抗体类药物对小鼠骨髓和腹腔巨噬细胞活化影响的评估

摘要

基于抗体的药物已彻底改变了炎症性疾病的治疗方法。除了对特定靶点产生直接作用外，抗体还可激活巨噬细胞，使其转化为抗炎表型。本实验方案描述了如何评估抗炎巨噬细胞的活化状态。 体外 使用小鼠骨髓来源巨噬细胞，以及 体内 使用腹腔巨噬细胞。

摘要

巨噬细胞是具有吞噬功能的天然免疫细胞，可启动针对病原体的免疫应答，并参与组织修复与再生。巨噬细胞在终止炎症反应过程中同样发挥重要作用。我们已证实，经静脉注射免疫球蛋白（IVIg）刺激的巨噬细胞在受到细菌脂多糖（LPS）刺激时，可产生大量抗炎性细胞因子白细胞介素10（IL-10），同时分泌较低水平的促炎性细胞因子。IVIg是一种多价抗体，主要成分为来自超过1,000名献血者血浆混合的免疫球蛋白G（IgGs），用于补充免疫缺陷患者的抗体，或抑制自身免疫性疾病及炎症性疾病患者的免疫反应。此外，治疗性抗肿瘤坏死因子α（TNFα）抗体英夫利昔单抗（infliximab）也被证实可激活巨噬细胞，在炎症刺激下产生IL-10。IVIg及其他基于抗体的生物制剂可用于检测其对巨噬细胞活化的影响。本文描述了由小鼠骨髓来源巨噬细胞的分离、抗体刺激及其活化评估的方法 体外 以及用抗体激活的小鼠腹腔巨噬细胞 体内最后，我们展示了如何利用蛋白质印迹法（western blotting）来确定特定细胞信号通路在抗炎型巨噬细胞活性中的作用。这些实验方案可用于基因修饰小鼠，以评估特定蛋白对抗炎型巨噬细胞活化的影响。这些技术还可用于评价特定生物制剂是否通过诱导巨噬细胞转化为可产生IL-10的抗炎活化状态，从而减轻炎症反应。 体内这可以提供关于巨噬细胞活化在小鼠疾病模型中对抗体类生物制剂疗效所起作用的信息，并有助于揭示其在人体中可能存在的新作用机制。相反，这也可能警示在治疗感染性疾病时应谨慎使用特定的抗体类生物制剂，特别是当巨噬细胞在宿主抵御该感染中发挥重要作用时。

引言

巨噬细胞是天然免疫细胞，在应对感染或损伤的免疫反应中发挥多种作用。巨噬细胞负责启动针对感染或组织损伤的免疫反应，终止炎症反应，并促进修复反应¹。三种研究最为深入的巨噬细胞活化状态示例如下：1）经干扰素γ（IFNγ）和细菌脂多糖（LPS）处理的巨噬细胞，记为M(IFNγ + LPS)，这类细胞参与炎症反应；2）经白细胞介素4（IL-4）刺激的巨噬细胞，记为M(IL-4)，与修复反应相关；3）经免疫复合物（IC）和LPS共同刺激的巨噬细胞，记为M(IC + LPS)，具有关闭炎症反应的能力^2,3。M(IC + LPS)与M(IL-4)型伤口修复巨噬细胞不同，不表达精氨酸酶（Arg-1）或FIZZ1⁴。这类抗炎巨噬细胞的最佳标志是其细胞因子的产生情况⁵。巨噬细胞在维持健康方面具有多种功能，但也参与炎症性疾病和癌症的发生发展³。因此，巨噬细胞是治疗多种疾病的重要治疗靶点。研究抗体对其活化状态的影响，对于开发基于巨噬细胞的疾病治疗方法至关重要。

本文的重点是利用小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）和腹腔巨噬细胞来检测抗体药物对炎症反应的影响 体外 和 体内....

方案

本文所述所有方法均已获得不列颠哥伦比亚大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 骨髓巨噬细胞的衍生及其抗体激活

