小鼠涎腺功能的测定方法

唾液腺产生唾液, 以响应各种神经和机械刺激¹。刺激是通过交感神经和副交感神经系统的肾上腺素和胆碱受体在腺体。匹罗卡品是一种胆碱能交感神经剂, 主要作用于毒蕈受体。在唾液腺, 它通过作用于毒蕈乙酰胆碱受体 M3¹来诱导唾液的产生。在匹罗卡品管理的唾液生产是一个指标的能力, 唾液腺反应刺激和通常使用作为衡量唾液腺功能。

唾液生产的准确测量是研究涎腺疾病的关键, 包括干燥氏综合征²和头颈癌治疗后的辐射损伤³。几种不同的方法已经被开发, 以测量唾液生产啮齿动物。这些包括排泄涎腺导管的直接插管⁴, 从口腔中收集的唾液在真空下的⁵, 并收集使用玻璃毛细管⁶或微^7,8,9. 唾液腺导管的直接插管提供了最准确和纯净的唾液。然而, 这是一个技术上具有挑战性的过程, 和潜在的造成导管损伤排除重复唾液收集来自同一动物。在真空中收集唾液会导致因唾液从管子中干燥而产生的变化。这种损失是进一步夸大小鼠与减少流涎。玻璃毛细管允许收集唾液进行后续分析, 但是, 在患病状态下分泌的唾液粘度的变化防止毛细血管的有效充填。此外, 试图清扫口腔, 以收集残留的唾液可能导致伤害。吸管方法允许完全收集, 对于同一个算子, 它在实验之间是非常一致的。但是, 由于未知的原因, 此方法在不同运算符之间显示出显著的差异。因此, 要允许进行适当的比较, 同样的操作者必须执行与特定项目相关的所有实验。显然, 这是一个实验室的主要劣势。

为了克服这些问题, 制定了一个程序, 将唾液收集方法用于人类和啮齿动物。用棉签法测定匹罗卡品引起的唾液体积简单、重现性好, 不受操作者影响, 可在同一动物中重复进行。此外, 它允许收集唾液, 随后分析蛋白质, 免疫球蛋白, 或其他生物分子。

下文所述的议定书得到了机构动物保育和使用委员会的批准, 并遵循了国家卫生研究院制定的道德准则。本报告所列的所有数据都是使用10-12 周龄的雌性小鼠产生的。使用的小鼠如下: C57BL/6, balb/c, DBA1, 129S, 和 (B6XA/J) F1。所有小鼠都被安置在屏障笼 (每笼5只动物) 的特定无病原体条件, 并提供饲料和水 ad 随意。

1. 准备

1. 要准备一份盐酸匹罗卡品的溶液, 重10毫克的化合物, 并将其溶于1.776 毫升的无菌等渗盐水中, 由涡流, 给出一个5.63 毫克/毫升的股票溶液。没有必要对此解决方案进行消毒。但如果需要, 通过0.2 µM 过滤器过滤。将此库存解决方案存储在-80 ^oC 冰箱中的多个等分中, 可长达3月。每一个冷冻库存是一次性使用。一旦解冻, 不要冻结的匹罗卡品溶液。
2. 采取0.6 毫升离心管, 并小心地打在每个管底部的一个小孔与一个加热的18口径针。将这些管子设置成2毫升的管子。管子不必是无菌的。
3. 使用锋利的无菌刀片, 将圆柱形吸水棉签切成2厘米长的碎片。斜切每2厘米的一块, 给2圆锥状的棉签。在0.6 毫升离心管中每一个都放一个棉签。
4. 称0.6 毫升离心管含有干拭子。
5. 把老鼠转移到一个新的干净的笼子里, 用水瓶来研究。在开始收集唾液之前, 将没有食物的小鼠保持至少2小时, 以防止食物颗粒污染所收集的唾液。
   注意: 此过程不需要保持每笼1鼠标。然而, 在每个笼子里放置的老鼠数量取决于具体机构的动物使用规则和规定。
6. 在2小时结束前, 准备工作的匹罗卡品解决方案 (0.0563 毫克/毫升), 稀释的库存溶液100x 在无菌盐水。这是没有必要进一步过滤消毒这个解决方案。在冰上始终保持工作的匹罗卡品解决方案。
   注:表 1给出了用于一系列鼠标体重的匹罗卡品的数量, 以给出0.375 毫克/千克体重的最终剂量。

