本文介绍了一种涉及单核细胞靶向肽两亲性分子胶束的合成与表征方法，以及用于检测该胶束生物相容性和与单核细胞结合能力的相应实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
动脉粥样硬化是心血管疾病的主要成因，而心血管疾病是全球首要死因，每年导致1730万人死亡。动脉粥样硬化也是猝死和心肌梗死的主要原因，其由不稳定的斑块破裂并突然阻塞血管所引发。目前的成像技术无法区分稳定斑块与易破裂的不稳定斑块。肽两亲性胶束（PAMs）可克服这一局限，因其可被修饰多种靶向基团，特异性结合病变组织。研究表明，单核细胞是动脉粥样硬化的早期标志物，大量单核细胞聚集与易破裂斑块相关。因此，靶向单核细胞的纳米颗粒可用于区分动脉粥样硬化的不同阶段。为此，本文描述了一种靶向单核细胞的PAMs（单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）PAMs）的制备方案。MCP-1 PAMs在温和条件下合成并自组装形成直径约15 nm、表面电荷接近中性的纳米颗粒。 体外, PAMs 具有良好的生物相容性，并对单核细胞具有高结合亲和力。本文所述方法在动脉粥样硬化及其他炎症性疾病的一系列应用中展现出良好前景。
引言
心血管疾病仍然是全球主要的死亡原因， worldwide每年约有1730万人死于心血管疾病1。心血管疾病的发生与动脉粥样硬化有关，这是一种动脉内斑块积聚的病理状态，会阻碍血液和氧气向身体细胞的输送2,3。动脉粥样硬化的发展过程涉及动脉的增厚与硬化，由炎症反应、脂质代谢紊乱以及斑块积聚共同驱动，最终可能导致斑块破裂和心肌梗死4,5。内皮细胞表达多种细胞因子和黏附分子，其中包括单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1），后者可与单核细胞表面的C-C趋化因子受体（CCR2）结合6,7,8。在斑块形成的早期阶段，氧化型胆固醇促使单核细胞转化为巨噬细胞，从而放大局部的炎症反应，导致组织损伤，并形成不稳定或易损斑块9,10。
传统上，动脉粥样硬化通过血管造影或超声等解剖成像技术评估管腔狭窄程度来判断
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方案
注意：请阅读试剂的材料安全数据表（MSDS），并遵守所在机构规定的全部化学品安全措施。
1. MCP-1 巨噬细胞活化肽的制备
- MCP-1 肽的制备
- 称取0.25 mmol Fmoc-L-Lys(Boc)-Wang于反应瓶（RV）中。在通风橱内，用5 mL二甲基甲酰胺（DMF）冲洗反应瓶内壁。
- 将RV装载到自动台式多肽合成仪上。从C端到N端依次装载预包装的氨基酸小瓶：N'-CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS-C'。在最后添加一个空瓶，用于最终的脱保护步骤。
注意：也可使用相同方案合成序列为 N'-CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK-C' 的乱序肽。 - 合成完成后，将反应瓶中的树脂肽用2-3 mL甲醇转移至闪烁瓶中，确保所有树脂均被转移。待树脂沉降至瓶底后，吸除甲醇上清液，并将残留液体蒸发至干燥。再于室温下真空干燥2小时或过夜。
- 在通风橱中配制 12 mL 裂解液，其中三氟乙酸（TFA）: 乙二硫醇 : 水 : 三异丙基硅烷的体积比为 94 : 2.5 : 2.5 : 1。轻轻旋动混合裂解液，确保其充分混匀。
注意：由于三异丙基硅烷和乙二硫醇对空气敏感，在将三异丙基硅烷和乙二硫醇的储备瓶重新盖紧前，需用氩气吹扫1分钟。 - 将合成容器（SV）夹在振荡器臂上，....
