唾液腺功能低下是自身免疫性疾病和放射治疗常见的后果。在这些疾病的动物模型中，对唾液腺功能进行可重复评估存在技术上的挑战。本文介绍了一种简单、准确且可重复测量小鼠唾液分泌的方法。
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摘要
摘要
干燥综合征是一种影响外分泌腺的自身免疫性疾病，患者会出现唾液腺炎症及唾液分泌减少。同样，接受头颈部肿瘤放疗的患者唾液分泌也严重受损。为模拟这些临床状况而建立的啮齿类动物模型，有助于理解疾病的发病机制，并推动新治疗策略的开发。因此，能够准确、可重复且多次地测定动物模型中唾液腺功能至关重要。在既往文献报道方法的基础上，本研究建立了一种符合上述标准的方法，并用于评估小鼠唾液腺功能。该新方法的另一优势在于易于掌握，且操作者之间的差异较小。唾液腺功能通过匹鲁卡品刺激后所产生的唾液量（重量或体积）或分泌速率（mL/min）来评估。所收集的唾液是分析蛋白质含量、免疫球蛋白浓度及其他生物分子的良好来源。
引言
唾液腺在多种神经性和机械性刺激下产生唾液1。这些刺激通过交感神经和副交感神经系统传递至腺体中的肾上腺素能受体和胆碱能受体。匹鲁卡品是一种胆碱能性、副交感神经拟似剂，主要作用于毒蕈碱型受体。在唾液腺中，它通过作用于M3型毒蕈碱型乙酰胆碱受体来诱导唾液分泌1。给予匹鲁卡品后唾液的分泌情况可反映唾液腺对刺激的反应能力，常被用作评估唾液腺功能的指标。
准确测量唾液分泌量对于研究唾液腺疾病（包括干燥综合征2以及头颈部肿瘤治疗后放射性损伤3）至关重要。目前已开发出多种用于啮齿类动物唾液分泌量测定的方法，包括对排泄性唾液导管进行直接插管4、在负压条件下从口腔收集唾液5，以及使用玻璃毛细管6或微量移液器7,8,9进行收集。直接插管法可获得最准确且纯净的唾液样本，但该操作技术难度较高，且可能造成导管损伤，因而无法在同一动物个体上重复进行多次唾液采集。采用负压收集唾液时，由于唾液在管内干燥，可能导致结果不稳定；在唾液分泌减少的小鼠中，这种损失更为显著。玻璃毛细管可用于收集后续分析所需的唾液，但在疾病状态下分泌的唾液黏度发生变化，会影响毛细管的充分填充。此外，试图清扫口腔以收集残留唾液的操作可能引起组织损伤。移液法能够实现唾液的完全收集，且对于同一操作者而言，实验间重复性极佳；然而，由于未知原因，不同操作者之间采用该方法时存在显著差异。因此，为了确保数据的可比性，必须由同一操作者完成特定研究项目的全部实验。显然，这对实验室而言是一个重大局限。
为解决这些问题，开发了一种结合人类与啮齿类动物唾液采集方法的技术。下文所述的用于测量匹罗卡品诱导唾液量的棉拭子法操作简单、可重复性强、不受操作者影响，并可在同一动物身上反复进行。此外，该方法还可收集唾液，用于后续对蛋白质、免疫球蛋白或其他生物分子的分析。
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方案
以下方案已获机构动物照护与使用委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院制定的伦理准则。本报告中所有数据均使用10至12周龄雌性小鼠获得。所用小鼠品系包括：C57BL/6、BALB/c、DBA1、129S以及(B6XA/J) F1。所有小鼠均饲养于屏障环境中（每笼5只），在特定病原体-free条件下饲养，并可自由获取饲料和饮水。
1. 准备
- 配制盐酸毛果芸香碱储备液时，称取10 mg该化合物，加入1.776 mL无菌等渗生理盐水，涡旋溶解，得到浓度为5.63 mg/mL的储备液。此溶液无需灭菌；如需要，可通过0.2 µM滤膜过滤除菌。将该储备液分装成多份，于-80 oC冰箱中保存，最长可保存3个月。每份冻存液仅限使用一次，解冻后不得再次冻存毛果芸香碱溶液。
- 取0.6 mL微量离心管，用加热的18号针头在每根管底部小心打一个小孔，然后将这些管放入2 mL离心管中。这些管无需无菌处理。
- 使用锋利且无菌的剃刀片，将圆柱形吸水棉签切成约2 cm长的小段，再将每段2 cm长的棉签沿对角线切割，得到两个锥形棉签。将每个锥形棉签放入一根0.6 mL微量离心管中。
- 称量装有干燥棉签的0.6 mL微量离心管的质量。
- 将待实验的小鼠转移至新的清洁笼具中，并提供饮水瓶。在开始采集唾液前至少禁食2小时，以防止食物残渣污染所收集的唾液。
注意：本操作无需每只笼子仅饲养一只小鼠，但每笼所放置小鼠的数量应遵循所在机构关于动物使用的具体规定和要求。 - 在禁食接近2小时时，用无菌生理盐水将储备液稀释100倍，配制工作浓度的毛果芸香碱溶液（0.0563 mg/mL）。该工作液无需进一步过滤灭菌。毛果芸香碱工作液须始终置于冰上保存。
注意：表1列出了为不同体重小鼠注射毛果芸香碱的用量，以达到0.375 mg/kg体重的终剂量。
2. 实验步骤
- 称量每只小鼠的体重，并根据表1确定每只小鼠麻醉混合物的剂量。通过腹腔注射途径向第一只小鼠注射适当体积的麻醉混合物。设置计时器为2分钟（本方案测试的大多数小鼠品系在2分钟内会进入睡眠状态）。将小鼠置于平坦表面，若其无法行走，则表明已充分麻醉。如果小鼠仍在活动，则需额外等待2分钟再进行下一步操作。在两只眼睛上各涂抹一滴润滑性眼膏，以防止角膜干燥。
注意：表1中麻醉混合物的剂量为每克体重0.007 mL，该操作的最佳剂量范围为每克体重0.006至0.008 mL。然而，若在4分钟后小鼠仍能行走或出现抽搐样动作，应咨询机构兽医，适当增加麻醉剂量。 - 根据表1确定小鼠的匹鲁卡品剂量，并通过腹腔注射途径注射相应剂量。设置计时器为2分钟，随后将小鼠放入50 mL的固定管中，使其头部和耳朵从切口端伸出。将固定管倾斜至45度角，头部朝下，腹面朝上。用胶带将固定管固定在操作板上，防止其移动。