2. 程序

1. 使用表 1对每个鼠标进行权衡, 并确定每个鼠标的麻醉组合剂量。将第一只老鼠注射到腹腔内的麻醉药的适当容积。设置2分钟的定时器 (在这个协议中测试的大多数小鼠菌株去睡觉2分钟)。当放置在平坦的表面上时, 确保鼠标被正确地麻醉。如果鼠标仍在行走, 请等待额外的2分钟, 然后再继续下一步。应用一滴润滑油眼膏, 以防止干燥。
   注: 在表 1中, 麻醉剂混合物的剂量是0.007 毫升/克体重。这个过程的最佳范围是0.006 到0.008 毫升/克体重。然而, 4 分钟后, 如果鼠标仍然行走或表现出生涩的运动, 请咨询机构兽医适当增加麻醉剂量。
2. 使用表 1确定用于鼠标的匹罗卡品的剂量, 并通过腹腔内路由注入适当的量。将定时器设置为2分钟, 并将鼠标插入50毫升抑制剂管, 直到头部和耳朵伸出切口为止。将管子置于45度角, 头部向下, 腹面朝上。把管子贴到手术板上, 防止它移动。
   注:表 1为小鼠提供了17克以上的剂量, 因为这一过程没有尝试对体重低于17克的小鼠。
3. 在2分钟结束时, 轻轻地将一双闭合的显微解剖钳插入口中, 并将下颚向上提起以打开嘴巴。把镊子1-2 毫米进一步推入口中, 确保舌头被看见放在钳子的顶臂上。用另一对精致的镊子, 按住前称的干拭子接近其锥形尖端。
4. 轻轻地将拭子的锥形尖端滑入口中。取出镊子, 在口腔中留下棉签的尖端。
5. 抓住更宽的棉签的一端延伸到嘴的外面, 旋转它以允许与嘴巴接触的最大面积。保持棉签在这个位置15分钟。
   注意: 这可确保拭子在收集期间保持在口中。请注意, 棉签的锥形尖端起到灯芯的作用, 拭子的较宽部分仍留在口腔外。
6. 在15分钟结束时, 轻轻旋转拭子以收集未被吸收的唾液, 并将湿拭子放入0.6 毫升离心管中。关闭管, 并设置在2毫升管放在冰。
   注: 此时, 口腔黏膜会出现完全干燥。现在, 老鼠可以被移回笼子里, 从麻醉中恢复过来。
7. 将鼠标移到笼子里。在唾液收集后将湿润的食物颗粒放在笼子里, 以帮助更快的补液。
   注意: 小鼠在收集结束后10分钟内醒来。皮下注射0.2 毫升预热等渗盐水也可给予加速恢复。
8. 继续下一只鼠标。所有的小鼠都应该被监测, 直到它们完全恢复并处于流动状态。

3. 测量

1. 在所有的收集结束, 重量0.6 毫升管与湿拭子。计算湿重和干重之间的差异以获得唾液的重量。将0.6 毫升管与唾液放回2毫升管。
2. 切断2毫升管子的盖子然后, 离心2毫升管2分钟在 7500 x g, 在4oC 在一个微型离心机, 以恢复唾液。测量用微获得的唾液体积。
3. 表达的结果为唾液重量 (mg)¹⁰超过15分钟或作为唾液重量 (mg)/小鼠体重 (g) 的比率。
   注: 如果从拭子中提取出的唾液量被测量出来, 则表明唾液体积 (毫升) 或唾液体积 (毫升)/小鼠体重 (g) 的比值。

在实验小鼠模型系统中, 以匹罗卡品刺激产生唾液的能力被用作唾液腺功能的指标。用拭子法测定了11周老 C57BL/6 雌性小鼠的唾液分泌。在图 1A中, 结果被表示为在增加的匹罗卡品之后收集的唾液量 (mg)。在1毫克/千克体重的剂量, 一些小鼠开始表现出窘迫 (不由自主的颤抖和颤抖)。因此, 在本研究中没有对1毫克/千克体重的匹罗卡品进行测试。在图 1B中, 结果以唾液重量 (mg) 与小鼠体重 (g) 的比值表示。总的来说, 这些数据显示了一个很好的剂量反应关系之间的匹罗卡品数量和唾液生产。还测量了从拭子中回收的唾液量。如图 1C所示, 唾液重量与体积之间有很大的一致性, 1 毫克的唾液等于0.001 毫升。

用拭子法获得的结果与用吸管收集法获得的效果相似。图 2A显示了用拭子法和吸管法收集的平均唾液量是非常相似的, 差异在统计学上并不显著。图 2B, 2C和2D表明, 拭子方法不影响唾液中生物分子的估计。事实上, 与吸管方法相比, 拭子法在总唾液蛋白 (图 2C)、唾液溶菌酶活性 (图 2D) 和唾液 IgA (图 2E) 的平均水平上呈总体较高的趋势。然而, 这些差异在统计学上并不显著。

这里描述的唾液收集方法能检测不同的小鼠品系 (图 3) 和不同疾病条件 (图 4) 诱发的涎腺功能产生的唾液数量的差异。图 3A显示了10-12 周前的雌性 C57BL/6、balb/c、DBA1/J 和129S6 小鼠的唾液产生的结果。与其他菌株相比, 129S6 小鼠产生的唾液含量最低。应该指出的是, 这些小鼠体重的差异没有明显的不同 (图 3B)。其次, 用拭子法检测涎腺功能, 并在图 4中显示了两个示例。图 4A显示了在注射脂多糖 (LPS) (10 µg/鼠腹腔) 后, 由于先天免疫激活而诱发的涎腺功能的典型结果。控制小鼠注射生理盐水11。与对照组相比, LPS 治疗的小鼠唾液明显下降。被动转移抗体反应与干燥氏综合征抗原 A/Ro52 诱导涎腺功能, 这个模型模仿某些方面的干燥氏综合征9。如图 4B所示, 注射佐剂明矾加 anti-Ro52 抗体的小鼠与未经治疗的小鼠或只用明矾处理的小鼠相比, 唾液产量显著降低。