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结果
MCP-1 PAM 的制备
将 MCP-1 蛋白的 CCR2 结合基序（氨基酸残基 13-35）[YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] 或随机肽段 [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] 在 N 末端添加一个半胱氨酸残基进行修饰。采用 Fmoc 介导的固相合成法，使用自动多肽合成仪合成 MCP-1 肽段。粗产物通过 C8 柱反相高效液相色谱（HPLC）在 50 °C 条件下，以含 0.1% 三氟乙酸（TFA）的乙腈/水混合液进行纯化，并通过基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱进行表征（图 1）。含半胱氨酸的肽段通过硫醚键与 DSPE-PEG2000-马来酰亚胺偶联，生成 DSPE-PEG(2000)-肽段偶联物。室温反应 24 小时后，粗产物通过 HPLC 进行纯化（图 2）。DSPE-PEG(2000)-Cy5 通过 NHS 酯反应合成。将 DSPE-PEG(2000)-MCP-1 与 .......
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讨论
MCP-1 PAM 是一种前景广阔的分子成像平台，由亲水性靶向肽和驱动纳米颗粒自组装特性的疏水性尾部组成。这种靶向单核细胞的胶束可通过简单的合成与纯化步骤制备 MCP-1 肽和 DSPE-PEG(2000)-MCP-1。PAM 具有多种适用于体内分子成像的优良特性，例如可在温和条件下自组装、具有内在的可生物降解性，以及结构和化学多样性，从而能够整合其他成像基团或靶向肽，实现向特定目标部位的选择性递送。通过改变肽段、疏水性尾部或胶束浓度，可调节其粒径、形状和组成，从而为多种应用提供最优的化学和物理性质22,33。
本方案存在一些局限性，需予以说明。首先，由于PAMs依赖疏水相互作用驱动，因此必须构建亲水性的靶向肽，以使靶向部分能够暴露于胶束表面。如果肽序列本身具有疏水性，可在C端添加一至两个亲水性氨基酸进行调整，但氨基酸的添加可能影响肽在胶束内部的二级结构，从而改变其在天然蛋白状态下的性质44.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢南加州大学、国家心肺血液研究所（NHLBI，项目编号R00HL124279）、Eli和Edythe Broad创新奖以及授予EJC的L.K. Whittier基金会非癌症转化研究奖所提供的经费支持。作者感谢南加州大学电子显微镜与微分析中心、纳米生物物理学卓越中心、分子表征卓越中心以及转化成像中心在仪器设备方面的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,2-乙二硫醇 | VWR | E0032 | 用于多肽合成 |
| 10 mL 一次性血清移液管 | VWR | 89130-898 | 用于细胞培养 |
| 15 mL 聚丙烯离心管 | VWR | 89401-566 | 用于多种应用 |
| 2,5-二羟基苯甲酸，99% | 赛默飞世尔科技 | AC165200050 | 用于基质辅助激光解吸电离（MALDI） |
| 25 mL 一次性血清移液管 | VWR | 89130-900 | 用于细胞培养 |
| 2-巯基乙醇，50 mM | 赛默飞世尔科技 | 31350010 | 用于细胞培养 |
| 5 mL 一次性血清移液管 | VWR | 89130-896 | 用于细胞培养 |
| 50 mL 离心管 | VWR | 89039-658 | 用于多种应用 |
| 75 cm² 培养瓶 | 赛默飞世尔科技 | 13-680-65 | 用于细胞培养 |
| 75 mL 反应容器 | Protein Technologies | 3000005 | 用于多肽合成 |
| 96 孔细胞培养板 | VWR | 40101-346 | 用于 MTS 检测 |
| 乙腈，HPLC 级 | 赛默飞世尔科技 | A998SK-4 | 用于 HPLC 纯化 |
| 硼硅酸盐玻璃，1 dram | VWR | 66011-041 | 用于 PAM 合成 |
| 长尖头硼硅酸盐玻璃移液管 | VWR | 14673-043 | 用于多种应用 |
| 盖玻片，0.16–0.19 mm，22 × 22 mm | 赛默飞世尔科技 | 12-542B | 用于共聚焦显微镜 |
| Cy5 胺 | Abcam | ab146463 | 用于多肽偶联 |
| 乙醚，ACS 级 | 赛默飞世尔科技 | E138-1 | 用于多肽沉淀 |
| 一次性注射器，20 mL | 赛默飞世尔科技 | 14-817-54 | 用于 HPLC 纯化 |
| 双纽鲍计数板 | VWR | 63510-13 | 用于细胞计数 |
| DSPE-PEG(2000) 胺 | Avanti | 880128P | 用于多肽偶联 |
| DSPE-PEG(2000) 马来酰亚胺 | Avanti | 880126P | 用于多肽偶联 |
| DSPE-PEG(2000)-NHS 酯 | Nanocs | PG2-DSNS-10K | 用于与 Cy5 偶联 |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基-高葡萄糖 | 西格玛奥德里奇 | D5796-500ML | 用于细胞培养 |
