本文描述了一种基于荧光素酶活性测定的、用于确定蛋白质-蛋白质相互作用的简便快速实验方法。
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Nicotiana benthamiana 叶片中用于瞬时测定蛋白质-蛋白质相互作用动态的荧光素酶互补成像分析
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
蛋白质-蛋白质相互作用是大多数细胞过程中传递信号转导的基本机制；因此，鉴定新的蛋白质-蛋白质相互作用对并监测蛋白质相互作用的动态变化，对于揭示植物如何响应环境因素和/或发育信号具有重要意义。目前已开发出大量方法用于检测蛋白质-蛋白质相互作用，可在体外（in vitro）或体内（in vivo）进行。其中，近年来建立的荧光素酶互补成像（LCI）检测法是证明体内蛋白质-蛋白质相互作用最简单且最快的方法。在该检测中，蛋白A或蛋白B分别与荧光素酶的氨基端或羧基端半分子融合。当蛋白A与蛋白B相互作用时，荧光素酶的两个半分子将重新构建成具有功能和活性的完整荧光素酶酶分子。荧光素酶活性可通过发光仪或CCD相机进行记录。与其他方法相比，LCI检测法能够对蛋白质-蛋白质相互作用进行定性和定量分析。农杆菌介导的Nicotiana benthamiana叶片瞬时转化是广泛使用的瞬时蛋白表达系统。结合LCI与瞬时表达技术，这些方法表明，茉莉酸处理后，COP1与SPA1之间的物理相互作用逐渐减弱。
引言
为了协调生长与环境的关系，植物进化出了精密的信号通路，以感知、转导并响应各种信号刺激。如同接力赛中的赛跑者，蛋白质在植物信号转导过程中发挥着关键作用。人们已普遍认识到，蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）在细胞通讯中具有重要作用。蛋白质的磷酸化、乙酰化以及降解过程，均依赖于靶蛋白与其修饰酶之间的物理相互作用。例如，茉莉酸ZIM结构域蛋白（JAZ）家族蛋白与转录因子MYC2相互作用，并抑制其转录活性1,2。鉴于PPI的重要性，近年来研究人员已对植物中的大规模蛋白质相互作用组进行了探索3,4,5。这些相互作用组研究结果进一步揭示了协调多种细胞功能的复杂调控网络。
目前已有一些成熟的方法用于监测蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）。酵母双杂交（Y2H）实验是检测PPI应用最广泛的方法。Y2H操作简便，适用于快速检测蛋白质间的相互作用。此外，Y2H也常用于筛选特定目标蛋白的未知相互作用伙伴。然而，由于Y2H完全在酵母中进行，无法真实反映植物细胞中的实际情况，且假阳性率较高。另一种类似策略是pull-down实验。通常情况下，两种蛋白质分别在体外表达并纯化 大肠杆菌 细胞，然后混合并固定以检测蛋白质相互作用。尽管该方法并不耗时，但无法获得 体内 相互作用结果也同样如此。对于 在体 用于相互作用研究时，共免疫沉淀（co-IP）是最常用的方法，该方法需要高质量的抗体来沉淀目标蛋白，但无法排除间接蛋白相互作用的可能性。此外，由于共免疫沉淀实验步骤较为复杂，实验结果通常因操作者的经验不同而存在差异。
基于报告基因的重建实验显著促进了检测 体内 PPI。这些方法包括荧光共振能量转移（FRET）6双分子荧光互补（BiFC）7，以及萤火虫荧光素酶互补成像（LCI）检测8尽管这三种方法在反映直接相互作用方面优于共免疫沉淀（co-IP） 体内 PPI、FRET 和 BiFC 需要特定的显微镜来检测荧光信号，且难以对相互作用强度进行定量。相比之下，LCI 利用萤火虫荧光素酶，该酶在与其底物荧光素反应后会发光。更重要的是，PPI 强度可通过荧光素酶活性值来确定。因此，LCI 不仅能够指示两种蛋白质是否发生相互作用，还能提供经处理后相互作用动态的信息。尽管目前已有一些成熟的方法可用于监测相互作用动态（基于表面等离子共振或热稳定性偏移）9,10，这些方法需要精密的仪器或特定的标记。相比之下，LCI 更易于操作和检测。
LCI 的原理是将荧光素酶的氨基端和羧基端（分别称为 N-Luc 和 C-Luc）分别与蛋白 A 和蛋白 B 融合，并在植物细胞中同时表达这两种融合蛋白。如果蛋白 A 与蛋白 B 发生相互作用，则荧光素酶的两个片段将重新构建成具有活性的荧光素酶酶分子。荧光素酶活性可通过发光仪或 CCD 相机进行检测。LCI 无需获得稳定转化植株，瞬时表达即可获得高质量的相互作用结果。
RING型E3泛素连接酶组成型光形态发生1（COP1）可与多种转录因子相互作用，并通过26S蛋白酶体促进这些转录因子的降解11。其中一些被COP1靶向的转录因子是光形态建成的正向调控因子。在黑暗条件下，COP1与光敏色素A抑制因子1（SPA1）相互作用，从而增强COP1的E3活性8。感知光信号后，光感受器会阻断COP1与SPA1之间的相互作用，抑制COP1的活性，进而稳定COP1的底物12,13,14。此实例说明了研究蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）及解析其动态变化的生物学意义。
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方案
1. 植物准备（8周）
- 取50粒Nicotiana benthamiana种子放入一个含有1 mL 5% NaClO和0.1% Triton X-100（V/V）溶液的1.5 mL微量离心管中，静置5分钟以对种子进行灭菌。
- 用无菌水清洗种子5次，并将种子悬浮于200 µL无菌水中。