该方法易于实现, 操作独立。图 5显示了10-13 周前的雌性 C57BL/6 小鼠的唾液分泌, 在6不同时间点的实验中, 2 不同的操作者进行了试验。操作员我开始仅2月的鼠标处理经验, 而操作员 II 有6月以前的鼠标处理经验, 但只介绍了唾液收集方法一周。这些数据是在几乎相隔一年的实验中产生的, 使用了0.375 毫克/千克的匹罗卡品。两个算子得到的唾液比值显示了一系列读数 (1.84 到 5.87)。操作员 i 的实验跨越了10周的时间, 而操作员 II 的实验是在将近一年后连续3天进行的 (图 5A)。值得注意的是, 随着时间推移获得的唾液比值没有显著差异 (p = 0.064;克鲁斯卡尔-沃利斯测试)。为了进一步比较间运算符的变化, 每个运算符的3实验中的唾液重量与每克体重的比值都汇集在一起, 并显示在图 5B中。由操作者获得的唾液比 (平均 + sem; 4.45 + 0.152, n=38) 与算子 2 (平均 + sem; 4.21 + 0.169; n=25; p = 0.296 由曼恩惠特尼测试) 没有显著差异。

图 1: 唾液产量取决于匹罗卡品剂量.C57BL6/J 的老鼠 (11 周大的雌性, 5 每组) 注射不同剂量的匹罗卡品 (0.25 毫克/千克, 0.5 毫克/千克和1.0 毫克/千克体重) 和唾液生产被测量为 15 min. (A)结果表示为毫克唾液量 (平均± SEM)。(B)数据表示为平均唾液比 (每克老鼠体重的毫克唾液)。(C)用拭子法收集了11周老的雌性 C57BL/6 小鼠 (n=5) 的唾液。匹罗卡品使用的剂量为0.375 毫克/千克体重。用湿拭子称量, 测量毫克唾液的数量。然后用离心法回收拭子中的唾液, 测定唾液的体积。µL 唾液重与唾液体积之间有显著的一致性.请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: 拭子方法不影响唾液中生物分子的分析.2组11周老雌性 C57BL/6 小鼠 (每组 n=5 小鼠) 的唾液是用拭子法或 micropipet 法收集的。平均体积的唾液 (a), 平均数量的蛋白质 (B), 平均数量的溶菌酶活性 (C), 和平均数量的 IgA 之间的2组统计不显著。请单击此处查看此图的较大版本.

图 3: 唾液收集法检测不同品系的小鼠唾液分泌的差异.(a)用匹罗卡品0.375 毫克/千克体重收集雌性 (10-12 周) 小鼠的唾液15分钟。(B)小鼠组间的平均体重没有显著差异。克鲁斯卡尔-瓦利斯试验分析了统计意义, 其次是邓恩的多重比较试验。一个 p < 0.05 被认为是重要的。请单击此处查看此图的较大版本.

图 4: 拭子方法检测涎腺功能.(a) (B6 X/J) F1 雌性小鼠注射了两种 LPS 溶液 (0.1 毫克/毫升, 每只老鼠0.1 毫升, 腹腔) 或生理盐水, 唾液在26小时后被测量。有代表性的实验表明, 在小鼠的唾液生产中有明显的 (p = 0.0079) 下降 (60%) 的 LPS 治疗。(B)在干燥氏综合征的实验小鼠模型系统中测定涎腺功能。以前公布的被动转移模型的诱导腺功能障碍使用4 , 很少修改。用明矾佐剂注射雌性 C57BL/6 小鼠 (10-12 周)。在天14和20小鼠注射0.05 毫升兔 anti-Ro52 血清和唾液生产后, 测量 24 h. 注意在用明矾和 anti-Ro52 血清治疗的小鼠唾液中有显著的 (p = 0.0003) 滴 (50%)。克鲁斯卡尔-瓦利斯试验分析了统计意义, 其次是邓恩的多重比较试验。一个 p < 0.05 被认为是重要的。请单击此处查看此图的较大版本.

图 5: 拭子方法在时间 (a) 和运算符 (B) 之间生成可重现的结果.拭子法显示了两个不同长度的操作者在一年内进行实验时的比较结果。C57BL/6 雌性小鼠 (10-13 周龄) 的基线唾液产量由每位操作者测量。结果被表达为唾液重量 (毫克/克体重)。唾液收集的日期在 X 轴上, 并且随着时间的推移收集的数据的结果显示为(A).每个数据点代表一个鼠标, 每次分析的小鼠数量显示在括号中。基线唾液比 (平均 + SEM) 汇集从3实验显示(B), 并没有显着不同的运营商之间。请单击此处查看此图的较大版本.

作者没有利益冲突透露。