Summary
Permite a injeção de veia cauda hidrodinâmica de vetores de integração baseada em transposon transfection estável de hepatócitos murino in vivo. Aqui, apresentamos um protocolo prático para sistemas de transfeccao que permite a longo prazo expressão constitutiva de um transgene único ou expressão constitutiva e doxiciclina-inducible combinada de um transgene ou miR-shRNA no fígado.
Abstract
Modelos de pesquisa de câncer de fígado, regeneração, inflamação e fibrose, sistemas flexíveis para a expressão do gene na vivo e silenciamento são altamente úteis. Injeção de veia cauda hidrodinâmica de construções baseadas em transposon é um método eficiente para manipulação genética dos hepatócitos em ratos adultos. Além de expressão constitutiva do transgene, este sistema pode ser usado para aplicações mais avançadas, tais como implicação de knock-down, mediada por shRNA gene do sistema CRISPR/Cas9 para induzir mutações genéticas, ou sistemas inducible. Aqui, a combinação de expressão constitutiva de CreER juntamente com expressão inducible de um transgene ou miR-shRNA de escolha é apresentado como um exemplo dessa técnica. Cobrimos o processo de várias etapa, a partir da preparação da bela adormecida-transposon constrói, a injeção e o tratamento de ratos e a preparação do tecido do fígado para análise por imunocoloração. O sistema apresentado é uma abordagem eficiente e confiável para realizar manipulações genéticas complexas nos hepatócitos. É especialmente útil em combinação com cepas de rato Cre/loxP-baseado e pode ser aplicado a uma variedade de modelos na pesquisa de doença hepática.
Introduction
Doença hepática crônica apresenta um fardo de saúde em todo o mundo1. Modelos de pesquisas com animais são ferramentas essenciais no estudo da doença hepática e ajudaram a responder questões complexas na regeneração hepática, inflamação hepática, esteatose hepática e câncer de fígado2. Um número substancial desses modelos animais depende da modificação genética das células do fígado. Portanto, ferramentas eficientes para manipular a expressão gênica em hepatócitos são úteis3. Estabelecidos métodos tais como a reprodução de linhagens geneticamente modificados do mouse ou a geração de vetores virais para a infecção do hepatócito são ou demorado, Porto preocupações de segurança, ou produzem expressão do transgene pobre em hepatócitos na vivo 4 , 5. injeção de veia de cauda hidrodinâmica (HTVI) é um método alternativo para transfeccao na vivo dos hepatócitos, permitindo a fácil, rápido e eficiente de interrogatório da função do gene no fígado. Para HTVI, um vetor carregando a sequência de DNA desejada é dissolvido em um volume de solução salina, correspondente a 10% do peso corporal do animal injetado. A solução então é injetada na veia da cauda dentro de 5-10 s6. Excedendo o débito cardíaco, o soro flui da veia cava inferior nas veias hepáticas, levando a expansão do fígado e transfection hidrodinâmico de hepatócitos7. Para conseguir a integração estável de genômica, o método foi combinado com transposon-com base em vetores, como o sistema de transposon dormir beleza. Este sistemas Medeia a recombinação de vetores de alvo com sites de recombinação genômica catalisadas por uma de8,de transposase dormir beleza -9. Para modelos de fibrose hepática ou carcinogênese, muitas vezes é desejável para genes overexpress ou silêncio em determinados pontos do tempo do modelo de doença. Para esta finalidade, ferramentas para expressão de gene inducible, tais como o sistema Cre/LoxP ou o sistema de expressão de gene tetraciclina-inducible (Tet-On) pode ser usado10.
Aqui, descrevemos um protocolo para transfeccao na vivo de hepatócitos murino usando HTVI de um sistema baseado em transposon bela adormecida . Além de um protocolo para a expressão estável, constitutiva de um transgene sob o controle de um promotor específico fígado, descrevemos um sistema mais avançado de vetor que combina expressão constitutiva da recombinase (CreER) do Cre tamoxifeno-dependente com o expressão inducible de um transgene ou microRNA-adaptado de shRNA (miR-shRNA), chamado o pTC TET-sistema11. Neste sistema de vetor, inducible transgenes ou miR-shRNAs para expressão dependente de tetraciclina são clonados no vetor coluna vertebral com um sistema de clonagem recombinational, permitindo a geração de novos vetores12rápida e fácil. Este guia em vídeo abrange a preparação de vetores apropriados, injeção e tratamento de ratos para alcançar expressão inducible do transgene/miR-shRNA e, finalmente, a preparação do tecido do fígado para análise. O método descrito neste protocolo foi projetado para permitir a combinação de qualquer sistema de rato Cre/loxP mediada com a expressão ou batida para baixo de qualquer gene de escolha, tornando-se um sistema amplamente aplicável na investigação de doença hepática.