| 胎牛血清，经鉴定，热灭活 | 赛默飞世尔科技 | 10438026 | 用于细胞培养 |
| Fmoc-L-Ala-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-A | 用于多肽合成 |
| Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-RBF | 用于多肽合成 |
| Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-NT | 用于多肽合成 |
| Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-CT | 用于多肽合成 |
| Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-QT | 用于多肽合成 |
| Fmoc-L-Ile-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-I | 用于多肽合成 |
| Fmoc-L-Leu-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-L | 用于多肽合成 |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-KBC | 用于多肽合成 |
| Fmoc-L-Phe-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-F | 用于多肽合成 |
| Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-SB | 用于多肽合成 |
| Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-TB | 用于多肽合成 |
| Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-YB | 用于多肽合成 |
| Fmoc-L-Val-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-V | 用于多肽合成 |
| Fmoc-Lys(Boc)-Wang 树脂，100–200 目 | Novabiochem | 856013 | 用于多肽合成 |
| 甲酸，Optima LC/MS 级 | 赛默飞世尔科技 | A117-50 | 用于 HPLC 纯化 |
| 甘油 | VWR | M152-1L | 用于共聚焦显微镜 |
| 手动计数器 | 赛默飞世尔科技 | S90189 | 用于细胞计数 |
| 磁力搅拌子，卵形 | VWR | 58949-006 | 用于多肽偶联 |
| 甲醇，ACS 认证级 | 赛默飞世尔科技 | A412-4 | 用于 PAM 合成 |
| MTS 细胞增殖比色法检测试剂盒 | VWR | 10191-104 | 用于 MTS 检测 |
| N,N-二甲基甲酰胺，测序级 | 赛默飞世尔科技 | BP1160-4 | 用于多肽合成 |
| N-甲基吗啉 | Protein Technologies | S-1L-NMM | 用于多肽合成 |
| 多聚甲醛 | 赛默飞世尔科技 | AC416780250 | 用于固定细胞 |
| PBS，pH 7.4 | 赛默飞世尔科技 | 10010049 | 用于多种应用 |
| 青霉素/链霉素，10,000 U/mL | 赛默飞世尔科技 | 15140122 | 用于细胞培养 |
| 多肽合成容器，25 mL | 赛默飞世尔科技 | CG186011 | 用于多肽合成 |
| 磷钨酸 | 赛默飞世尔科技 | A248-25 | 用于透射电子显微镜（TEM） |
| 哌啶 | Spectrum | P1146-2.5LTGL | 用于多肽合成 |
| 普通载玻片，75 × 25 mm | 赛默飞世尔科技 | 12-550-A3 | 用于共聚焦显微镜 |
| 无菌试剂储液槽 | VWR | 95128093 | 用于细胞培养 |
| 自闭合镊子 | TedPella | 515 | 用于透射电子显微镜（TEM） |
| TEM 支持膜 | TedPella | 01814F | 用于透射电子显微镜（TEM） |
| 三氟乙酸 | 赛默飞世尔科技 | BP618-500 | 用于多肽裂解和 HPLC 纯化 |
| 三异丙基硅烷 | VWR | TCT1533-5ml | 用于多肽裂解 |
| 台盼蓝溶液，0.4% | 赛默飞世尔科技 | 15250061 | 用于细胞计数 |
| 通用锯齿镊 | VWR | 231-SA-SE | 用于共聚焦显微镜 |
| WEHI-274.1 | ATCC | ATCC CRL-1679 | 小鼠单核细胞 |
| 自动化台式多肽合成仪 | Protein Technologies | PS3 台式多肽合成仪 | |
| α-氰基-4-羟基肉桂酸，99% | 西格玛奥德里奇 | 476870-2G | 用于基质辅助激光解吸电离（MALDI） |
参考文献
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
- Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12....
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