注意：表1提供的剂量适用于体重超过17 g的小鼠，因为本操作尚未在体重低于17 g的小鼠中尝试。 - 2分钟结束后，轻轻将一对闭合的显微解剖镊插入小鼠口腔，向上抬起下颌以打开口腔。将镊子再向口腔内推进1–2 mm，确保舌头位于镊子上臂表面。用另一对精细镊子夹住预先称重的干燥棉签，靠近其锥形尖端处。
- 将棉签的锥形尖端轻轻滑入口腔。在撤出镊子的同时，保持棉签尖端留在口腔内。
- 握住伸出口腔外的棉签较宽一端，旋转棉签以使其与口腔内表面接触面积最大化。保持棉签在此位置15分钟。
注意：此举可确保棉签在整个采集过程中保留在口腔内。请注意，棉签的锥形尖端起到吸水芯的作用，而较宽部分则保留在口腔外。 - 15分钟后，轻轻旋转棉签以收集尚未被吸收的唾液，然后将湿润的棉签放入0.6 mL微量离心管中。盖紧管盖，并将其置于放置在冰上的2 mL离心管中。
注意：此时口腔黏膜将完全干燥。现在可将小鼠移回笼中，使其从麻醉状态中恢复。 - 将小鼠转移至笼中。在唾液采集完成后，向笼内放入湿润的食物颗粒，以促进更快地再水化。
注意：小鼠通常在采集结束后的10分钟内苏醒。也可皮下注射0.2 mL预温的等渗盐水，以加速恢复过程。 - 继续处理下一只小鼠。 所有小鼠均应持续监测，直至其完全恢复并能够自主活动。
3. 测量
- 所有采集结束后，称量装有湿润棉签的 0.6 mL 管。计算湿重与干重之间的差值，以获得产生的唾液重量。将含有唾液的 0.6 mL 管放回 2 mL 管中。
- 剪去 2 mL 管的管盖，然后在 4°C 条件下，于微量离心机中以 7500 × g 离心 2 分钟，以回收唾液。使用微量移液器测量所获得唾液的体积。
- 将结果表示为 15 分钟内唾液重量（mg）10，或唾液重量（mg）/小鼠体重（g）的比值。
注意：如果已测量从棉签中提取的唾液体积，则将结果表示为回收唾液体积（mL），或唾液体积（mL）/小鼠体重（g）的比值。
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结果
在实验小鼠模型系统中，通过匹鲁卡品刺激诱导唾液分泌的能力被用作评估唾液腺功能的指标。采用棉签法测定11周龄C57BL/6雌性小鼠的唾液分泌量。图1A中的结果以不同剂量匹鲁卡品刺激后收集到的唾液量（mg）表示。当剂量达到1 mg/kg体重时，部分小鼠开始出现不适反应（非自主性抖动和寒战），因此本研究未测试超过1 mg/kg体重的更高剂量。在图1B中，结果以唾液重量（mg）与小鼠体重（g）的比值表示。总体而言，这些数据表明匹鲁卡品剂量与唾液分泌量之间存在良好的剂量-反应关系。同时测量了棉签回收唾液的体积。如图1C所示，唾液重量与体积之间具有显著的一致性，其中1 mg唾液相当于0.001 mL。
采用拭子法获得的结果与移液管采集法获得的结果相似。
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讨论
唾液分泌是一个复杂的过程，受多种因素影响。因此，在实验动物中测量唾液腺功能可能具有挑战性。另一个挑战是，需要在同一只动物身上重复测量唾液腺功能，以确定疾病的发生时间或证明治疗后的恢复情况。
本报告所述的拭子法在技术上操作简便，并具有多种数据呈现方式。所获得的结果具有良好的可重复性，且操作者之间的差异较小。该方法能够检测不同唾液腺功能障碍模型中唾液分泌的减少。其显著优势在于使用了惰性、高吸水性的聚合物，并能高效回收所收集的唾液，从而实现对唾液生物分子的测定。该方法的另一优点是，单个操作者可同时对最多2只小鼠进行操作，相较于其他一些仅能逐只操作的方法，效率显著提高。
唾液分泌量测量的变异性一直是所有唾液测量技术的主要难题。为尽量减少变异性，必须严格遵守实验方案。关键步骤包括：选择每天相同的时间对小鼠进行禁食和唾液采集，准确给予麻醉剂和匹鲁卡品（表1），以及精确记录干、湿棉签的重量。进行唾液采集时，需仔细管理时间，每次最多同时准备2只小鼠。
如
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院、国立牙科与颅面研究所（DE025030）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 唾液采集用化学品 | |||
| 盐酸匹鲁卡品 | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | 用无菌等渗盐水稀释。将100倍浓缩储备液分装成单次使用量，于-80oC保存 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 麻醉混合液 | 在无菌小瓶中混合1 mL盐酸氯胺酮 + 0.5 mL 塞拉嗪 + 8.5 mL无菌等渗盐水。可使用3个月。 | ||
| Zetamine（盐酸氯胺酮） | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | 储备液浓度为100 mg/mL |
| Anased（塞拉嗪） | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | 储备液浓度为20 mg/mL |
| 无菌等渗盐水 | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | 用作稀释剂 |
| 人工泪液（润滑性眼用软膏） | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | 用于防止操作过程中眼睛干燥 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 唾液采集材料 | |||