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Protocol
Todas as experiências em animais foram realizadas de acordo com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório e foram aprovadas pelas autoridades responsáveis (Regierung von Oberbayern, Munique, Alemanha e Stanford cuidados institucionais do Animal e usar Comité, Stanford, CA, EUA). Uma lista de todos os plasmídeos de clonagem (passo 1 a 4) é fornecida na tabela complementar S1.
1. a clonagem de um Transgene para expressão gênica constitutiva
- Desenho de primers para amplificação de transgene13,14.
- Adicione restrição sites para PacI (TTAATTAA) à extremidade 5' do primer para a frente. Adicione sites de restrição para AscI (GGCGCGCC) ou FseI (GGCCGGCC) à extremidade 5' do primer reverso.
- Amplifica o transgene por PCR usando condições otimizadas para o transgene desejado14. Purifica usando um kit de purificação de DNA disponível comercialmente.
Nota: Tempo de recozimento depende os primers desenhados na etapa 1.1., tempo de alongamento depende do comprimento da construção. Por exemplo, para uma construção de 1.000 bp comprimento uso 60 s de tempo de alongamento. - Digerir o transgene e vector de expressão de gene constitutivo15 com nucleases de restrição respectiva (consulte a etapa 1.2) e buffer em um volume total de 50 µ l a 37 ° C durante a noite. Por exemplo, digerir construção com 5 unidades PacI e 5 unidades FseI se apropriado (consulte a etapa 1.2).
- Gel de purificar vetor digerido e insert usando um kit de extração do gel de comerciais de acordo com as instruções do fabricante. Execute uma ligadura padrão de 100 ng do vetor e 100 – 1.000 ng de insert usando 400 U T4 ligase a 14 ° C, durante 16 h. calor inativar a 65 ° C por 10 min.
- Transforme bactérias competentes, usando um padrão de calor-choque-protocolo16.
- Placa de ágar placas contendo ampicilina de 100 µ g/mL. Incube a 30 ° C por 24 h.
- Escolha única colônias, purificar DNA do plasmídeo usando um kit miniprep comercial de acordo com as instruções do fabricante e verificar a sequência de sequenciamento Sanger17 (cartilha de sequenciamento: 5' TGCTGGAGTTCTTCGCC 3').
- Use positivo colônias para maxi escala de amplificação do ADN do plasmídeo e purificam usando um kit preparação livre de endotoxinas plasmídeo18 de acordo com as instruções do fabricante.
- Construção está pronta para a injeção, assim, continue com o passo 5.
2. clonagem de um Transgene para expressão gênica Inducible
- Desenho de primers para amplificação de transgene13,14.
- Adicione sites de restrição para SacI (GAGCTC), SpeI (ACTAGT) ou KpnI (GGTACC) à extremidade 5' do primer para a frente. Adicione sites de restrição para NotI (GCGGCCGC) ou XhoI (CTCGAG) à extremidade 5' do primer reverso.
- Amplifica o transgene por PCR usando condições otimizadas para o transgene desejado14. Purifica a utilização de um kit de purificação de DNA comercial.
- Digerir o transgene purificado e 4 µ g do vetor de entrada (pEN_TTmcs-vetor, consulte Tabela de materiais)19 separadamente com nucleases de restrição apropriada (consulte a etapa 2.2) e buffer em um volume total de 50 µ l a 37 ° C durante a noite.
- Gel de purificar vetor digerido e insert usando um kit de extração do gel de comerciais de acordo com as instruções do fabricante. Realize a Ligadura padrão com 100 ng do vetor e 100 – 1.000 ng de insert usando 400 U T4 ligase a 14 ° C, durante 16 h. calor inativar a 65 ° C por 10 min.
