本文介绍了在小鼠胚胎发育过程中对造血干细胞前体进行克隆分析的方法。我们将来自胚胎主动脉-性腺-中肾区域的单个细胞进行索引分选，结合内皮细胞共培养和移植实验，以表征单个造血前体细胞的表型特征及其植入潜能。
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本文内容
摘要
摘要
在胚胎发育过程中研究造血干细胞（HSC）的生成能力，一直受到早期胚胎中HSC前体细胞极为稀少以及缺乏能够功能性鉴定单个潜在HSC前体细胞长期多系移植潜能的检测方法的限制。本文描述了一种可在单细胞水平上分离和鉴定功能验证的HSC前体细胞的方法。首先，我们采用索引分选技术，对每一个单独分选的细胞，利用一组表型标志物组合记录其精确的表型参数，以富集HSC前体细胞，并附加其他标志物用于实验分析。其次，将每个经索引分选的细胞与来自主动脉-性腺-中肾（AGM）区域的血管微环境基质细胞共培养，该微环境可支持无移植能力的HSC前体细胞成熟为具有多系、长期移植潜能的功能性HSC，这一点可通过移植实验加以验证。该方法能够将克隆性造血前体细胞的表型特征与其功能移植潜能或其他特性（如转录谱）相关联，从而实现对HSC前体细胞在单细胞水平上的发育过程进行深入分析。
引言
克隆研究表明，成体造血干细胞（HSC）在长期植入特性方面存在异质性，这为HSC亚型及其在衰老过程中行为变化提供了新的认识1。然而，对胚胎期HSC及其前体细胞的类似研究则更具挑战性。在早期胚胎发育过程中，HSC由一群称为生血性内皮的前体细胞通过一个短暂的过程产生，该过程被称为内皮向造血转变2。在小鼠胚胎中，直到胚胎第10.5天（E10.5）之后，才能检测到具有强大、长期多系植入能力的首个HSC，且其频率极低3。在发育过程中，由生血性内皮产生的HSC前体（pre-HSC）必须经历成熟阶段，才能获得成体HSC的特性，从而在移植实验中实现有效植入4,5,6。由于在HSC从前体细胞出现之前，已可检测到大量具有红系、髓系和淋巴系潜能的造血祖细胞，这使得对稀有HSC起源的研究变得复杂7,8。因此，要区分pre-HSC与其他造血祖细胞，需要采用克隆分离细胞的方法，并提供足以促使其成熟为HSC的信号，以便在移植实验中检测其植入特性。
已描述了多种方法，....
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方案
本文所述所有方法均已获得弗雷德·哈钦森癌症研究中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 共培养用 AGM-EC 单层细胞的制备
- 在进行AGM解剖和分选前24小时，制备 AGM-EC 培养基过滤除菌。
- 向96孔板的每个孔中加入0.1%的水溶液明胶（100 µL/孔），室温孵育15分钟。吸除明胶溶液，将板置于组织培养超净台中，移除盖子，晾干孔内液体至干燥。
- 消化AGM-EC单层细胞并接种至96孔板中。
注意：维持此前所述方法制备的AGM-EC16，在AGM-EC培养基中。为保持一致性，应在获得足够数量的细胞后立即冻存AGM-EC细胞系（通常为第1至第3代），并在共培养实验中使用特定代次的细胞（通常为第5至第12代）。AGM-EC细胞系来源于C57BL/6J（CD45.2）AGM。参见 材料表 所有培养基成分。- 吸去75 cm²培养瓶中AGM-EC培养物的培养基2 烧瓶中加入5 mL PBS。吸除PBS，加入3 mL胰蛋白酶溶液（参见 材料表).
- 37 °C 孵育 2-4 分钟，直至大多数细胞从培养板上脱落。加入 7 mL AGM-EC 培养基，使用 10 mL ....
