需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

用于动脉粥样硬化成像的靶向单核细胞肽两亲性胶束的合成

7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/56625

⸱

2017年11月17日

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Southern California

本文内容

摘要

本文介绍了一种涉及单核细胞靶向肽两亲性分子胶束的合成与表征方法，以及用于检测该胶束生物相容性和与单核细胞结合能力的相应实验方案。

摘要

动脉粥样硬化是心血管疾病的主要成因，而心血管疾病是全球首要死因，每年导致1730万人死亡。动脉粥样硬化也是猝死和心肌梗死的主要原因，其由不稳定的斑块破裂并突然阻塞血管所引发。目前的成像技术无法区分稳定斑块与易破裂的不稳定斑块。肽两亲性胶束（PAMs）可克服这一局限，因其可被修饰多种靶向基团，特异性结合病变组织。研究表明，单核细胞是动脉粥样硬化的早期标志物，大量单核细胞聚集与易破裂斑块相关。因此，靶向单核细胞的纳米颗粒可用于区分动脉粥样硬化的不同阶段。为此，本文描述了一种靶向单核细胞的PAMs（单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）PAMs）的制备方案。MCP-1 PAMs在温和条件下合成并自组装形成直径约15 nm、表面电荷接近中性的纳米颗粒。 体外, PAMs 具有良好的生物相容性，并对单核细胞具有高结合亲和力。本文所述方法在动脉粥样硬化及其他炎症性疾病的一系列应用中展现出良好前景。

引言

心血管疾病仍然是全球主要的死亡原因， worldwide每年约有1730万人死于心血管疾病1。心血管疾病的发生与动脉粥样硬化有关，这是一种动脉内斑块积聚的病理状态，会阻碍血液和氧气向身体细胞的输送2,3。动脉粥样硬化的发展过程涉及动脉的增厚与硬化，由炎症反应、脂质代谢紊乱以及斑块积聚共同驱动，最终可能导致斑块破裂和心肌梗死4,5。内皮细胞表达多种细胞因子和黏附分子，其中包括单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1），后者可与单核细胞表面的C-C趋化因子受体（CCR2）结合6,7,8。在斑块形成的早期阶段，氧化型胆固醇促使单核细胞转化为巨噬细胞，从而放大局部的炎症反应，导致组织损伤，并形成不稳定或易损斑块9,10。

传统上，动脉粥样硬化通过血管造影或超声等解剖成像技术评估管腔狭窄程度来判断11,12。然而，这些方法仅能检测动脉壁的严重狭窄，无法识别动脉粥样硬化的早期阶段，因为早期斑块生长会引发动脉重塑，以维持血管直径和血流速度12,13,14。因此，血管造影会低估动脉粥样硬化的实际患病率。此外，近年来单光子发射计算机断层扫描、正电子发射断层扫描和磁共振成像等非侵入性成像技术已被用于表征斑块形态，因其可提供斑块的初步细节和特征信息。然而，这些成像方式常受限于灵敏度不足、空间分辨率较低，或需要使用电离辐射，使得在不同阶段对斑块进展进行成像更加困难15,16,17。目前仍缺乏一种能够特异性识别动脉粥样硬化各阶段斑块的成像递送系统。

纳米颗粒已显示出成为一种新兴平台的潜力 体内 斑块靶向与诊断18,19,20,21特别是，PAMs 因其化学多样性以及能够容纳多种基团、组成、尺寸、形状和表面功能化而具有优势22. 肽两亲分子（PAs）由亲水性肽段和疏水性尾部组成 "头部基团" 连接疏水性尾链，通常为脂质；这种两亲性结构赋予其自组装能力，并可在颗粒表面多价展示肽段22,23,24肽的头部基团可通过肽之间的折叠和氢键作用影响颗粒的形状25已发现通过β-折叠相互作用折叠的肽可形成棒状胶束，而α-螺旋构象则可形成球形和棒状胶束22,23,24,25,26,27在亲水性肽段与PAMs的疏水性尾部之间可引入聚乙二醇（PEG）连接臂，以屏蔽肽段表面电荷，从而增强纳米颗粒在体循环中的可利用性28,29,30,31PAMs 的优势还在于其具有生物相容性，并已证明具有广泛的应用范围32,33胶束的水溶性相较于其他基于纳米颗粒的系统具有优势，例如某些不溶于水的聚合物纳米颗粒，后者必须悬浮在增溶剂中才能用于注射34此外，由于能够制备出在特定刺激下发生解离的PAMs，使其成为可控的细胞内药物递送的理想候选载体35.