- Transforme bactérias competentes, usando um padrão de calor-choque-protocolo16.
- Placa de ágar placas contendo gentamicina 15 µ g/mL. Incube a 37 ° C, durante 16 h.
- Escolha única colônias, purificar o Plasmídeo e verificar inserir por sequenciamento17 usando o primer frente pCEP: 5' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG 3'.
Nota: PCR em colônias simples pode ser realizada sem prévia purificação com pCEP primers para a frente e pCEP reversa (5' AGA AAG CTG GGT CTA GAT ATC TCG 3'). Esta etapa pode útil para pré-selecção das colônias positivas. - Prossiga para a etapa 4.
3. clonagem de um miR-shRNA para Inducible Gene Knock-down
- Projeto miR-shRNA oligonucleotides de acordo com o pSLIK protocolo19de clonagem. Recoze e purificar oligonucleotides e diluir 01:20 em ddH2O.
- Digest 3 µ g do vetor de entrada com 5 U BfuAI, a 50 ° C por 3 h, então inativar a reação a 65 ° C por 20 min.
Nota: Se for desejado co expressão da proteína verde fluorescente (GFP), uso pEN_TTGmiRc19 como um vetor de entrada, caso contrário use pEN_TTmiRc219. - Gel de purificar vetor digerido como na etapa 2.5. Realizar a Ligadura padrão de 100 ng do vetor e 1 µ l de purificado e diluído oligonucleotides shRNA (passo 3.1) usando 400 U T4 ligase em temperatura ambiente por 1 h. calor inativar a 65 ° C por 10 min.
- Transforme bactérias competentes, usando um padrão de calor-choque-protocolo16.
- Placa de ágar placas contendo gentamicina 15 µ g/mL. Incube a 37 ° C, durante 16 h.
- Escolher o única colônias, purificar o Plasmídeo e verificar inserir por Sanger sequenciamento17 (cartilha de sequenciamento: 5' TAGTCGACTAGGGATAACAG 3').
- Prossiga para a etapa 4.
4. recombinational clonagem para gerar Clones pronto-para-injeção
- Mix 150 ng do vetor de entrada (da etapa 2 ou etapa 3) e 150 ng do pTC TET-vetor20.
- Adicionar um volume total de 8 µ l tampão TE (pH = 8).
- Transfira a mistura de enzima LR-clonase II (ver Tabela de materiais) para gelo, incubar por 2 min. Vortex duas vezes.
- Adicionar 2 µ l do mix de enzima LR-clonase II para a reação e incubar a 25 ° C, durante 1 h.
- Pare a reação adicionando 1 µ l de Proteinase K-solução. Incube a 37 ° C por 10 min.
- Transforme Stbl3 bactérias competentes com 2 µ l de clonagem recombinational misturam usando um padrão de calor-choque-protocolo16.
- Placa de ágar placas contendo ampicilina de 100 µ g/mL. Incube a 30 ° C por 24 h.
- Escolher o única colônias, purificar DNA do plasmídeo usando um kit preparação livre de endotoxinas plasmídeo18 de acordo com as instruções do fabricante e confirmar a integridade do vetor por Sanger sequenciamento17 (cartilha de sequenciamento 5' AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3').
- Construção está pronta para a injeção, continue com o passo 5.
5. preparar solução injectável de veia de cauda hidrodinâmica
Nota: Preparação das construções para a expressão do gene constitutivo e inducible são descritas na etapa 1, 2, 3 e 4.
- Preparar a solução salina 0,9% estéril para injeção (que não uso PBS). Use o volume correspondente a cerca de 10% do peso do corpo do mouse. Exemplo: para um mouse com 20 g, prepare-se 2 mL de solução.
- Prepare os vetores de injeção que foram purificados usando um plasmídeo livre de endotoxinas purificação kit18 (ver passo 1.8 ou 4.8, respectivamente).
- Adicionar 10 µ g ou 15 µ g de construção de vetor livre de endotoxinas a bela adormecida (do passo 1 uso 10 µ g, da etapa 4 µ 15 g uso, respectivamente) e 1 µ g de endotoxinas-free pc-HSB521 / mL de solução salina estéril.
