荧光互补成像检测在烟草烟叶中瞬时测定蛋白质-蛋白质相互作用动力学

为了协调生长与环境, 植物已经进化了优雅的信号通路, 感知, 传感器, 并响应信号提示。就像接力赛中的赛跑者一样, 蛋白质是植物信号传导的必要参与者。人们普遍认识到蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 在细胞通讯中起着重要作用。蛋白质的磷酸化、再乙酰化和降解都依赖于靶蛋白与其修饰酶之间的物理相互作用。例如, 茉莉以域蛋白 (JAZ) 家族蛋白与转录因子 MYC2 相互作用并抑制其转录活性^1,2。鉴于 PPI 的重要性, 植物中的 large-scale 蛋白 interactomes 最近已被探索^3,4,5。这些 interactome 的结果进一步揭示了复杂的调控网络, 协调不同的细胞功能。

有一些既定的方法来监测 PPI。酵母两种杂交 (Y2H) 法是 PPI 检测中应用最广泛的方法。Y2H 很容易执行, 适合快速检测蛋白质相互作用。Y2H 也广泛用于筛选未知的交互合作伙伴的特定 protein-of-interest。然而, 由于 Y2H 完全是在酵母中进行的, 它不能反映植物细胞的真实情况, 并带来高假阳性率。另一个类似的策略是下拉法。一般来说, 两个蛋白质的表达和纯化从大肠杆菌细胞, 然后混合和固定的检测蛋白相互作用。虽然此方法不费时, 但它也无法获取在体内交互结果。对于体内交互目的, co-immunoprecipitation (co) 是最常用的检测方法, 它要求高质量的抗体 immunoprecipitate protein-of-interest, 不能排除间接质子的可能性。此外, 由于联合 IP 中的复杂实验程序, 结果通常与个人专长不同。

基于记者的重组分析大大推进了对体内PPI 的检测。这些方法包括荧光共振能量传递 (烦恼)⁶, 双荧光互补 (BiFC)⁷, 和萤火虫荧光互补成像 (的) 试验⁸。虽然这三种方法比 co 更好地反映直接的在体内PPI, 烦恼, 和 BiFC 需要特定的显微镜来检测荧光信号, 不能轻易量化的互动强度。相比之下, 该公司利用萤火虫荧光, 这将发光后与它的基底素反应。更重要的是, PPI 强度可以从荧光活动的价值来确定。因此, 它不仅表明两种蛋白质是否相互作用, 而且还提供了治疗时相互作用动力学的信息。虽然有一些建立的方法来监测交互动力学 (基于表面等离子体共振或热稳定转移)^9,10, 这些方法需要微妙的仪器或特定的标签。相比之下, 它更易于执行和检测。

该方法的原理是将氨基末端和羧基末端的荧光 (分别命名为 n-卢克或 C-卢克) 与蛋白 A 和 B 融合, 并在植物细胞中同时表达这两种融合蛋白。如果蛋白质 a 与蛋白质 B 相互作用, 那么荧光的两个半部分将被重组为活性荧光酶。荧光活动可以通过计或 CCD 摄像头检测到。没有必要获得稳定的转化。瞬态表达式足以获得高质量的交互结果。

环型 E3 泛素连接本构 photomorphogenic 1 (COP1) 与无数转录因子相互作用, 通过26S 蛋白酶体¹¹促进它们的降解。其中一些 COP1-targeted 转录因子是光的阳性调节剂。在黑暗中, COP1 与光敏 A-105 1 (SPA1) 的抑制器交互, 这增强了 COP1 E3 活动⁸。在对光的知觉之后, 光将废除 COP1-SPA1 相互作用抑制 COP1 活动, 然后稳定 COP1 基板^12,13,14。这个例子说明了研究 ppi 和确定 ppi 动力学的生物学意义。

1. 植物的准备 (8 周)

1. 将 50烟草烟种子放在一个1.5 毫升的离心管中, 其中含有1毫升5% 次氯酸和0.1% 海卫 X-100 (v/v) 溶液, 并留出5分钟来消毒种子。
2. 用无菌水冲洗种子5次, 在200µL 的无菌水中暂停种子。
3. 小心地将单个种子放到 MS 琼脂培养基上 (1 L: 1x 村 & Skoog 盐, 10 克蔗糖, pH 5.8 (KOH), 1% 琼脂), 并在4° c 中储存介质板, 3 天以同步发芽。
   注意: 为了避免微生物污染, 在干净的长凳上执行这一步。在灭菌过程中不需要摇动管子。
4. 将培养基板置于正常生长条件下 (22 ° c, 80-90 µmolm^-2s^-1白光强度) 为10天, 然后将发芽的幼苗转移到土壤中。
   注意: 一定要将幼苗根部插入土壤中, 不要破坏根部。用透明的塑料盖盖在托盘上过夜, 以保持湿度。
5. 在一个受控的生长室中生长的植物在一个 16 h/8 的 h 光/暗循环和70% 湿度。7周前的N. 烟植物已准备好进行Agrobacteriumtumefaciens浸润 (图 1A)。
   注: 水厂和控制害虫的需要, 保持植物的健康。

2. 在n 烟叶片中的瞬态表达式 (7-10 天)