通过与CCR2受体结合并在主动脉弓中聚集，PAMs既往已被开发用于靶向单核细胞，以监测主动脉中动脉粥样硬化病变的不同阶段9。在ApoE-/-小鼠中，单核细胞的聚集程度与斑块进展呈正比36。此外，研究发现，具有易破裂的晚期斑块的患者体内单核细胞含量更高37。因此，将PAMs进行修饰以整合MCP-1具有重要意义，因为它能够提高靶向特异性，并区分动脉粥样硬化的早期与晚期病变。这些概念验证研究还证实，PAMs具有足够的安全性可用于临床前研究，并可通过肾脏清除38。由于单核细胞浸润和炎症反应也存在于其他多种疾病中，MCP-1 PAMs有望被应用于动脉粥样硬化以外其他疾病的治疗与诊断8,39,40,41。

本文报道了一种高度可扩展且自组装的 MCP-1 PAMs 的制备方法，该颗粒在动脉粥样硬化成像应用中表现出最佳的粒径、表面电荷以及对单核细胞的特异性靶向能力。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

注意：请阅读试剂的材料安全数据表（MSDS），并遵守所在机构规定的全部化学品安全措施。

1. MCP-1 巨噬细胞活化肽的制备

  1. MCP-1 肽的制备
    1. 称取0.25 mmol Fmoc-L-Lys(Boc)-Wang于反应瓶（RV）中。在通风橱内，用5 mL二甲基甲酰胺（DMF）冲洗反应瓶内壁。
    2. 将RV装载到自动台式多肽合成仪上。从C端到N端依次装载预包装的氨基酸小瓶：N'-CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS-C'。在最后添加一个空瓶，用于最终的脱保护步骤。
      注意：也可使用相同方案合成序列为 N'-CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK-C' 的乱序肽。
    3. 合成完成后，将反应瓶中的树脂肽用2-3 mL甲醇转移至闪烁瓶中，确保所有树脂均被转移。待树脂沉降至瓶底后，吸除甲醇上清液，并将残留液体蒸发至干燥。再于室温下真空干燥2小时或过夜。
    4. 在通风橱中配制 12 mL 裂解液，其中三氟乙酸（TFA）: 乙二硫醇 : 水 : 三异丙基硅烷的体积比为 94 : 2.5 : 2.5 : 1。轻轻旋动混合裂解液，确保其充分混匀。
      注意：由于三异丙基硅烷和乙二硫醇对空气敏感，在将三异丙基硅烷和乙二硫醇的储备瓶重新盖紧前，需用氩气吹扫1分钟。
    5. 将合成容器（SV）夹在振荡器臂上，夹持位置靠近SV的下半部分。用2 mL裂解液将肽树脂转移至SV中，确保所有肽树脂均被转移。
    6. 用3 mL裂解液冲洗SV管壁。盖紧SV管盖，以300次/分钟振荡反应4小时。
    7. 称量一个空的50 mL离心管，记录质量。
    8. 孵育4小时后，将SV柱中的裂解肽溶液收集至50 mL离心管中。用剩余的裂解液多次冲洗SV柱。
    9. 用氮气吹干离心管中的裂解肽溶液，直至剩余体积少于4 mL。
    10. 向肽段裂解液中加入36 mL预冷的乙醚。
    11. 将溶液涡旋振荡至完全呈白色或黄色。在 4 °C 条件下以 3,000 x g 离心 5 分钟，倾去上清液。
    12. 加入40 mL预冷的乙醚至试管中。涡旋振荡并再次超声处理。重复离心步骤。倾去上清液。
    13. 用氮气吹扫粗PA沉淀，直至乙醚完全挥发。
    14. 加入20 mL双蒸水，涡旋混匀，并超声处理直至多肽完全溶解于溶液中。
    15. 将溶液冷冻并冻干至干燥。
    16. 肽干燥后，称量含有粗肽的离心管质量。将粗肽溶解于水中，使其浓度为5 mg/mL。
    17. 将25 mg粗制MCP-1肽溶解于5 mL双蒸水中，配制成终浓度为5 mg/mL的溶液。使用C8反相柱，以含0.1%三氟乙酸的水溶液（流动相A）和含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液（流动相B）为流动相，通过高效液相色谱法（HPLC）纯化粗制MCP-1肽。将5 mL肽溶液注入HPLC系统。