- Solução de armazenamento para até 4 h a 4 ° C. Não congele.
6. realizar a injeção de veia de cauda hidrodinâmica
- Use uma retenção para injeção de veia de cauda (comercial ou preparada de um tubo cónico de 50 mL com furos para respirar e para a cauda). Preencha o fundo do tubo com papel absorvente.
- Para a injeção, use ratos de cerca de 8-10 semanas de idade com pesos de 20 – 25 g.
- Pesar os ratos antes da injeção e prepare-se volume de injeção de acordo com o peso corporal (correspondentes a 10% do peso corporal, consulte a etapa 5.1). Prepare um estéril 3 mL-seringa com uma agulha G 27 para injeção e encha-a com o volume necessário.
- Coloque o mouse a retenção. Ajustar a quantidade de papel tissue (consulte a etapa 6.1) para deixar um espaço mínimo para o movimento mas espaço suficiente para respirar.
- Certifique-se de que o rato está respirando regularmente.
- Quente a cauda usando uma lâmpada infravermelha para 30-60 s. cuidadosamente atenção aos sinais de superaquecimento.
- Limpe o rabo com um algodão embebido em álcool.
- Inserir a agulha quase horizontalmente em qualquer um das duas veias laterais da cauda perto da base da cauda.
Nota: Se for colocado com êxito, uma pequena quantidade de sangue pode fluir de volta ao cone da agulha. Não é recomendável para aspirar ativamente como qualquer movimento adicional da agulha pode resultar em seu deslocamento e/ou lesão da veia. - Injete o volume total da veia da cauda dentro de 8-10 s.
- Imediatamente, remova o mouse a retenção. Comprimir a injeção ferida pelo menos 30 s ou até algum sangramento diminui.
- Coloque o mouse em uma gaiola separada. Uma vez que o mouse se recuperou do procedimento (cerca de 30 a 60 min), transferi o mouse volta para sua gaiola original. Checar o mouse regularmente para as próximas 24 horas.
Nota: A sedação leve do mouse é observada rotineiramente para até 2 h após a injeção. - Antes de prosseguir com mais experiências (ou seja, passo 7), espere 10 a 15 dias para habilitação de vetores não-integrados.
7. indução de CreER Transfectada com tamoxifeno
Atenção: O tamoxifeno é prejudicial, pode ser canceroso ou danificar a fertilidade. Por favor, consulte a ficha de dados de segurança.
- Plano de injeções intraperitoneal tamoxifeno em três dias consecutivos.
- No dia 1, dissolvem-se 10 mg de tamoxifeno em etanol a 40 µ l. Incube a 55 ° C durante 10 min. Vortex várias vezes até que se dissolva o tamoxifeno.
- Adicione o óleo de milho 960 µ l. Incubar durante 5 min. a 55 ° C. Vórtice várias vezes para obter uma solução límpida.
- Prepare a solução em uma seringa de insulina 1 mL com agulha 27G.
- Nuca o mouse, agarrando o pescoço do mouse cuidadosamente com o polegar e o segundo dedo, fixação da cauda entre a base da mão e o quarto e o quinto dedo.
- Injete 0,1 mL (= 1 mg de tamoxifeno) da solução intraperitonealmente no quadrante inferior esquerdo do abdômen.
- Repeti as injeções nos dias 2 e 3.
8. indução do Gene de tetraciclina dependente ou expressão de shRNA
Cuidado: A doxiciclina pode ser prejudicial. Por favor, consulte a ficha de dados de segurança.
Nota: Dependendo do tipo e duração do experimento, a doxiciclina pode ser fornecida em água potável (passo 8.1) ou chow (passo 8.2)
-
Para experiências de curto prazo (< 10 dias) administrar doxiciclina através da água potável, utilizando o seguinte protocolo.
- Dissolva sacarose 5 g em 100 mL de água da torneira. Autoclave.
- Dissolva 100 mg de doxiciclina-hyclate em 5 mL de solução de sacarose (etapa 8.1.1) em um tubo cônico de 15 mL.
- Utilizando uma seringa de 10 mL, estéril filtrar a solução através de um filtro de 0,2 µm. Adicione a solução de sacarose, preparada na etapa 8.1.1.
