调节胆固醇颗粒形态的降脂药物差异效应

本研究的总体目标是利用斑块阵列方法评估降脂药物对胆固醇颗粒形态特征的调节作用，并识别可用于诊断动脉粥样硬化及确定药物效应的潜在生物标志物。目前，降脂药物在调节胆固醇颗粒形成方面的作用尚不明确。本文展示了降脂药物在改变胆固醇颗粒形成的谱型及形态特征方面具有直接作用。

基于斑块阵列的体外成像方法相较于其他颗粒检测方法的主要优势在于，它能够实现对胆固醇颗粒的可视化，从而评估降脂药物在血清中的作用效果。Plaxgen 公司的实验室技术员 Jason Lundry 将演示我们如何使用化学分析仪建立斑块阵列检测。Millipore Sigma 公司的高级科学家 Raymond Kong 将演示我们如何利用成像流式细胞术进行样本处理。

最后，Plaxgen 公司的实验室技术员 David Liu 将演示胆固醇颗粒图像的数据分析。使用化学分析仪-1 建立用于胆固醇颗粒形成的斑块阵列检测。在整个检测过程中，每个孔中的最终反应体积应维持在 200 µL，并且所有检测均需设三个重复孔。

首先，向圆底、低蛋白结合力的96孔板的每个孔中加入194.5 µL磷酸盐缓冲液（PBS）。向每个孔中加入2.5 µL每种降脂药物溶液，阴性对照样品中不添加任何药物。然后，将该板置于化学分析仪-1反应板上，振荡30秒，使药物充分混匀于溶液中。

最后，向每个孔中加入两微升荧光标记的胆固醇聚集体溶液。将板置于化学分析仪-1反应板上，像之前一样振荡30秒。然后，在37摄氏度、200 rpm条件下，于实验室摇床中孵育该板2小时。

孵育后，通过成像流式细胞术获取颗粒的图像。打开数据采集模板以加载正确的仪器设置。单击“文件”，然后选择“加载模板”并选择模板文件。

单击“加载”，以准备仪器进行样本加载。当“加载样本”对话框打开时，单击“确定”将 50 微升样本加载到成像流式细胞仪中。等待直至可在成像区域实时观察到颗粒。

当成像区域内的颗粒处于良好聚焦状态时，点击“采集”按钮，以高通量方式同时获取每个物体的暗场、明场、绿色荧光和黄色荧光图像。采集完成后，点击“返回”按钮将样品归位。重复上述步骤，从每个样品中采集 5,000 至 10,000 个颗粒。

使用图像分析软件分析所有原始图像文件，以确定目标物的荧光强度和形态学变化，具体操作如文本方案所述。准备一个圆底低蛋白结合96孔板，按步骤逐次加入试剂，每孔终反应体积为200 µL。首先，设置对照孔。

向每个孔中加入193微升PBS。加入2.5%的患者血清，每孔仅加一个血清样本。然后将板置于化学分析仪反应板上，震荡30秒。

接下来，向每个孔中加入两微升荧光标记的胆固醇聚集体溶液。再次将该板置于化学分析仪-1反应板上，振荡30秒。为制备含药物的孔，向每个孔中加入191微升磷酸盐缓冲液（PBS）。

然后，每孔加入2.5%的每位患者血清，并将该反应板置于化学分析仪-1反应板上振荡30秒。除阴性对照孔外，向其余各孔中加入2微升依折麦布、洛伐他汀、辛伐他汀或烟酸溶液，每孔仅加入一种药物。

继续像之前一样震荡平板30秒。接着，在每孔中加入2 µL荧光标记的胆固醇聚集体溶液，然后再次震荡平板30秒。随后，将平板置于实验室摇床中孵育2小时，设置温度为37 °C，转速为200 rpm。

孵育后，采用与之前相同的设置，通过成像流式细胞术对样品进行检测。按照文本方案中所述，使用图像分析软件对所有图像文件进行批量处理。此处展示的是代表性结果，显示通过他汀类药物以非酶促机制诱导产生的球状和线状胆固醇颗粒的鉴定。

显示了由其他降脂药物（包括依折麦布、烟酸、贝特类药物和 omega-3 脂肪酸）诱导产生的两种不同形态的胆固醇颗粒形成的确认结果。图中所示为点图，其中 X 轴显示在绿色荧光通道中检测到的胆固醇颗粒谱。

Y轴显示侧向散射，门控显示了在荧光点图中检测到的极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白颗粒的区域。这些结果展示了降脂作用如何改变纯化的VLDL和LDL胆固醇颗粒的分布特征，在无药物、依折麦布、洛伐他汀、辛伐他汀和烟酸存在条件下的变化情况。此处展示的是对三种不同血清样本的筛查，用于识别多种降脂药物对VLDL、LDL和HDL胆固醇颗粒形成谱型调节作用的差异效应。

这些图谱表明，三种不同血清样本之间的反应水平也存在差异。对一号血清样本中在无药物存在以及在多种降脂药物作用下形成的球状和线状胆固醇颗粒进行筛选，证实了血清来源的胆固醇颗粒具有两种不同的形态，即球状和线状结构。因此，我们成功建立了一种体外成像方法，可用于识别降脂药物对胆固醇颗粒形成的影响及其临床意义。

我们的初步结果令人鼓舞，目前正利用大规模临床样本进一步验证该斑块阵列检测方法。常规血脂检测可测定血清中的低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）胆固醇水平。我们的斑块阵列检测方法有望提高动脉粥样硬化风险评估的准确性，并利用血清预测降脂药物的治疗反应。