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结果
图1A展示了实验设计的示意图。在分离、合并并用胶原酶消化P-Sp/AGM组织后，使用VE-Cadherin和EPCR抗体对细胞进行染色，用于索引分选。前体造血干细胞（Pre-HSC）富集于VE-Cadherin+EPCRhigh分选的细胞中（图1B）。也可加入其他荧光染料偶联抗体，以回溯分析额外的表型参数，这些参数在索引分选过程中对每个细胞进行记录。在此来自E11期AGM组织的代表性实验中，细胞还使用了FITC偶联的抗CD45抗体和PE偶联的抗CD41抗体进行染色。在VE-Cadherin+EPCRhigh细胞群体中，可观察到这些造血特异性标志物存在异质性（图1C），这与该发育阶段已知的造血过程不同步性一致5。
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讨论
在胚胎发育过程中研究造血干细胞（HSC）的生成，需要能够检测尚不具备在移植成年受体中实现长期多系造血重建能力的造血前体细胞中HSC潜能的方法。本实验方案介绍了一种通过在主动脉-性腺-中肾区（AGM）来源的血管生态位内皮细胞（ECs）上进行基质共培养，对胚胎造血前体细胞进行克隆水平检测的方法，该体系可支持前体细胞向HSC的成熟，并可通过后续的移植功能实验进行分析。结合索引分选技术，可对实验中所包含的表面标志物定义的前体造血干细胞（pre-HSC）特性进行表型参数的回溯性分析。因此，该方法相较于依赖前体细胞群体批量分选并结合再聚集型HSC检测的其他方法4,5,10具有优势，能够在高效筛选pre-HSC潜在标志物的同时，提供每个单细胞表面标志物相对表达水平的信息。例如，利用该方法，我们此前报道过，除了使用EPCR富集不同发育阶段的pre-HSC群体外，Notch配体Dll4的中等水平表达进一步界定出具有HSC潜能的克隆性VE-Cadherin+
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Fred Hutchinson流式细胞术核心实验室的Andrew Berger、Stacey Dozono和Brian Raden在FACS方面的协助。本研究工作得到了美国国立卫生研究院心肺血液研究所（NHLBI）UO1资助项目#HL100395、辅助协作资助项目#HL099997以及糖尿病消化肾脏疾病研究所（NIDDK）资助项目#RC2DK114777的支持。Brandon Hadland获得了Alex's Lemonade Stand基金会和Hyundai Hope on Wheels基金会的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AGM-EC 培养基 | |||
| 内皮细胞培养材料 | |||
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | 用于解离 AGM-EC 单层细胞 |
| 0.1% 水溶液明胶 | StemCell Technologies | 7903 | 用于使 AGM-EC 单层细胞黏附于塑料表面 |
| 96 孔组织培养板 | Corning | 3599 | 用于共培养 AGM-EC 单层细胞与索引分选克隆 |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 (PBS) | Gibco | 14190-144 | 用于解剖及 FACS 染色 |
| 500 ml 滤瓶 | Fisher Scientific | 9741202 | 用于无菌过滤内皮细胞培养基 |
| AGM-EC 培养基 (500 ml) | |||
| 伊氏改良杜氏培养基 (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 ml |
| Hyclone 胎牛血清 | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 ml |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | 5 ml |
| 肝素 | Sigma | H3149 | 50 mg 溶于 10 ml 培养基中 |
| L-谷氨酰胺 (200 mM) | StemCell Technologies | 7100 | 5 ml |
| 内皮细胞有丝分裂原 (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | 加入 10 ml 培养基溶解后添加 |
| AGM 索引分选材料 | |||
| 胶原酶 (0.25%) | StemCell Technologies | 7902 | 用于胚胎组织解离 |
| 3 ml 注射器 | BD Biosciences | 309657 | 用于无菌过滤 FACS 抗体溶液 |
| 0.22 µm 注射器驱动滤器 | Millipore | SLGP033RS | 用于无菌过滤 FACS 抗体溶液 |
| 带细胞滤帽的 5 ml 聚苯乙烯管 | Corning | 352235 | 用于 FACS 前去除细胞团块 |
| DAPI（以 H2O 配制为 1 mg/ml 储存液） | Millipore | 268298 | 用于在分选时排除死细胞 |
| 抗小鼠 CD16/CD32（FcR 阻断剂） | BD Biosciences | 553141 | 用于阻断 Fc 受体的非特异性染色 |
| AGM 索引分选抗体 | |||
| 抗小鼠 CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | 染色 |
| 大鼠 IgG1 κ 同型对照，PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | CD144 PE-Cyanine7 的同型对照 |
| 抗小鼠 CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | 染色 |
| 大鼠 IgG2b κ 同型对照，PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | CD201 PerCP-eFluor710 的同型对照 |
| 抗小鼠 CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | 染色 |