- Fornecer a solução de sacarose-doxiciclina como água potável para o mouse. Verifique diariamente e substituir quando a solução torna-se turva, indicando o overgrowth bacteriano (substituir a solução clara depois de três dias no máximo).
- Para experimentos de longo prazo (> 10 dias) ou experimentos sensíveis a mudanças metabólicas, usar doxiciclina-chow comercial (por exemplo, Doxycycline Hyclate Chow 0,625 g/kg) para evitar a desidratação e/ou alterações induzidas pelo sacarose em fígados de animais tratados.
9. preparação do fígado de rato para análise por imunocoloração
Cuidado: Paraformaldehyde pode ser prejudicial. Por favor, consulte a ficha de dados de segurança.
Nota: O commit quando ratos serão analisados varia de acordo com o experimento. Recomenda-se analisar o tecido hepático após não menos de três dias de tratamento doxiciclina para garantir suficiente da indução da expressão do transgene ou shRNA.
- Prepare uma seringa de 1 mL com agulha 27G com 1 mL de solução de paraformaldeído 4% (PFA).
- Eutanásia o mouse por um método adequado de acordo com um protocolo aprovado do animal.
Nota: Diretrizes para métodos adequados de eutanásia podem variar dependendo da instituição. - Usando dissecação tesoura e pinça anatômica, abra cuidadosamente a cavidade abdominal com uma laparotomia mediana para expor o fígado. Mova o intestino delgado para o direito de expor a veia porta e a veia cava inferior (VCI).
- Insira a agulha da seringa preparada (ver passo 9.1) na veia cava inferior e corte a veia porta. 1 mL de PFA lentamente injete a veia cava inferior para perfundir o tecido do fígado e remover autofluorescente células vermelhas do sangue (desejáveis se coloração imunofluorescente será executada).
- Remova o fígado. Enxaguar em água e transferir para 5 a 10 mL de solução PFA 4%.
- Para cortes de parafina, tecido de correção para 36-48 h tecido está pronto para desidratação e incorporação de parafina.
-
Para seções congeladas, fixe o tecido em 4% PFA por 1h.
- Por cryoprotection, transferência para a solução de sacarose a 10%. Incube 60 min.
- Transferir a solução de sacarose 20%. Incube 60 min.
- Transferir a solução de sacarose de 30%. Incubar 12 – 16 h. Embed em incorporação composto por seções congeladas e congelar a-20 ° C.
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Representative Results
Eficácia transfection por injeção de veia de cauda hidrodinâmica: A porcentagem de hepatócitos murino que são transfectadas direccionado por uma única injeção é variável e depende de vários parâmetros tais como o volume de injeção, tempo de injeção, quantidade de DNA injetado e tamanho da construção injetado6, 22,23. Além disso, a eficiência de transfeccao é geralmente mais baixa em animais maiores, onde um maior diâmetro vascular, bem como maior área sinusoidal conduz a uma diminuição na pressão total. Para visualizar a eficiência de transfeccao, HTVI de uma construção de transposon CreER foi realizado em ratos, abrigando um gene repórter de Rosa26mTmG seguido por ativação mediada por tamoxifeno da construção de CreER. Injeção de baixo volume ou tempo de injeção prolongada para razões técnicas resultados em eficiência de transfeccao reduzida com apenas alguns transfectadas hepatócitos detectáveis no fígado inteiro, enquanto condições de injeção ideal resultam em maior do transfection eficiência como descrito pelo repórter coloração após HTVI de um transposon CreER (figura 1A). Para avaliar a eficácia de transfeccao, imunocoloração do transgene transfectado ou – como no caso de CreER - de um gene repórter apropriado é altamente recomendada. Alternativamente, eficiência de transfeccao pode ser estimada a partir da análise da expressão do mRNA do transgene transfectado.
Transfeccao de hepatócitos pericentral: Após a injeção hidrodinâmica, um gradiente de pressão ao longo do espaço sinusoidal - onde a pressão é maior próximo a veia central e menor no areal a periportal - poderia levar a transfeccao preferencial na área pericentral. Analisamos os fígados com uma baixa percentagem de hepatócitos transgene-expressando e avaliado sua posição relativa no lóbulo do fígado por co-imunocoloração para glutamina sintetase (GS), um marcador para pericentral hepatócitos. Curiosamente, a maioria dos hepatócitos que mostrou a repórter expressão gênica depois HTVI de uma construção de CreER agrupado em torno da veia central mas não portal área (figura 1B) indicando uma eficiência mais elevada do transfection em torno da veia central.