- 用细尖工具将单粒种子小心地放置在MS-琼脂培养基表面（1 L：1×Murashige & Skoog盐类，10 g蔗糖，pH 5.8（用KOH调节），1%琼脂），并将培养基平板置于4 °C下3天，以同步萌发。
注意：为避免微生物污染，此步骤应在超净工作台中进行。灭菌过程中无需震荡离心管。 - 将培养基平板置于正常生长条件下（22 °C，80 - 90 µmolm-2s-1 白光强度）培养10天，然后将萌发的幼苗移栽至土壤中。
注意：确保将幼苗根部插入土壤中，避免损伤根系。移栽后用透明塑料盖覆盖培养皿过夜，以保持湿度。 - 将植株置于人工气候室中培养，光照周期为16小时光照/8小时黑暗，相对湿度70%。7周龄的N. benthamiana植株可用于Agrobacterium tumefaciens侵染（图1A）。
注意：根据需要浇水并防治病虫害，以保持植株健康。
2. 在N. benthamiana叶片中进行瞬时表达（7 - 10天）
- 将150 ng质粒（pEGAD-HA-LUC对照质粒、空载体以及用于LCI实验的构建质粒，本实验中使用pCAMBIA1300-Nluc和pCAMBIA1300-Cluc进行质粒构建）转入 A. tumefaciens 使用标准电穿孔方法转化感受态细胞菌株GV3101。
- 培养 A. tumefaciens 在含有50 µg/mL卡那霉素和50 µg/mL利福平的Luria-Bertani（LB）琼脂培养基（1 L：10 g NaCl、5 g酵母提取物、10 g胰蛋白胨、1.5%琼脂）上，28 °C培养4天。
注意：抗生素的选择取决于载体和宿主 A. tumefaciens 所用菌株。 - 接种一个单菌落 A. tumefaciens 从每块平板上挑取单菌落，接种于含有50 µg/mL卡那霉素和50 µg/mL利福平的3 mL LB液体培养基中，于28 °C、220 rpm振荡培养24小时，以扩增菌液。
- 将75 µL细菌培养物转移至含有50 µg/mL卡那霉素和50 µg/mL利福平的15 mL新鲜LB液体培养基中，稀释倍数为200倍。在30 °C、220 rpm条件下培养约8小时，直至OD600 介于 0.5 到 1.0 之间。
- 转移 A. tumefaciens 在15 mL离心管中进行液体培养，于4,000 × g、4 °C离心15分钟。弃上清，将沉淀重悬于15 mL转化溶液中以洗涤沉淀。
- 在 4,000 × g、4 °C 条件下离心 15 分钟，弃上清液。重复洗涤步骤一次。
- 将沉淀重悬于5 mL转化溶液中，并保持 室温下孵育2小时。调整密度至 A. tumefaciens 用转化溶液重悬细胞沉淀，直至终浓度达到OD600 为0.5，或等体积混合两个样本以检测成对蛋白质相互作用。
- 将悬浮细胞注入4th 至 7th 使用1 mL无针注射器的叶片（图1B-C浸润后，立即用黑色塑料膜覆盖植株，并将培养盘置于黑暗环境中12小时。随后，按常规条件培养植株2至4天，再检测LUC活性。
注意：选择大小相近的健康叶片。一片叶片上进行四个不同区域的侵染即可。
3. 检测荧光素酶活性（一天）
注意：有两种方法可以监测荧光素酶活性。一种是基于成像的方法，另一种是定量测定荧光素酶活性。
- 成像方法
- 取一片已浸润的叶片，将整个小叶放置于MS琼脂培养基上。
- 使用50 mL喷雾瓶将荧光素工作缓冲液均匀喷洒在叶片的近轴面，并将材料置于黑暗环境中5分钟，以淬灭叶绿素自发荧光。
- 使用低温冷却的CCD成像装置（冷却至-30 °C）进行图像采集（图2）。明场曝光时间为50 ms，发光检测时间为1 min。
注意：请根据仪器说明书调整参数。较低的温度可提高信噪比，从而改善图像质量。
- 或者，可使用商用荧光计直接测定发光强度。
- 从N. benthamiana叶片的浸润区域小心切取叶片段（约0.25 cm2），并将叶圆片浸入96孔白色板中的100 µL去离子水中（图3）。
- 加入10 µL荧光素工作缓冲液，静置5分钟，随后进行特定处理以研究蛋白相互作用动态。
注意：在不同时间点使用荧光计检测发光信号，以获得代表特定处理条件下蛋白质-蛋白质相互作用动力学的荧光素酶活性变化。该方法适用于同时检测大量蛋白对。若无商用荧光计，可通过Western blot检测荧光素酶蛋白丰度，从而间接定量LUC活性。若无需光照处理，则将板置于荧光计中并在不同时间点直接测量发光值；否则，在检测间隔期间将板转移至生长培养箱中。为获得具有统计学意义的结果，至少应设置三个生物学重复。尽管不同浸润区域的LUC活性可能存在差异，但在归一化后其变化模式具有一致性。
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结果
该荧光素酶互补实验方案中可明确分为三个主要步骤，用于研究蛋白质-蛋白质相互作用 体内，包括植物生长、烟草浸润以及荧光素酶检测。本方案中最关键的步骤是浸润液体 A. tumefaciens 进入 N. benthamiana 叶片（图1).
以下示例展示了该技术在验证茉莉酸减少 COP1-SPA1 相互作用方面的有效性。将荧光素酶的氨基端和羧基端分别与 COP1（COP1-NLuc）或 SPA1（CLuc-SPA1）融合。COP1 与 SPA1 的相互作用可导致功能性荧光素酶的互补恢复。荧光素酶活性通过 CCD 相机成像（图 2），也可使用化学发光仪检测其酶活性（图 3）。为排除荧光素酶本身受处理影响的可能性，实验中同时在 ...
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讨论