      注意：初始流动相为100%溶剂A，流速为9.0 mL/min。在27分钟内将溶剂A缓慢降低至30%，并在此比例下保持3分钟。随后在3分钟内将梯度恢复至100%溶剂A，并在此比例下保持1分钟，总运行时间为34分钟。柱温保持在55 °C。分析时采用正离子源模式。若三氟乙酸（TFA）对HPLC柱过于酸性，可使用甲酸替代TFA。建议有机相组成梯度上升速率不超过2%/min，以获得更好的分离效果。
    18. 使用基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱分析各组分，检测预期产物在 m/z 2,890 处的信号。
      注意：将α-氰基-4-羟基肉桂酸以1 mg/mL的浓度溶于乙腈/水（50:50，体积比）中，配制基质溶液。取0.75 µL基质溶液点样至MALDI靶板，随后加入0.75 µL各组分样品。采用正离子反射模式进行质谱分析，质量扫描范围为500–5,000 Da。
    19. 合并产物组分，吹干乙腈，冷冻后将纯化后的多肽冻干至干燥。
  2. MCP-1 PA 的制备
    1. 准备1.2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺的1.1摩尔过量N-[氨基聚乙二醇-2000] DSPE-PEG(2000)-马来酰亚胺与多肽分别置于不同的闪烁瓶中。用双蒸水溶解两种化合物，配制成约15 mg/mL的溶液。超声处理15分钟，或直至两种溶液完全澄清。
      注意：DSPE-PEG(2000)-Cy5 的合成采用与 DSPE-PEG(2000)-胺和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯功能化 Cy5 相同的方案，仅第 1.2.3 步不同，该步中将溶液 pH 值调节至 8.5。
    2. 将DSPE-PEG(2000)-maleimide溶液加入肽溶液中。涡旋混匀并超声处理。
    3. 逐滴加入1 M NaOH（每次1 µL），直至溶液pH达到7。
    4. 用氮气吹扫溶液5分钟。搅拌溶液过夜。
    5. 将溶液冷冻并冻干至干燥。
    6. 待粗产物干燥后，将固体溶于水中，配制成浓度为5 mg/mL的溶液。
    7. 按照上述方法通过高效液相色谱进行纯化。
      注意：游离肽和DSPE-PEG(2000)应在15–30%有机相比例（体积分数）范围内洗脱，而DSPE-PEG(2000)-MCP-1偶联物应在40–50%有机相比例范围内洗脱。
    8. 使用 MALDI 质谱分析各组分对应的 m/z。DSPE-PEG(2000)-MCP-1 应在 m/z 5,760 处呈现一个宽峰。
      注意：对于 DSPE-PEG(2000)-MCP-1 的 MALDI 分析，2,5-二羟基苯甲酸最适合作为基质。
  3. MCP-1 PAMs 的组装
    1. 在1-dram小瓶中，将1.75 mg MCP-1 PAs溶于3 mL甲醇中。超声处理至MCP-1 PAs完全溶解。
      注意：对于成像应用，可将Cy5两亲分子以10:90的摩尔比（MCP-1 PA）掺入。
    2. 在氮气氛围下沿圆周运动蒸发甲醇，同时用甲醇冲洗小瓶壁，直至瓶底形成均匀的薄膜。将薄膜真空干燥过夜。
    3. 用 3 mL 水或磷酸盐缓冲液（PBS）水合薄膜，配制成 100 µM 的 MCP-1 PAMs 溶液。轻轻涡旋并超声处理溶液至澄清。在 80 °C 下孵育 30 分钟。
      注意：升高温度已被证明可加速自组装过程，使肽组分形成最稳定的二级结构，同时降低临界胶束浓度（CMC）。42,43.
    4. 将所得分散液冷却至室温。