| SalivaBio儿童唾液采集棉签 | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | 独立包装的棉签 |
| 50 mL聚丙烯管 | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | 将管底1 cm剪去。确保切口边缘光滑。 |
| 0.6 mL微量离心管 | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | 用加热的18号针头在管底打孔 |
| 2 mL微量离心管 | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| 带固定针头的胰岛素注射器 | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18号普通斜面针头 | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| 无菌手术刀片 #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| 显微解剖镊 | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | 带锯齿的角形尖端，0.8 mm，4"长度 |
| 标签胶带 | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 三通道计时器 | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| 分析天平 | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 诱导唾液功能障碍用化学品/试剂 | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | 溶于无内毒素水，配制成5 mg/mL储备液并储存。用无菌HBSS稀释至100 µg/mL，每只小鼠腹腔注射100 µL |
| Imject Alum佐剂 | Thermo Scientific | 77161 | 用无菌盐水1:1稀释。每只小鼠腹腔注射0.1 mL |
| 兔抗Ro52抗血清 | 实验室制备 | 用重组小鼠Ro52免疫兔子制备 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 唾液分析用化学品/试剂盒 | |||
| 唾液溶菌酶测定 | |||
| EnzChek溶菌酶检测试剂盒 | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | 按制造商说明书使用 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 采用夹心ELISA法测定唾液IgA | |||
| 小鼠IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | 夹心ELISA标准品，浓度范围为30 ng/mL至0.5 ng/mL |
| 未标记的山羊抗小鼠IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | 用碳酸盐缓冲液以1 µg/mL浓度包被 |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | 检测抗体，使用时稀释1:4000 |
| TMB底物 | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | 按制造商说明书使用 |
| Immulon 4HBX 96孔微量滴定板 | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 唾液蛋白测定 | |||
| Bio-Rad蛋白检测试剂浓缩液 | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | 按制造商说明书进行蛋白浓度测定 |
参考文献
- Proctor, G. B. The physiology of salivary secretion. Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).
- Fox, R. I. Sjögren's syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren's syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren's syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren's syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Cold Spring Harbor Protocols. Cold Spring Harb Protoc. , Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2006).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
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