Na vivo após HTVI de um transposon luciferase de imagem: Para avaliar se a integração de cópia única observada depois HTVI de transposon constrói24 é suficiente para na vivo por imagens, injetamos uma construção de transposon abrigando uma gaveta de expressão do luciferase sob o controle de um fígado específico construção de promotor. Os ratos foram injetados com a luciferina e fotografaram usando um na vivo sistema de imagem de duas semanas após HTVI (Figura 2A). Imagem latente mostrou bioluminescência luciferase robusto e estável no fígado 15 dias após a injeção e nos pontos de tempo posteriores (Figura 2B e dados não mostrados). Esses resultados mostram que o sistema pode ser usado com sucesso para seguir a presença de células transfectadas em vivo por imagens de bioluminescência.
Combinada CreER e expressão inducible do transgene ou shRNA: Que anteriormente gerada uma construção de transposon que combina a expressão constitutiva de um inducible Cre recombinase (CreER) com expressão inducible de um transgene ou um shRNA de escolha20 (Figura 3A). Injeção dessa construção no Rosa26mTmG-repórter ratos e ativação de CreER por tamoxifeno mostrou robusto expressão do gene repórter comparável aos resultados obtidos com uma construção de transposon para expressão do transgene único ( Figura 3B). Após o tratamento de doxiciclina, expressão inducible do transgene pode ser visualizado por anticorpos adequados nos hepatócitos transfectados (Figura 3). Para expressão inducible shRNA, recomenda-se o uso de um construto shRNA-GFP como expressão de GFP citoplasmática detectado por imunocoloração pode ser usado como um marcador substituto para expressão de shRNA (Figura 3D). Digno de nota, expressão do transgene ou shRNA, respectivamente, só é detectável em um subconjunto dos hepatócitos, que pode ser devido ao nível relativamente elevado de expressão de proteínas necessária para a deteção por imunocoloração20.
Figura 1: Transfection dos hepatócitos por HTVI. (A) eficiência de transfeccao variável após HTVI de um transposon-CreER em camundongos abrigando um Rosa26mTmG / + repórter e seguido pelo tratamento com tamoxifen. Transfectadas hepatócitos são positivos para membrana-limite proteína verde fluorescente (GFP, verde). (B) co mancha para CreER ativado hepatócitos (verdes) em camundongos, abrigando um repórter Rosa26mTmG com a veia central marcador glutamina sintetase (GS, vermelho). Aqui PV: veia porta, CV: veia central. Barras de escala representam 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: In vivo por imagens do luciferase. (A) Transposon construir contendo uma gaveta de expressão do luciferase (não desenhada por escala). Esquema de tratamento e injeção para visualização da expressão hepática do luciferase. SB: dormindo sites de reconhecimento de beleza, HTVI: injeção de veia de cauda hidrodinâmica. (B) imagem representativa da bioluminescência luciferase hepática 15 dias após HTVI de uma construção do transposon-luciferase juntamente com pHSB5 usando um na vivo sistema de imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: CreER e expressão de gene/shRNA inducible combinados. (A) construção de Transposon para expressão de inducible Cre recombinase, juntamente com a expressão de shRNA ou tetraciclina-inducible do transgene (pTC Tet), nem desenhada em escala. (B) coloração de membrana verde indica hepatócitos transfectados após a injeção do pTC construção Tet em Rosa26mTmG / + repórter ratos e ativação de CreER com tamoxifeno. Barra de escala representa a expressão gênica Inducible-100 µm. (C) 5 dias após o tratamento de doxiciclina pode ser visualizado por imunocoloração para o transgene (YAP, vermelho) em hepatócitos transfectados. Expressão de Inducible miR-shRNA (D) 5 dias após o tratamento de doxiciclina