2. MCP-1 正向别构调节剂的表征

  1. 动态光散射（DLS）和zeta电位
    1. 根据DLS或zeta电位仪器的说明，将100 µM的MCP-1 PAM或乱序PAM放入比色皿中。
      注意：DLS和zeta电位所用的比色皿可能因仪器说明而异。
    2. 使仪器平衡至室温，测定PAM的粒径和表面电荷。
  2. 透射电子显微镜（TEM）
    1. 将7 µL的50 µM MCP-1 PAM或乱序PAM加到固定在自闭合镊子中的TEM载网上，孵育5分钟，用精细擦拭纸吸去液滴。
    2. 加入7 µL水清洗载网，吸去液滴。
    3. 加入7 µL的1 wt%磷钨酸溶液，作用2分钟，吸去液滴，重复步骤2.2.2。
    4. 在进行TEM分析前将TEM载网干燥。
  3. 圆二色（CD）光谱
    1. 使用仪器前，提前开启氮气5–10分钟。
    2. 在比色皿中加入300 µL空白溶液（水或PBS）。
    3. 在室温下，以190–265 nm波长范围、0.2 mm光程、1 s积分时间和1 nm带宽采集光谱，重复测量3次。
    4. 在与步骤2.3.3相同的条件下，测量100 µM MCP-1肽、MCP-1 PAM、乱序肽和乱序PAM，并扣除空白值。
    5. 使用聚赖氨酸基光谱的线性插值法拟合数据。
    6. 关闭仪器，关闭仪器后等待10分钟再关闭氮气。

3. 体外 MCP-1 别构调节剂的分析

  1. 体外 生物相容性
    1. 在补充有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素和0.05 mM 2-巯基乙醇的杜尔贝科改良伊格尔培养基中，于37 °C、5% CO2条件下培养并扩增WEHI 274.1小鼠单核细胞至第5代。
      注：WEHI 274.1为悬浮细胞。培养时应每隔2–3天更换一次培养基。
    2. 将含细胞的培养基用移液器转移至无菌50 mL离心管中，在4 °C下以300 × g离心5分钟。
    3. 吸除旧培养基，并在离心管中加入10 mL新鲜培养基重悬细胞。缓慢混匀直至细胞均匀分散。使用台盼蓝染色和血细胞计数板对细胞进行计数。
    4. 将细胞稀释至每孔90 µL培养基中含有4,000个单核细胞，每孔加入90 µL细胞悬液至96孔板中。孵育24小时。
      注：避免使用96孔板外周的孔，以减少蒸发和温度变化带来的差异。外周孔中加入100 µL PBS。
    5. 在分别灭菌的微量离心管中，将0.15 µmol MCP-1肽、MCP-1 PAM、错序肽或错序-PAM溶于150 µL PBS中。进行系列稀释，制备每种样品浓度为1、10和100 µM的溶液各65 µL。
    6. 将各浓度样品10 µL加入含有WEHI 274.1细胞的孔中（每孔总体积100 µL，共6行，总计96孔）。孵育72小时。
    7. 每孔加入10 µL MTS（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四氮唑）。孵育1小时。
    8. 使用酶标仪在490 nm波长下或根据制造商说明检测吸光度。
  2. 体外 胶束结合实验
    1. 在6孔板每孔中加入2 mL含100 µM Cy5标记的MCP-1 PAM（DSPE-PEG(2000)-Cy5与MCP-1 PA摩尔比为10:90）的培养基，接种500,000个单核细胞。孵育1小时。
    2. 在4 °C下以300 × g离心5分钟收集WEHI 274.1细胞，吸除上清液。
    3. 用2 mL PBS重悬并洗涤细胞，4 °C下以300 × g离心5分钟，吸除PBS。重复用2 mL PBS洗涤一次，吸除PBS。
    4. 加入2 mL冷的4%多聚甲醛固定细胞，在室温下孵育10分钟。
    5. 将固定后的细胞用移液器转移至6孔板内无菌玻璃盖玻片上，在400 × g下离心5分钟。
    6. 去除多聚甲醛，用2 mL PBS洗涤并冲洗一次。用1 mL PB重悬。
      注：冲洗时避免破坏盖玻片上的细胞。
    7. 在载玻片上滴加10 µL含90%甘油的PBS溶液。使用针头和镊子小心取出盖玻片，擦干边缘，轻轻将盖玻片细胞面向下放置于载玻片上。
    8. 用透明指甲油轻轻封固盖玻片边缘，置于冰箱中冷藏，待成像时取出。
    9. 使用配备Cy5激发波长（λexcitation = 650 nm）激光器的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行观察。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

