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方法文章

移植脂肪组织来源的干细胞片以减少大鼠模型部分结肠切除术后渗漏

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DOI：

10.3791/57213

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2018年8月11日

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1Department of Clinical Sciences of Companion Animals, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University, 2Department of Otorhinolaryngology, Erasmus MC University Medical Center, 3Department of Clinical Sciences and Public Health, Faculty of Veterinary Science, Mahidol University, 4Department of Surgery, Erasmus MC University Medical Center, 5Department of Orthopaedics, Erasmus MC University Medical Center, 6Hill's Pet Nutrition Inc.

本文内容

摘要

本文介绍了一种在大鼠模型中将脂肪组织来源的干细胞（ASC）片层制备并移植到缝合不充分的结直肠吻合口上的方法。这一新型应用表明，ASC片层可减少结直肠吻合口漏的发生。

摘要

吻合口漏是结直肠手术后一种灾难性的并发症。尽管目前预防漏液的方法在临床上具有不同程度的疗效，但迄今为止仍缺乏理想的解决方案。利用脂肪来源干细胞（ASC）片进行干细胞治疗可能为解决这一问题提供新途径。由于ASC具有营养支持和免疫调节特性，被认为在促进组织愈合方面具有广阔应用前景。本文介绍了制备高密度ASC片的方法，并将其移植至大鼠结直肠吻合口处，以减少漏液的发生。ASC在温敏性培养皿中形成细胞片，可被轻松剥离。在移植当天，对大鼠实施部分结肠切除术，并完成五针缝合的结直肠吻合。每只大鼠立即移植一片ASC片。ASC片无需任何胶水、缝线或生物材料，即可自发黏附于吻合口部位。术后第3天和第7天分别处死动物组进行观察。与移植组动物相比，对照组动物吻合口脓肿和漏液的发生率更高。在本模型中，结直肠吻合术后移植ASC片操作成功，并与较低的漏液率相关。

引言

结肠部分切除术联合一期吻合术是一种常用于治疗多种结肠疾病（如结直肠癌、克罗恩病和憩室炎）的外科手术1,5。结直肠吻合术后最严重的并发症是吻合口漏3。尽管已识别出多种与吻合口漏相关的危险因素，但目前仍缺乏有效的预防措施4,5。

脂肪组织来源的基质细胞（ASCs）具有抗炎和营养特性6,7，这使得这些细胞成为再生治疗的有前景的候选者8。ASCs促进组织修复的效果已在多种组织中得到证实，如心肌、皮肤和食管9,10,11,12,13。然而，关于ASCs用于促进肠道愈合的研究报道较少。通过ASC包被的生物缝合线或ASC浆膜下注射将ASC局部移植至实验性结直肠吻合口，结果显示或未能改善愈合14，或尽管吻合口愈合情况更佳但仍未能预防吻合口漏的发生15。

将悬浮状态的脂肪来源干细胞（ASCs）局部移植，或与生物材料联合使用，可能伴随细胞滞留不足或移植细胞分布不均的问题11。细胞片技术16,17为ASCs的递送提供了一种创新方法18,19。因此，在先前的一项研究中，提出了一种新方法，即将形成细胞片的ASCs应用于实验性结直肠吻合术20。该研究证实，在大鼠模型中，ASC细胞片移植可有效降低部分结肠切除术后结直肠吻合口漏的发生率。本文报道了ASC细胞片的制备及其手术移植技术。

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方案

皮下腹部脂肪组织来自人类供体，已获得荷兰鹿特丹伊拉斯姆斯医学中心（Erasmus MC University Medical Center）医学伦理委员会批准（编号：MEC-2014-092）。所有动物实验均经荷兰鹿特丹伊拉斯姆斯医学中心动物实验伦理委员会批准（133-14-01）。

