇床中孵育2小时，设置温度为37 °C，转速为200 rpm。孵育后，采用与之前相同的设置，通过成像流式细胞术对样品进行检测。按照文本方案中所述，使用图像分析软件对所有图像文件进行批量处理。此处展示的是代表性结果，显示通过他汀类药物以非酶促机制诱导产生的球状和线状胆固醇颗粒的鉴定。显示了由其他降脂药物（包括依折麦布、烟酸、贝特类药物和 omega-3 脂肪酸）诱导产生的两种不同形态的胆固醇颗粒形成的确认结果。图中所示为点图，其中 X 轴显示在绿色荧光通道中检测到的胆固醇颗粒谱。Y轴显示侧向散射，门控显示了在荧光点图中检测到的极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白颗粒的区域。这些结果展示了降脂作用如何改变纯化的VLDL和LDL胆固醇颗粒的分布特征，在无药物、依折麦布、洛伐他汀、辛伐他汀和烟酸存在条件下的变化情况。此处展示的是对三种不同血清样本的筛查，用于识别多种降脂药物对VLDL、LDL和HDL胆固醇颗粒形成谱型调节作用的差异效应。这些图谱表明，三种不同血清样本之间的反应水平也存在差异。对一号血清样本中在无药物存在以及在多种降脂药物作用下形成的球状和线状胆固醇颗粒进行筛选，证实了血清来源的胆固醇颗粒具有两种不同的形态，即球状和线状结构。因此，我们成功建立了一种体外成像方法，可用于识别降脂药物对胆固醇颗粒形成的影响及其临床意义。我们的初步结果令人鼓舞，目前正利用大规模临床样本进一步验证该斑块阵列检测方法。常规血脂检测可测定血清中的低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）胆固醇水平。我们的斑块阵列检测方法有望提高动脉粥样硬化风险评估的准确性，并利用血清预测降脂药物的治疗反应。

differential-effects-lipid-lowering-drugs-modulating-morphology

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

降血脂药物对胆固醇颗粒形态的差异化作用

胆固醇测定旨在定量测定培养细胞中胆固醇流出的速率，以及血浆受体接受细胞释放胆固醇的能力。该测定包括用胆固醇标记细胞、细胞内胆固醇池间的平衡，以及胆固醇向细胞外受体的释放。...

胆固醇外流实验

超过一半的蛋白质是小分子蛋白质（分子质量 &lt;200 kDa），这类蛋白质在电子显微镜成像和三维重构方面均具有挑战性。优化的负染色法是一种可靠且高通量的方案，可在不同生理条件下获得小分子非对称蛋白质或复合物的高对比度和相对高分辨率（约 1...

优化的负染色法：一种高通量电镜检测小分子及非对称蛋白结构的实验方案

本方案提供了一种高效的方法，利用活细胞成像系统在多种细胞类型中实时测量低密度脂蛋白（LDL）胆固醇的摄取速率。该技术为筛选影响LDL内流的化合物的药理活性提供了平台，同时可监测细胞形态，从而评估潜在的细胞毒性。...

使用活细胞成像分析结合细胞健康监测的低密度脂蛋白胆固醇摄取检测

本文介绍了一种基于定量实时聚合酶链式反应的方法，用于测定脂蛋白颗粒中内源性微小RNA的含量（绝对/相对含量）。此外，还展示了提高微小RNA水平的方法，以及测定细胞对脂蛋白颗粒摄取速率的方法。...

天然脂蛋白颗粒中microRNA的富集及其绝对/相对microRNA含量与细胞间转移速率的测定

介绍了两种胆固醇富集方法：一种是使用胆固醇饱和的环糊精来富集哺乳动物组织和细胞，另一种是利用胆固醇富集的基于磷脂的分散体系（脂质体）来富集Xenopus卵母细胞。这些方法对于研究胆固醇水平升高对分子、细胞及器官功能的影响具有重要作用。...

哺乳动物组织和Xenopus卵母细胞的胆固醇富集

已有多种方法用于分析血浆脂蛋白，但超速离心法仍是目前最常用且最可靠的方法之一。本文介绍一种通过逐级密度超速离心法从血浆中分离脂蛋白的方法，并阐述如何对载脂蛋白进行分析，以用于诊断和科研目的。...

通过超速离心法分离与分析血浆脂蛋白

本文描述了测定高密度脂蛋白（HDL）从全人血浆或血清中的脂质供体颗粒特异性移除荧光磷脂量的实验方案。我们已证实，该HDL功能指标可预测心血管疾病的发生。...

高密度脂蛋白特异性磷脂外流检测法

人胶质母细胞瘤类器官切片培养模型用于研究肿瘤细胞迁移及抗侵袭药物的个体化效应

本实验方案的目的是评估抗癌药物的特异性 体外...

评估抗癌药物的特异性 体外

兔子被广泛用于研究眼内药物的药代动力学。本文介绍一种利用兔眼进行眼内药物药代动力学研究的方法。...

兔眼在眼内药物药代动力学研究中的应用

了解降血脂药物对胆固醇颗粒形态的差异化作用，使用斑块阵列方法进行体外成像分析。该研究有助于识别动脉粥样硬化的潜在生物标志物并评估药物疗效。

调节胆固醇颗粒形态的降脂药物差异效应

探索更多视频