MCP-1 PAM 的制备
将 MCP-1 蛋白的 CCR2 结合基序（氨基酸残基 13-35）[YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] 或随机肽段 [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] 在 N 末端添加一个半胱氨酸残基进行修饰。采用 Fmoc 介导的固相合成法，使用自动多肽合成仪合成 MCP-1 肽段。粗产物通过 C8 柱反相高效液相色谱（HPLC）在 50 °C 条件下，以含 0.1% 三氟乙酸（TFA）的乙腈/水混合液进行纯化，并通过基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱进行表征（图 1）。含半胱氨酸的肽段通过硫醚键与 DSPE-PEG2000-马来酰亚胺偶联，生成 DSPE-PEG(2000)-肽段偶联物。室温反应 24 小时后，粗产物通过 HPLC 进行纯化（图 2）。DSPE-PEG(2000)-Cy5 通过 NHS 酯反应合成。将 DSPE-PEG(2000)-MCP-1 与 ...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

MCP-1 PAM 是一种前景广阔的分子成像平台，由亲水性靶向肽和驱动纳米颗粒自组装特性的疏水性尾部组成。这种靶向单核细胞的胶束可通过简单的合成与纯化步骤制备 MCP-1 肽和 DSPE-PEG(2000)-MCP-1。PAM 具有多种适用于体内分子成像的优良特性，例如可在温和条件下自组装、具有内在的可生物降解性，以及结构和化学多样性，从而能够整合其他成像基团或靶向肽，实现向特定目标部位的选择性递送。通过改变肽段、疏水性尾部或胶束浓度，可调节其粒径、形状和组成，从而为多种应用提供最优的化学和物理性质22,33。