1. 使用 CO₂ 窒息法实施安乐死。
   1. 将小鼠放入诱导室中，用 5% 异氟烷麻醉 60 - 90 秒，直至小鼠不动且呼吸深而缓慢。
   2. 关闭异氟烷麻醉，以 6 - 8 L/min 的流速通入 CO₂，直至小鼠停止呼吸。继续维持 CO₂ 至少 5 分钟。确认无心跳和呼吸后，实施颈椎脱位以确保死亡。
      注：8 - 12 周龄的小鼠可获得最高产量的巨噬细胞。
2. 用 70% 乙醇喷洒小鼠腿部，并将其四肢伸展仰卧固定于泡沫板上。用剪刀和镊子夹住皮肤，在每条后肢表面做浅切口（0.2 cm），去除皮肤和毛发。
   注：本步骤及所有组织培养操作均应在无菌操作台中进行。
3. 修剪肌肉以暴露胫骨和股骨。在髋关节下方和踝关节上方切断骨骼和肌肉，取出胫骨和股骨，并尽可能去除附着的肌肉。
4. 用 70% 乙醇喷洒骨骼，静置 1 分钟使其挥发，然后将骨骼放入含骨冲洗培养基（Iscove 改良杜尔贝科培养基（IMDM），10% 胎牛血清（FBS））的 6 孔板中。
5. 在踝端和股骨顶端各切除约 0.1 cm 骨组织，暴露骨髓腔。确保可见骨髓....

结果

从小鼠骨髓中分离的骨髓源性巨噬细胞可由骨髓穿刺物中的造血细胞前体体外培养获得。一只C57BL/6小鼠股骨和胫骨的骨髓穿刺物混合后通常可获得10⁷个细胞⁷ 骨髓来源的巨噬细胞，是实验中获取巨噬细胞的便捷来源。在受到炎症刺激时，BMDMs可用于检测基于抗体的药物反应 体外. 图1 表明静脉注射免疫球蛋白品牌 Gammunex（GX）联合 LPS 可使抗炎细胞因子 IL-10 的产量较单独使用 LPS 刺激增加 7 倍（图1A) 并减少 IL-12/23p40 的产生（图1B). 图1 还表明不同的静脉注射免疫球蛋白（IVIg）制剂具有不同的效果。尽管三种不同的IVIg制剂均能显著降低IL-12/23p40

讨论

巨噬细胞的活化状态在组织稳态和疾病中均发挥重要作用²²巨噬细胞可具有不同且部分重叠的活化状态，具体取决于其微环境中所接收的信号³它们在炎症反应的各个阶段均发挥独特作用：抵御病原体、促进伤口愈合与组织修复；此外，还具有独特的抗炎激活状态，对终止炎症反应至关重要。²抗炎型巨噬细胞的活化需要两种外部刺激，以促使巨噬细胞产生大量抗炎性细胞因子IL-10，并产生少量促炎性细胞因子（如IL-12）。²³一个信号来自抗体通过Fcγ受体的作用，第二个信号则是促炎刺激，例如LPS或IFNγ。^24,25血清、免疫复合物和抗TNFα抗体均被发现可诱导巨噬细胞产生高水平的IL-10，从而进入抗炎性活化状态^8,23,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Iscove’s 改良 Dulbecco’s 培养基 (IMDM)	Life technologies	12440053
胎牛血清 (FBS)	Life technologies	12483-020
重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子 (MCSF)	Stemcell technologies	78059
青霉素-链霉素	Life technologies	15140148
单硫代甘油 (MTG)	Sigma	88640
1× 红细胞裂解缓冲液	eBioscience
细胞解离缓冲液	Life technologies	13150016	无酶，基于 Hanks 液，含 EDTA
脂多糖 (LPS)	Sigma aldrich	L 4516	来源于大肠杆菌 E. coli 0127:B8
静脉注射免疫球蛋白 (IVIg, Gammunex)	Grifols	由不列颠哥伦比亚儿童医院输血医学科提供
静脉注射免疫球蛋白 (IVIg, Gammagard liquid)	Baxter Healthcare Corporation	由不列颠哥伦比亚儿童医院输血医学科提供
静脉注射免疫球蛋白 (IVIg, Octagam)	Octapharma	由不列颠哥伦比亚儿童医院输血医学科提供
磷酸盐缓冲液 (PBS)（无菌），pH 7.4	Life technologies	10010023
小鼠 IL-10 ELISA 试剂盒	BD biosciences	555252
小鼠 IL-12/23p40 ELISA 试剂盒	BD biosciences	555165
抗 Erk1/2 抗体	Cell signalling technology	9101
抗 pp38 抗体	Cell signalling technology	9211
抗 GAPDH 抗体	Fitzgerald industries	10R-G109A
26 号针头	BD biosciences	305110
1 mL 注射器	BD biosciences	309659
10 mL 注射器	BD biosciences	309604
15 mL 圆底离心管	BD biosciences	352096
50 mL 圆底离心管	BD biosciences	352070
微量离心管 (1.7 mL)	Diamed	SPE155-N
75 cm2 组织培养处理培养瓶	BD biosciences	353136
细胞刮刀	BD biosciences	353085
镊子	VWR	82027-386	细尖头，用于解剖
剪刀	VWR	82027-582	精细型，4 1/2"
明场显微镜	Motic	AE31	倒置相差显微镜
天平	Mettler	PE 3000