1. 提供 150 ng 质粒 (pEGAD-哈卢-卢克控制粒, 空向量, 和构建质粒的检测, 在这种情况下, 我们使用 pCAMBIA1300-Nluc 和 pCAMBIA1300-Cluc 的质粒建设) 到.标准电穿孔法。
2. 在 Luria Bertani (LB) 琼脂培养基 (1 升:10 克氯化钠, 5 克酵母提取物, 10 g 胰, 1.5% 琼脂) 中含有50µg/毫升卡那霉素和50µg/毫升利福平在28° c 4 天的培养.
   注: 抗生素的选择取决于所使用的载体和.
3. 将单个A. 农杆菌菌落从每个板块接种到3毫升的 LB 液体培养基中, 其中含有50µg/毫升的卡那霉素和50µg/毫升的利福平, 在28° c 时摇动 220 rpm, 以传播细胞培养。
4. 将75µL 的细菌培养物转化为15毫升的新鲜 LB 液体培养基, 其中含有50µg/毫升的卡那霉素和50µg/毫升的利福平, 其稀释系数为200。培养细菌在220转每分钟在30° c 为大约 8 h, 直到 OD₆₀₀在0.5 到1.0 之间。
5. 将A. 农杆菌液体培养在15毫升离心管和离心机在 4000 x g 和4° c 为 15 min. 丢弃上清, 并在15毫升的转化溶液中悬浮颗粒以洗涤颗粒。
6. 旋转管在 4000 x g 和4° c 为15分钟和放弃上清液。再次重复洗涤步骤。
7. 在5毫升的转化液中重颗粒, 室温下保持2小时。使用转换解调整A. 农杆菌颗粒细胞的密度, 直到最终浓度的 OD₆₀₀是 0.5, 或混合两个样本的大小相等, 以测试配对蛋白质的相互作用。
8. 将悬浮细胞渗透到 4^th至 7^th , 带1毫升针注射器 (图 1B-C)。入渗后, 用黑色塑料盖立即盖住植物, 在黑暗中放置托盘12小时。之后, 在发现卢克的活动之前, 像往常一样种植2到4天的植物。
   注意: 选择大小相近的健康叶子。在一片叶子中, 四不同区域的渗透是好的。

3. 检测荧光活动 (一天)

注意: 有两种方法可以监视荧光活动。一个是基于成像, 另一个是定量测量荧光活动。

1. 成像方法
   1. 分离渗透的叶子, 把整个传单放在 MS 琼脂培养基上。
   2. 用50毫升喷雾瓶将素工作缓冲液喷洒到叶片正面表面。保持材料在黑暗中5分钟, 以淬火叶绿素荧光。
   3. 使用低光冷却的 CCD 成像设备 (冷却到-30 ° c) 捕获图像 (图 2)。light-filed 曝光时间为50毫秒, 发光检测时间为1分钟。
      注: 根据机器说明书调整参数。较低的温度会提高信噪比, 提高图像质量。
2. 或者, 直接用商业计测量发光。
   1. 小心地将叶子碎片 (大约0.25 厘米²) 从N. 烟的渗透区中取出, 然后将叶盘浸入100µL 的去离子水中, 在96井白板中 (图 3)。
   2. 添加10µL 的素工作缓冲器, 离开5分钟。然后进行具体的处理, 研究蛋白质相互作用的动力学。
      注意: 在不同的时间点检测发光与计, 以获得荧光活性动力学, 这代表了蛋白质-蛋白质相互作用的动力学在一定的治疗。该方法具有同时检测大量蛋白质对的优点。对于那些没有商业计, 检查荧光蛋白质丰度由西方印迹, 因此引用的卢克活动定量。如果没有必要的光, 只是保持板在计和测量发光在不同的时间点。否则, 在检测间隙中将板材移入生长腔。为了获得统计学意义上的结果, 使用至少三的生物复制。虽然卢克的活动从不同的渗透区将变化, 他们的变化模式是一致的正常化后。

在这个荧光的互补协议中, 有三主要的步骤可用于研究蛋白质-蛋白质相互作用的体内, 包括植物生长、烟草浸润和荧光测定。该协议中最关键的步骤是将液体A. 农杆菌渗透到N. 烟叶 (图 1)。

下面是这个技术的一个例子, 它证实了茉莉减少 COP1-SPA1 的相互作用。荧光的氨基末端和羧基端部分别与 COP1 (COP1-NLuc) 或 SPA1 (CLuc-SPA1) 融合。COP1-SPA1 的相互作用导致功能荧光的互补。通过 CCD 摄像机 (图 2) 对荧光活动进行了成像, 并且可以用计 (图 3) 检测酶活性。为了排除荧光本身受治疗影响的可能性, 全长荧光 (吕克) 基因也在N. 烟叶中瞬时表达, 作为一种控制。茉莉处理前的荧光活动 (时间 0) 设置为 1, 然后在茉莉处理下获得的每个荧光活动值均归入时间 0, 以获得相对荧光活动 (图 4)。结果表明, COP1-SPA1 的相互作用 (由荧光活动反映) 在黑暗中逐渐下降, JA 治疗进一步减少了它们之间的相互作用。

图 1.N. 烟浸润的过程。
(A)植物在入渗前的背面和正面的视图。(B)代表图像以显示渗透协议。(C)在渗透后的植物背面和正面的看法。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2.CCD 摄像机下的成像荧光活动。
(A)在正常光场下的一个N. 烟叶的代表图像。(B)检测 CCD 摄像机下的发光信号, 以显示荧光活动。请单击此处查看此图的较大版本.

图 3。代表图像, 以显示如何测量从剪切的叶盘的发光. 
被渗透的叶子盘被切开了并且投入了96个好白色板材测量发光信号。请单击此处查看此图的较大版本.

图 4.一个瞬态荧光互补法的代表性结果。
(A)列出了处理时间 (时间) 和发光值 (吕克活动) 的原始结果。每个样本有三独立的复制。为准备这张图表, 卢克活动在不同的处理时间点被规范化了以时间0作为相对卢克活动。
(B)相对于卢克活动的量化, 显示 COP1-SPA1 在黑暗中的相互作用逐渐减少, 这可以通过进一步的 JA 处理来减少。错误栏指示标准偏差 (sd)。请单击此处查看此图的较大版本.

作者没有什么可透露的。