本方案存在一些局限性，需予以说明。首先，由于PAMs依赖疏水相互作用驱动，因此必须构建亲水性的靶向肽，以使靶向部分能够暴露于胶束表面。如果肽序列本身具有疏水性，可在C端添加一至两个亲水性氨基酸进行调整，但氨基酸的添加可能影响肽在胶束内部的二级结构，从而改变其在天然蛋白状态下的性质44...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢南加州大学、国家心肺血液研究所（NHLBI，项目编号R00HL124279）、Eli和Edythe Broad创新奖以及授予EJC的L.K. Whittier基金会非癌症转化研究奖所提供的经费支持。作者感谢南加州大学电子显微镜与微分析中心、纳米生物物理学卓越中心、分子表征卓越中心以及转化成像中心在仪器设备方面的协助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,2-乙二硫醇VWRE0032用于多肽合成
10 mL 一次性血清移液管VWR89130-898用于细胞培养
15 mL 聚丙烯离心管VWR89401-566用于多种应用
2,5-二羟基苯甲酸，99%赛默飞世尔科技AC165200050用于基质辅助激光解吸电离（MALDI）
25 mL 一次性血清移液管VWR89130-900用于细胞培养
2-巯基乙醇，50 mM赛默飞世尔科技31350010用于细胞培养
5 mL 一次性血清移液管VWR89130-896用于细胞培养
50 mL 离心管VWR89039-658用于多种应用
75 cm² 培养瓶赛默飞世尔科技13-680-65用于细胞培养
75 mL 反应容器Protein Technologies3000005用于多肽合成
96 孔细胞培养板VWR40101-346用于 MTS 检测
乙腈，HPLC 级赛默飞世尔科技A998SK-4用于 HPLC 纯化
硼硅酸盐玻璃，1 dramVWR66011-041用于 PAM 合成
长尖头硼硅酸盐玻璃移液管VWR14673-043用于多种应用
盖玻片，0.16–0.19 mm，22 × 22 mm赛默飞世尔科技12-542B用于共聚焦显微镜
Cy5 胺Abcamab146463用于多肽偶联
乙醚，ACS 级赛默飞世尔科技E138-1用于多肽沉淀
一次性注射器，20 mL赛默飞世尔科技14-817-54用于 HPLC 纯化
双纽鲍计数板VWR63510-13用于细胞计数
DSPE-PEG(2000) 胺Avanti880128P用于多肽偶联
DSPE-PEG(2000) 马来酰亚胺Avanti880126P用于多肽偶联
DSPE-PEG(2000)-NHS 酯 NanocsPG2-DSNS-10K用于与 Cy5 偶联
杜尔贝科改良伊格尔培养基-高葡萄糖西格玛奥德里奇D5796-500ML用于细胞培养
胎牛血清，经鉴定，热灭活赛默飞世尔科技10438026用于细胞培养
Fmoc-L-Ala-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-A用于多肽合成
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-RBF用于多肽合成
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-NT用于多肽合成
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-CT用于多肽合成
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-QT用于多肽合成
Fmoc-L-Ile-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-I用于多肽合成
Fmoc-L-Leu-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-L用于多肽合成
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-KBC用于多肽合成
Fmoc-L-Phe-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-F用于多肽合成
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-SB用于多肽合成
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-TB用于多肽合成
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-YB用于多肽合成
Fmoc-L-Val-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-V用于多肽合成
Fmoc-Lys(Boc)-Wang 树脂，100–200 目Novabiochem856013用于多肽合成
甲酸，Optima LC/MS 级赛默飞世尔科技A117-50用于 HPLC 纯化
甘油VWRM152-1L用于共聚焦显微镜
手动计数器赛默飞世尔科技S90189用于细胞计数
磁力搅拌子，卵形VWR58949-006用于多肽偶联
甲醇，ACS 认证级赛默飞世尔科技A412-4用于 PAM 合成
MTS 细胞增殖比色法检测试剂盒VWR10191-104用于 MTS 检测
N,N-二甲基甲酰胺，测序级赛默飞世尔科技BP1160-4用于多肽合成
N-甲基吗啉Protein TechnologiesS-1L-NMM用于多肽合成
多聚甲醛赛默飞世尔科技AC416780250用于固定细胞
PBS，pH 7.4赛默飞世尔科技10010049用于多种应用
青霉素/链霉素，10,000 U/mL赛默飞世尔科技15140122用于细胞培养
多肽合成容器，25 mL 赛默飞世尔科技CG186011用于多肽合成
磷钨酸 赛默飞世尔科技A248-25用于透射电子显微镜（TEM）
哌啶SpectrumP1146-2.5LTGL用于多肽合成
普通载玻片，75 × 25 mm赛默飞世尔科技12-550-A3用于共聚焦显微镜
无菌试剂储液槽 VWR95128093用于细胞培养
自闭合镊子TedPella515用于透射电子显微镜（TEM）
TEM 支持膜TedPella01814F用于透射电子显微镜（TEM）
三氟乙酸 赛默飞世尔科技BP618-500用于多肽裂解和 HPLC 纯化
三异丙基硅烷VWRTCT1533-5ml用于多肽裂解
台盼蓝溶液，0.4%赛默飞世尔科技15250061用于细胞计数
通用锯齿镊VWR231-SA-SE用于共聚焦显微镜
WEHI-274.1ATCCATCC CRL-1679小鼠单核细胞
自动化台式多肽合成仪Protein TechnologiesPS3 台式多肽合成仪
α-氰基-4-羟基肉桂酸，99%西格玛奥德里奇476870-2G用于基质辅助激光解吸电离（MALDI）