indicado pelo citoplasmática proteína verde fluorescente (GFP) coloração da construção de shRNA de GFP. Transfectadas hepatócitos são retratados por membrana-limite GFP. Redimensionar barras em C) e D) representam 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Transfecção de hepatócitos com injeção de veia de cauda hidrodinâmica tornou-se um método estabelecido desde a sua introdução há mais de 15 anos6. O volume injetado excede o débito cardíaco e flui da veia cava inferior para os sinusoides do fígado7, levando a transfeccao de cerca de 10-20%, em alguns casos até 40% dos hepatócitos25,26. Preditores de um bem sucedida do transfection são o volume injetado por vez injetado22,23. Portanto, uma eficiência de transfeccao baixa (figura 1A, painel esquerdo) é geralmente devido a incapacidade de manter a velocidade de injeção durante o procedimento de7. No entanto, mesmo com uma técnica ideal, a eficiência de transfeccao que pode ser alcançada pela HTVI permanecerá abaixo da taxa obtida por infecção viral com adenovírus ou vírus adeno-associado que podem chegar a quase 100%5,27 . Para atingir a injeções de veia de cauda bem sucedido, é fundamental para garantir um posicionamento estável da agulha no vaso sanguíneo. Isso é facilmente conseguido nas veias com diâmetro maior mais próximo à base da cauda. Além disso, a dilatação da veia por aquecer a cauda é altamente recomendada. Os melhores resultados são obtidos usando uma lâmpada infravermelha, mas uma lâmpada de calor não-infravermelha ou imersão da cauda em água quente também pode ser usado. Em alguns casos, completando até 200 µ l de soro por injeção intraperitoneal de cerca de 30 minutos antes de HTVI irá melhorar o status de hidratação dos animais resultando na dilatação dos vasos sanguíneos. Para manter uma velocidade constante de injeção, a cauda do mouse deve ser completamente imobilizada para evitar qualquer movimento da cauda, que pode resultar no deslocamento da agulha. Para fins de validação, nós sugerimos o uso de uma construção que pode ser detectada por imunocoloração. Alternativamente, eficácia de transfeccao pode ser estimada pela análise da expressão do mRNA ou integrado de sequenciamento de DNA28.
Nossos dados indicam que a integração transposon de preferência é observada na área pericentral do lóbulo do fígado. O transfection predominante dos hepatócitos ao redor da veia central é provavelmente devido a hemodinâmica exclusiva de HTVI como também é observada em transfecção com base não-transposon29. Essa descoberta pode ser relevante para algumas aplicações, tais como a indução de lesão hepática aguda por CCl4, que afeta principalmente pericentral hepatócitos. No contexto da eficiência baixa transfeccao, CCl4 tratamento, portanto, poderia levar a redução significativa do número de hepatócitos transfectados. Além disso, HTVI é de uso limitado para células-alvo periportal incluindo de células do ducto biliar15.
Além de sistemas que utilizam HTVI das construções de transposon para alcançar expressão estável de um transgene único, apresentamos recentemente um sistema que permite a expressão co de CreER e inducible expressão de um gene ou um miR-shRNA de um único vetor11 . Este sistema é especialmente útil para interrogar genes específicos em cepas de rato Cre/LoxP-baseado. Como construções de transgenes ou shRNA são introduzidas por um procedimento de clonagem recombinational rápido e confiável, o sistema pode ser facilmente adaptado para a seleção de abordagens. O sistema do vetor Medeia expressão inducible confiável na vivo que é totalmente dependente da entrega de doxiciclina11,30. Este guia prático baseado em vídeo fornece instruções passo a passo de clonagem de vetores apropriados sobre a indução da expressão do gene para análise do tecido do fígado.