| 大鼠 IgG1 κ 同型对照，PE | BD Biosciences | 553925 | CD41 PE 的同型对照 |
| 抗小鼠 CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | 染色 |
| 大鼠 IgG2b κ 同型对照，FITC | eBioscience | 11-4031-81 | CD45 FITC 的同型对照 |
| AGM 无血清培养基 (10 ml) | |||
| X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 ml |
| 重组小鼠干细胞因子 (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 µl（100 mg/ml 储存液），终浓度 100 ng/ml |
| 重组人 FLT3 配体 (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 µl（100 mg/ml 储存液），终浓度 100 ng/ml |
| 重组人血小板生成素 (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 µl（100 mg/ml 储存液），终浓度 20 ng/ml |
| 重组小鼠白细胞介素-3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 µl（100 mg/ml 储存液），终浓度 20 ng/ml |
| 共培养细胞染色材料 | |||
| 96 孔 V 型底板 | Corning | 3894 | 用于 FACS 分析 |
| 与内皮细胞共培养的索引分选克隆分析抗体 | |||
| 抗小鼠 CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | 染色 |
| 大鼠 IgG2b κ 同型对照，PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | CD45 PerCP-Cyanine5.5 的同型对照 |
| 抗小鼠 CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | 染色 |
| 大鼠 IgG2b κ 同型对照，PE | eBioscience | 12-4031-81 | CD201 PE 的同型对照 |
| 抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | 染色 |
| 大鼠 IgG2a κ 同型对照，APC | eBioscience | 17-4321-81 | Ly-6A/E APC 的同型对照 |
| 抗小鼠 F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | 染色 |
| 大鼠 IgG2a κ 同型对照，FITC | eBioscience | 11-4321-41 | F4/80 FITC 的同型对照 |
| 抗小鼠 Ly-6G/C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | 染色 |
| 大鼠 IgG2b κ 同型对照，FITC | BD Biosciences | 556923 | Ly-6G/C 和 CD3 FITC 的同型对照 |
| 尾静脉移植注射材料 | |||
| 1/2 ml 胰岛素注射器，配 29G 1/2" 针头 | BD Biosciences | 309306 | 用于尾静脉移植注射 |
| 移植后外周血分析抗体 | |||
| 抗小鼠 Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | 染色 |
| 大鼠 IgG2b κ 同型对照，PerCP | Biolegend | 400629 | Ly-6G/C PerCP 的同型对照 |
| 抗小鼠 F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | 染色 |
| 大鼠 IgG2a κ 同型对照，PE | eBioscience | 12-4321-80 | F4/80 PE 的同型对照 |
| 抗小鼠 CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | 染色 |
| 抗小鼠 CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | 染色 |
| 大鼠 IgG2a κ 同型对照，APC | BD Biosciences | 553932 | CD19 APC 的同型对照 |
| 抗小鼠 CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | 染色 |
| 大鼠 IgG2a κ 同型对照，PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | CD45.1 PE-Cyanine7 的同型对照 |
| 抗小鼠 CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | 染色 |
| 大鼠 IgG2a κ 同型对照，APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | CD45.2 APC-eFluor780 的同型对照 |
| 设备 | |||
| BD FACSAria II 配 DIVA 软件 | BD Biosciences | ||
| BD FACSCanto II 配微孔板读取器 | BD Biosciences | ||
| 血细胞计数板 | Fisher Scientific | S17040 | 用于细胞计数 |
| 多通道移液器 | Fisher Scientific | 14-559-417 | 用于加样细胞 |
| FACS 分析软件 | FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo |
参考文献
- Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
- Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development.
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