参考文献

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
  2. Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12 (2006).
  3. Rahmani, M., Cruz, R. P., Granville, D. J., McManus, B. M. Allograft Vasculopathy Versus Atherosclerosis. Circ. Res. 99 (8), 801-815 (2006).
  4. Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
  5. Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature (London, U. K). 473 (7347), 317-325 (2011).
  6. Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature (London). 394 (6696), 894-897 (1998).
  7. Szmitko, P. E., et al. New Markers of Inflammation and Endothelial Cell Activation. Circulation. 108 (16), 1917-1923 (2003).
  8. Deshmane, S. L., Kremlev, S., Amini, S., Sawaya, B. E. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. J. Interferon Cytokine Res. 29 (6), 313-326 (2009).
  9. Chung, E. J., et al. Monocyte-Targeting Supramolecular Micellar Assemblies: A Molecular Diagnostic Tool for Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (3), 367-376 (2015).
  10. Chung, E. J. Targeting and therapeutic peptides in nanomedicine for atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 891-898 (2016).
  11. Sanz, J., Fayad, Z. A. Imaging of atherosclerotic cardiovascular disease. Nature (London, U. K.). 451 (7181), 953-957 (2008).
  12. Tarkin, J. M., et al. Imaging Atherosclerosis. Circ. Res. 118 (4), 750-769 (2016).
  13. Hennerici, M., Baezner, H., Daffertshofer, M. Ultrasound and arterial wall disease. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 19-33 (2004).
  14. Nissen, S. E. Application of intravascular ultrasound to characterize coronary artery disease and assess the progression or regression of atherosclerosis. Am J Cardiol. 89 (4A), 24B-31B (2002).
  15. Khalil, M. M., Tremoleda, J. L., Bayomy, T. B., Gsell, W. Molecular SPECT Imaging: An Overview. Int J Mol Imaging. 2011, 796025(2011).
  16. Lerakis, S., et al. Imaging of the vulnerable plaque: noninvasive and invasive techniques. Am J Med Sci. 336 (4), 342-348 (2008).
  17. Sun, Z. H., Rashmizal, H., Xu, L. Molecular imaging of plaques in coronary arteries with PET and SPECT. J Geriatr Cardiol. 11 (3), 259-273 (2014).
  18. Godin, B., et al. Emerging applications of nanomedicine for the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases. Trends Pharmacol. Sci. 31 (5), 199-205 (2010).
  19. Branco de Barros, A. L., Tsourkas, A., Saboury, B., Cardoso, V. N., Alavi, A. Emerging role of radiolabeled nanoparticles as an effective diagnostic technique. EJNMMI Res. 2 (1), 31-39 (2012).
  20. Jayagopal, A., Linton, M. F., Fazio, S., Haselton, F. R. Insights into atherosclerosis using nanotechnology. Curr. Atheroscler. Rep. 12 (3), 209-215 (2010).
  21. Khodabandehlou, K., Masehi-Lano, J. J., Poon, C., Wang, J., Chung, E. J. Targeting cell adhesion molecules with nanoparticles using in vivo and flow-based in vitro models of atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 242 (8), 799-812 (2017).
  22. Trent, A., Marullo, R., Lin, B., Black, M., Tirrell, M. Structural properties of soluble peptide amphiphile micelles. Soft Matter. 7 (20), 9572-9582 (2011).
  23. Hartgerink, J. D., Beniash, E., Stupp, S. I. Peptide-amphiphile nanofibers: A versatile scaffold for the preparation of self-assembling materials. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (8), 5133-5138 (2002).
  24. Missirlis, D., et al. Effect of the Peptide Secondary Structure on the Peptide Amphiphile Supramolecular Structure and Interactions. Langmuir. 27 (10), 6163-6170 (2011).
  25. Zhong, L., Johnson, W. C. Environment affects amino acid preference for secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (10), 4462-4465 (1992).
  26. Shimada, T., Lee, S., Bates, F. S., Hotta, A., Tirrell, M. Wormlike Micelle Formation in Peptide-Lipid Conjugates Driven by Secondary Structure Transformation of the Headgroups. J. Phys. Chem. B. 113 (42), 13711-13714 (2009).
  27. Missirlis, D., et al. Linker Chemistry Determines Secondary Structure of p5314-29 in Peptide Amphiphile Micelles. Bioconjugate Chem. 21 (3), 465-475 (2010).