No entanto, para garantir a eficiência do sistema, vários aspectos devem ser mantidos em mente: para manter a expressão de longo prazo, integração de genômica é mediada no TA-sites pela bela adormecida transposase8,11. Desde que a eficiência de integração é dependente do tamanho do transposon, é importante manter o tamanho da construção do transgene em mente ao projetar o vetor31. Além disso, a eficiência de expressão do gene inducible produto no fígado é dependente o promotor rtTA311. Para obter resultados de expressão ideal, use de uma construção de vetor com um fígado ApoE.HCR.hAAT-promotor específico é recomendado (Addgene #85578), como mostra a eficiência a mais elevada em uma comparação de três promotores11. Com uma construção de promotor otimizado, expressão inducible do transgene/shRNA pode ser detectado por imunocoloração em até 30% de células transfectadas20. Se os níveis de proteína inducible existem abaixo de um certo limite que é necessário para a deteção por imunocoloração, isso precisa ser determinado. Importante, nenhuma expressão do transgene/shRNA pode ser detectado por imunocoloração nos ratos que não foram tratados com doxiciclina. Por último, a expressão dos genes sob o controle do elemento de resposta de tetraciclina (TRE) é dependente da dose de doxiciclina32,33. Para experimentos de curto prazo, administração de doxiciclina através da água potável é bem estabelecida34,35. Sacarose é geralmente adicionado para dar um gosto melhor. No entanto, isso pode levar a polidipsia e desidratação, e o uso de chow doxiciclina é altamente recomendado para longo prazo experimentos36,37.
Em resumo, injeção de veia de cauda hidrodinâmica é um método amplamente estabelecida na investigação hepática. Seu varia de aplicação de estudos de hepatite B para fígado fibrose ou hepatocelular carcinoma modelos38,39,40,41. O sistema descrito neste manuscrito é especialmente útil no interrogatório de genes alvo específico em modelos baseados em Cre/LoxP, de doença hepática. Além disso, superexpressão do fígado também pode ser usado para pesquisa de doenças hematológicas42,43 ou abordar questões imunológicas44,45. Além da análise dos genes específicos de interesse, o sistema apresentado pode também ser facilmente adaptado para triagem ou multiplexação abordagens. Este guia em vídeo, portanto, será útil para uma grande comunidade de pesquisadores.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Krebshilfe, Alemanha (número de concessão 111289 a UE), a Lucile Packard Foundation para a saúde das crianças (Ernest e Amelia Gallo dotado Postdoctoral Fellowship - número de concessão CTSA UL1 RR025744 a UE). Agradecemos o Dr Mark A. Kay para construções de vetor e suporte experimental conselhos e Dr Julien Sage para ratos e experimental.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Material | |||
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | #SM1331 | DNA ladder for electrophoresis |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | embedding of cryo-sections |
| Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | For sweetening of the doxycyline solution |
| Ampicillin Sodium Salt | AppliChem | A0839,0010 | For selection of Amp-resistant clones |
| LB Agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | |
| LB Broth (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | |
| S.O.C. Medium | Thermo Fischer | 15544034 | |
| Gentamicin sulfate | AppliChem | A1492,0001 | For selection of Gentamicin-resistant clones |
| Roti-Histofix 4 % | Fa. Roth | P087.6 | para-formaldehyde solution |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K |
| DB3.1 Competent Cells | Thermo Fisher | 11782-018 | |
| Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction Enzymes | |||
| PacI | New England BioLabs | R0547S | |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| FseI | New England BioLabs | R0588S | |
| SacI | New England BioLabs | R0156S | |
| SpeI | New England BioLabs | R0133S | |
| KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
| NotI | New England BioLabs | R0189S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| BfuAI | New England BioLabs | R0701S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For DNA Extraction from gel |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean Up | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
| NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | Plasmid extraction (Mini prep) |
| NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | Plasmid extraction (Maxi prep) |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F530S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for Mouse Experiments | |||
| Injekt Syringe F 1 ml | Braun | 9166017V | For intraperitoneal injection |
| Omnifix Luer 3 ml | Braun | 4616025V | For intravenous injection |
| Sterican Cannula 24G | Braun | 4657675 | |
| Sterican Cannula 27G | Braun | 4657705 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | For CreER activation |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | Carrier for tamoxifen injections |
| Doxycycline hyclate | AppliChem | A2951,0025 | Activation of tetracycline-dependent expression |
| Injekt 10 ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | For filtration of doxycycline |
| NaCl 0,9% | Braun | 3200905 | Carrier for intravenous injections |
| Falcon Conical Tube 50ml | Corning Life Science | 352095 | |
| Infrared Lamp | N/A | N/A | For warming of mouse tail |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI. | |||
| pTC | n/a | Vector for constitutive gene expression, ref. 15 | |
| pEN_TTmcs | Addgene #25755 | Entry vector for inducible gene expression, ref. 19 | |
| pEN_TTGmiRc2 | Addgene #25753 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11 | |
| pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11 |
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