Nicotiana benthamiana 叶片中用于瞬时测定蛋白质-蛋白质相互作用动态的荧光素酶互补成像分析

摘要

本文描述了一种基于荧光素酶活性测定的、用于确定蛋白质-蛋白质相互作用的简便快速实验方法。

摘要

蛋白质-蛋白质相互作用是大多数细胞过程中传递信号转导的基本机制；因此，鉴定新的蛋白质-蛋白质相互作用对并监测蛋白质相互作用的动态变化，对于揭示植物如何响应环境因素和/或发育信号具有重要意义。目前已开发出大量方法用于检测蛋白质-蛋白质相互作用，可在体外（in vitro）或体内（in vivo）进行。其中，近年来建立的荧光素酶互补成像（LCI）检测法是证明体内蛋白质-蛋白质相互作用最简单且最快的方法。在该检测中，蛋白A或蛋白B分别与荧光素酶的氨基端或羧基端半分子融合。当蛋白A与蛋白B相互作用时，荧光素酶的两个半分子将重新构建成具有功能和活性的完整荧光素酶酶分子。荧光素酶活性可通过发光仪或CCD相机进行记录。与其他方法相比，LCI检测法能够对蛋白质-蛋白质相互作用进行定性和定量分析。农杆菌介导的Nicotiana benthamiana叶片瞬时转化是广泛使用的瞬时蛋白表达系统。结合LCI与瞬时表达技术，这些方法表明，茉莉酸处理后，COP1与SPA1之间的物理相互作用逐渐减弱。

引言

为了协调生长与环境的关系，植物进化出了精密的信号通路，以感知、转导并响应各种信号刺激。如同接力赛中的赛跑者，蛋白质在植物信号转导过程中发挥着关键作用。人们已普遍认识到，蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）在细胞通讯中具有重要作用。蛋白质的磷酸化、乙酰化以及降解过程，均依赖于靶蛋白与其修饰酶之间的物理相互作用。例如，茉莉酸ZIM结构域蛋白（JAZ）家族蛋白与转录因子MYC2相互作用，并抑制其转录活性^1,2。鉴于PPI的重要性，近年来研究人员已对植物中的大规模蛋白质相互作用组进行了探索^3,4,5。这些相互作用组研究结果进一步揭示了协调多种细胞功能的复杂调控网络。

目前已有一些成熟的方法用于监测蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）。酵母双杂交（Y2H）实验是检测PPI应用最广泛的方法。Y2H操作简便，适用于快速检测蛋白质间的相互作用。此外，Y2H也常用于筛选特定目标蛋白的未知相互作用伙伴。然而，由于Y2H完全在酵母中进行，无法真实反映植物细胞中的实际情况，且假阳性率较高。另一种类似策略是pull-down实验。通常情况下，两种蛋白质分别在体外表达并纯化 大肠杆菌 细胞，然....

方案

1. 植物准备（8周）

1. 取50粒Nicotiana benthamiana种子放入一个含有1 mL 5% NaClO和0.1% Triton X-100（V/V）溶液的1.5 mL微量离心管中，静置5分钟以对种子进行灭菌。
2. 用无菌水清洗种子5次，并将种子悬浮于200 µL无菌水中。
3. 用细尖工具将单粒种子小心地放置在MS-琼脂培养基表面（1 L：1×Murashige & Skoog盐类，10 g蔗糖，pH 5.8（用KOH调节），1%琼脂），并将培养基平板置于4 °C下3天，以同步萌发。
   注意：为避免微生物污染，此步骤应在超净工作台中进行。灭菌过程中无需震荡离心管。
4. 将培养基平板置于正常生长条件下（22 °C，80 - 90 µmolm^-2s^-1 白光强度）培养10天，然后将萌发的幼苗移栽至土壤中。
   注意：确保将幼苗根部插入土壤中，避免损伤根系。移栽后用透明塑料盖覆盖培养皿过夜，以保持湿度。
5. 将植株置于人工气候室中培养，光照周期为16小时光照/8小时黑暗，相对湿度70%。7周龄的N. benthamiana植株可用于Agrobacterium tumefaciens侵染（图1A）。
   注意：根....

结果

该荧光素酶互补实验方案中可明确分为三个主要步骤，用于研究蛋白质-蛋白质相互作用 体内，包括植物生长、烟草浸润以及荧光素酶检测。本方案中最关键的步骤是浸润液体 A. tumefaciens 进入 N. benthamiana 叶片（图1).

以下示例展示了该技术在验证茉莉酸减少 COP1-SPA1 相互作用方面的有效性。将荧光素酶的氨基端和羧基端分别与 COP1（COP1-NLuc）或 SPA1（CLuc-SPA1）融合。COP1 与 SPA1 的相互作用可导致功能性荧光素酶的互补恢复。荧光素酶活性通过 CCD 相机成像（图 2），也可使用化学发光仪检测其酶活性（图 3）。为排除荧光素酶本身受处理影响的可能性，实验中同时在 .......

讨论

本方案描述的方法简单且可重复，适用于研究 体内 蛋白质-蛋白质相互作用，尤其适用于检测外源处理条件下蛋白质相互作用的动态变化。该实验的关键步骤是 N. benthamiana 浸润。为确保浸润成功，植物必须非常健康。另一个关键因素是浸润后何时检测荧光素酶活性。该问题没有统一答案。建议研究人员在浸润后的不同天数监测荧光素酶活性，以判断荧光光素酶表达达到最高水平的时间，因为我们观察到蛋白表达水平随时间发生波动。⁸.

在某些实验中可能无法检测到发光信号。若无适当的对照，无法排除假阴性结果的可能性。需要设置全长荧光素酶对照，以验证侵染过程及荧光素酶检测系统的有效性。如果在疑似存在蛋白相互作用的配对中仍然未检测到发光信号，则需通过免疫印迹实验检测蛋白表达情况，以排除一个或两个蛋白未能成功表达的可能性。最后一种可能是，由于蛋白构象的原因，蛋白相互作用可能阻碍了荧光素酶的互补。若出现这种情况，使用截短的蛋白或交换N端荧光素酶（N-Luc）与C端荧光素酶（C-Luc）的融合方向，将有助于解决这一问题。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
转化溶液
10 mM 吗啉乙磺酸	VETEC	V900336
27.8 mM 葡萄糖	VETEC	V900392
10 mM MgCl₂2×6H2O	VETEC	V900020
150 μM 乙酰丁香酮	ALDRICH	D134406
pH 5.7
荧光素工作缓冲液
5 mM 荧光素钾盐	GOLD BIOTECHNOLOGY	LUCK-100
0.025% Triton X-100	VETEC	V900502
H20 到 10 毫升