1. 人脂肪干细胞的分离与培养

  1. 为每1 g脂肪组织准备3 mL分离培养基。将低糖Dulbecco改良Eagle培养基（LG-DMEM）与10 g/L牛血清白蛋白（BSA）和1 g/L I型胶原酶混合。
  2. 在无菌生物安全柜中，使用无菌10号外科刀片、Adson-Brown组织镊和Metzenbaum剪刀将人皮下腹部脂肪组织（n = 8，均为女性，平均年龄40 ± 9岁）切成小块（0.5 cm）。
  3. 将切碎的组织储存于无菌玻璃培养基储存瓶中。称量切碎组织的总重量，并用预先配制的分离培养基开始消化（每瓶50 g脂肪组织加入150 mL分离培养基）。可通过将装有切碎脂肪组织和分离培养基的瓶子置于4 °C滚轴混合器上过夜，暂停本方案。次日将瓶子预热至室温25 °C，持续15分钟，然后继续下一步操作。
    注意：皮下腹部脂肪组织来源于接受乳房重建手术的供体，经Erasmus MC医学伦理委员会批准（# MEC-200），并遵循《人体组织适当二次使用行为准则》（"Proper Secondary Use of Human Tissue"）（<http://www.federa.org>）。仅使用未选择退出二次使用的供体的剩余脂肪组织。
  4. 在摇床培养箱中，于37 °C、150 rpm条件下，在无菌玻璃培养基储存瓶中消化切碎的脂肪组织1小时。
  5. 将消化后的溶液分装至50 mL离心管中，以390 × g离心10分钟。
  6. 配制培养基：在LG-DMEM中添加10%胎牛血清（FBS）、50 µg/mL庆大霉素和1.5 µg/mL两性霉素B。
  7. 离心后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于20 mL培养基（LG-DMEM添加10%胎牛血清（FBS）、50 µg/mL庆大霉素和1.5 µg/mL两性霉素B）中。再次以390 × g离心5分钟，并弃去上清液。
  8. 用10 mL培养基（LG-DMEM添加10% FBS、50 µg/mL庆大霉素和1.5 µg/mL两性霉素B）重悬细胞沉淀，并通过100 µm滤器过滤细胞悬液。
  9. 向50 µL细胞悬液中加入50 µL 3%乙酸/亚甲蓝溶液（用于红细胞裂解），混匀后取10 µL进行细胞计数。使用血细胞计数板进行细胞计数。然后以40,000个细胞/cm2的密度将细胞接种于培养基（LG-DMEM添加30% FBS、50 µg/mL庆大霉素和1.5 µg/mL两性霉素B）中。
  10. 将细胞置于37 °C、含5% CO2的湿润气氛中培养24小时。
  11. 培养后，用预热（37 °C）的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞以去除细胞碎片，并更换为含10% FBS的培养基，其中新鲜添加抗坏血酸-2-磷酸（25 µg/mL）和人重组成纤维细胞生长因子2（FGF2，1 ng/mL）。
  12. 当ASCs融合度达到90%时，使用标准0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（T175培养瓶使用3 mL）进行传代。3–5分钟后，加入10 mL培养基（LG-DMEM添加10% FBS、50 µg/mL庆大霉素和1.5 µg/mL两性霉素B）中和0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液。
    注意：先前已进行流式细胞术分析（使用常见ASC表面标志物）和三系分化实验，结果表明采用本方案分离的ASCs具有ASC特异性特征21,22。
  13. 用10 mL培养基（LG-DMEM添加10% FBS、50 µg/mL庆大霉素和1.5 µg/mL两性霉素B）洗涤T175培养瓶中的细胞，以250 × g离心8分钟。弃去上清液，将细胞重悬于1 mL培养基中，使用血细胞计数板进行细胞计数。
  14. 以8,000个细胞/cm2的密度将细胞接种于T175培养瓶中。
  15. 在进一步使用前，将剩余ASCs用含10%二甲基亚砜（DMSO）的培养基在液氮中冻存。

2. ASC 薄膜制备

  1. 使用1 mL胎牛血清（FBS）预包被温敏性培养皿（直径3.5 cm），然后将培养皿置于37 °C培养箱中孵育至少30分钟，再进行细胞接种。
  2. 采用标准的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液对ASCs进行消化，时间为3–5分钟（T175培养瓶使用3 mL）。若消化后存在细胞团块，需在计数前通过100 µm滤网过滤细胞悬液。
  3. 用含10% FBS的低糖DMEM（LG-DMEM）中和胰蛋白酶溶液（T175培养瓶使用10 mL），并将细胞悬液在250 × g条件下离心8分钟。弃去上清液，将细胞重悬于1 mL含10% FBS的LG-DMEM培养基中。
  4. 在用FBS完成温敏性培养皿的包被后，将培养皿从培养箱转移至37 °C预热板上，并吸除培养皿中的FBS。
  5. 以400,000个细胞/cm2的密度接种ASCs（每皿总共接种3.52 × 106个细胞，溶于2 mL培养基中）。
  6. 轻轻晃动培养皿，尽可能均匀地分布细胞。
  7. 将ASC细胞片在37 °C、含5% CO2的湿润环境中培养48小时。
    注意：接种ASCs后，应尽量减少打开培养箱门的次数，以避免温度下降，从而影响ASC细胞片的形成或导致已形成的细胞片过早脱落。