  28. Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu. Rev. Mater. Sci. 26, 365-394 (1996).
  29. Xue, Y., O'Mara, M. L., Surawski, P. P. T., Trau, M., Mark, A. E. Effect of Poly(ethylene glycol) (PEG) Spacers on the Conformational Properties of Small Peptides: A Molecular Dynamics Study. Langmuir. 27 (1), 296-303 (2011).
  30. Canalle, L. A., Loewik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Polypeptide-polymer bioconjugates. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 329-353 (2010).
  31. Hamley, I. W. PEG-Peptide Conjugates. Biomacromolecules. 15 (5), 1543-1559 (2014).
  32. Acar, H., et al. Self-assembling peptide-based building blocks in medical applications. Adv. Drug Delivery Rev. , (2016).
  33. Busseron, E., Ruff, Y., Moulin, E., Giuseppone, N. Supramolecular self-assemblies as functional nanomaterials. Nanoscale. 5 (16), 7098-7140 (2013).
  34. Barrett, J. C., et al. Modular Peptide Amphiphile Micelles Improving an Antibody-Mediated Immune Response to Group A Streptococcus. ACS Biomater. Sci. Eng. 3 (2), 144-152 (2017).
  35. Toughrai, S., et al. Reduction-Sensitive Amphiphilic Triblock Copolymers Self-Assemble Into Stimuli-Responsive Micelles for Drug Delivery. Macromol. Biosci. 15 (4), 481-489 (2015).
  36. Swirski, F. K., et al. Monocyte accumulation in mouse atherogenesis is progressive and proportional to extent of disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (27), 10340-10345 (2006).
  37. Kashiwagi, M., et al. Association of monocyte subsets with vulnerability characteristics of coronary plaques as assessed by 64-slice multidetector computed tomography in patients with stable angina pectoris. Atherosclerosis (Amsterdam, Neth). 212 (1), 171-176 (2010).
  38. Chung, E. J., Tirrell, M. Recent Advances in Targeted, Self-Assembling Nanoparticles to Address Vascular Damage Due to Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (16), 2408-2422 (2015).
  39. Cassetta, L., Pollard, J. W. Cancer immunosurveillance: role of patrolling monocytes. Cell Res. 26 (1), 3-4 (2016).
  40. Williams, C. B., Yeh, E. S., Soloff, A. C. Tumor-associated macrophages: unwitting accomplices in breast cancer malignancy. NPJ Breast Cancer. 2, (2016).
  41. Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and Macrophages in Cancer: Development and Functions. Cancer Microenviron. 6 (2), 179-191 (2013).
  42. Schick, M. J. Effect of temperature on the critical micelle concentration of nonionic detergents. Thermodynamics of micelle formation. J. Phys. Chem. 67 (9), 1796-1799 (1963).
  43. Marullo, R., Kastantin, M., Drews, L. B., Tirrell, M. Peptide contour length determines equilibrium secondary structure in protein-analogous micelles. Biopolymers. 99 (9), 573-581 (2013).
  44. Hilbich, C., Kisters-Woike, B., Reed, J., Masters, C. L., Beyreuther, K. Substitutions of hydrophobic amino acids reduce the amyloidogenicity of Alzheimer's disease βA4 peptides. J. Mol. Biol. 228 (2), 460-473 (1992).
  45. Trevino, S. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. Amino Acid Contribution to Protein Solubility: Asp, Glu, and Ser Contribute more Favorably than the other Hydrophilic Amino Acids in RNase Sa. J. Mol. Biol. 366 (2), 449-460 (2007).
  46. Kim, S. W., Shi, Y. Z., Kim, J. Y., Park, K. N., Cheng, J. X. Overcoming the barriers in micellar drug delivery: Loading efficiency, in vivo stability, and micelle-cell interaction. Expert Opin Drug Delivery. 7 (1), 49-62 (2010).
  47. Rangel-Yagui, C. O., Pessoa, A. Jr, Tavares, L. C. Micellar solubilization of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 8 (2), 147-163 (2005).
  48. Batrakova, E., et al. Fundamental relationships between the composition of pluronic block copolymers and their hypersensitization effect in MDR cancer cells. Pharm. Res. 16 (9), 1373-1379 (1999).
  49. Chen, L. J., Lin, S. Y., Huang, C. C. Effect of Hydrophobic Chain Length of Surfactants on Enthalpy-Entropy Compensation of Micellization. J. Phys. Chem. B. 102 (22), 4350-4356 (1998).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

MCP 1 HPLC
用于动脉粥样硬化成像的靶向单核细胞肽两亲性胶束的合成
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。