本方案描述的方法简单且可重复，适用于研究 体内 蛋白质-蛋白质相互作用，尤其适用于检测外源处理条件下蛋白质相互作用的动态变化。该实验的关键步骤是 N. benthamiana 浸润。为确保浸润成功，植物必须非常健康。另一个关键因素是浸润后何时检测荧光素酶活性。该问题没有统一答案。建议研究人员在浸润后的不同天数监测荧光素酶活性，以判断荧光光素酶表达达到最高水平的时间，因为我们观察到蛋白表达水平随时间发生波动。8.
在某些实验中可能无法检测到发光信号。若无适当的对照，无法排除假阴性结果的可能性。需要设置全长荧光素酶对照，以验证侵染过程及荧光素酶检测系统的有效性。如果在疑似存在蛋白相互作用的配对中仍然未检测到发光信号，则需通过免疫印迹实验检测蛋白表达情况，以排除一个或两个蛋白未能成功表达的可能性。最后一种可能是，由于蛋白构象的原因，蛋白相互作用可能阻碍了荧光素酶的互补。若出现这种情况，使用截短的蛋白或交换N端荧光素酶（N-Luc）与C端荧光素酶（C-Luc）的融合方向，将有助于解决这一问题。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到江苏省自然科学基金（BK20140919）、国家自然科学基金（31470375）、江苏省高校优势学科建设工程以及青蓝工程的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 转化溶液 | |||
| 10 mM 吗啉乙磺酸 | VETEC | V900336 | |
| 27.8 mM 葡萄糖 | VETEC | V900392 | |
| 10 mM MgCl₂2×6H2O | VETEC | V900020 | |
| 150 μM 乙酰丁香酮 | ALDRICH | D134406 | |
| pH 5.7 | |||
| 荧光素工作缓冲液 | |||
| 5 mM 荧光素钾盐 | GOLD BIOTECHNOLOGY | LUCK-100 | |
| 0.025% Triton X-100 | VETEC | V900502 | |
| H20 到 10 毫升 |
参考文献
- Thines, B., et al. JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling. Nature. 448, 661-665 (2007).
- Chini, A., et al. The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling. Nature. 448, 666-671 (2007).
- Jones, A. M., et al. Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis. Science. 344, 711-716 (2014).
- Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map. Science. 333, 601-607 (2011).
- Yazaki, J., et al. Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).
- Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
- Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40, 428-438 (2004).
- Chen, H., et al. Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants. Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis. Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).
- Schuck, P. Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors. Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).
- Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling. Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).
- Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light. Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).
- Lian, H. L., et al. Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism. Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).
- Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis. Curr Biol. 21, 841-847 (2011).
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重印与许可