3. 部分结肠切除术与结直肠吻合术

  1. 使用1 L/min的异氟烷（1.5–5%）/氧气吸入诱导并维持雄性Wistar大鼠（体重250–355 g）的麻醉状态，并肌肉注射0.05 mg/kg的丁丙诺啡。
  2. 待动物进入全身麻醉状态后，通过反射测试评估麻醉深度。在眼睛上涂抹含维生素A的眼用软膏以防止干燥。当确认麻醉深度足以进行手术时，以无菌方式准备腹部区域：剃除腹部毛发，并用70%乙醇对术区喷洒两次。用无菌纸巾覆盖腹部。整个手术过程中采用无菌技术，并维持无菌区域。
  3. 使用无菌10号手术刀片做一条5 cm长的腹正中切口，并用梅岑鲍姆剪（Metzenbaum剪）扩大切口。识别并游离结肠，用生理盐水浸湿的纱布将结肠与其他腹腔器官隔开。在肠系膜中识别右结肠动脉、中结肠动脉和左结肠动脉，使用哈尔斯泰德蚊式钳钝性分离每条血管，并用不可吸收编织丝线4/0分别结扎各血管。
  4. 分离结肠段，范围为从盲肠远端1.0 cm处至尾侧肠系膜动脉上方0.5 cm处。使用梅岑鲍姆剪在健康结肠组织处横断。切除结肠段后，将两根长棉签经肛门插入远端结肠，再进入近端结肠断端，从而将结肠近端与远端对合。
  5. 在手术显微镜下，采用单层间断内翻缝合法，使用5针不可吸收单丝聚酰胺线（8/0）进行端-端吻合，形成缝合不充分的吻合口。间断缝合应贯穿结肠壁全层，打结位置置于管腔外。
  6. 将大鼠随机分为对照组或ASC膜片组。

4. ASC 片移植

  1. 将培养皿置于室温下冷却 40 分钟 体内 移植，以促进ASC片层的脱离。
    注意：脱离后，ASC 片层收缩至直径约 2 cm。脱离后至少 3–6 小时内，ASC 片层的活力保持较高水平20.
  2. 移除培养基，替换为1 mL无血清的LG-DMEM。
  3. 用无创镊子轻轻夹住ASC片的边缘，将ASC片的培养皿侧覆盖在吻合线上。
  4. 使用无创镊子将ASC片材在吻合线的上下方约0.25 cm处小心拉伸，并将其包裹于结肠周围。提起结肠，使ASC片材包绕至结肠背侧。
    注意：ASC片可自发黏附于吻合线处，无需使用组织胶或其他任何生物材料。对照组不接受任何额外处理。
  5. 移除棉签，更换手套和器械。将结肠放回腹腔。使用5/0可吸收编织聚乙醇酸线，连续缝合关闭腹腔-白线一层。使用5/0可吸收编织聚乙醇酸线，皮下组织与皮肤一层连续缝合。

5. 术后评估与随访

  1. 术后立即通过皮下注射5 mL温生理盐水对动物进行快速补液。将动物置于加热灯下以维持体温，并持续监测生命体征，直至动物恢复足够的意识以维持胸卧位。
    注意：接受手术的动物在完全恢复前不得与其他动物合笼。恢复后，允许自由饮水并饲喂常规大鼠饲料。为缓解术后疼痛，每6-8小时皮下注射一次0.05 mg/kg的丁丙诺啡，持续3天。本研究中未在任何时间点使用抗生素。
  2. 每日进行健康状况临床评估及体重监测。若动物健康评分极低或出现严重体重下降，应在麻醉状态下通过心脏穿刺放血实施安乐死 。
  3. 术后第3天或第7天，再次使用 1 L/min的异氟烷（1.5-5%）/氧气吸入麻醉大鼠（不使用丁丙诺啡），行U形切口重新开腹探查。检查腹腔内是否存在腹膜炎、狭窄、纤维性粘连及脓肿形成。对腹腔内及吻合口区域的粘连和脓肿严重程度进行评分。
  4. 通过向包含吻合口的结肠闭合段充气测定吻合口爆破压。记录首次出现气体泄漏时的压力值及破裂位置，以此作为爆破压。
  5. 处死动物后取出结肠，将包含结直肠吻合口的切除段用4%磷酸盐缓冲甲醛固定，随后进行石蜡包埋，并切成4 μm厚的组织切片。
  6. 在采集吻合口组织段后，立即于麻醉状态下通过心脏穿刺放血处死动物，并通过呼吸运动消失和心跳停止确认动物死亡。
  7. 进行组织化学染色，如苏木精与伊红（Hematoxylin & Eosin）染色和天狼星红（Picro Sirius red）染色，以及免疫组织化学染色，使用针对人线粒体、大鼠内皮细胞（抗CD34抗体）和免疫系统细胞（CD3+、CD163+）的特异性抗体。
  8. 将切片数字化以便计算机分析，并对不同动物组间进行比较。

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结果

本研究的流程图，展示了ASC片层培养以及结肠切除与吻合手术的操作步骤，见图1。图2展示了ASC片层的显微形态及其在脱离过程中和脱离后的宏观外观。图3展示了ASC片层脱离与移植的不同步骤。图4显示了术后3天吻合线处ASC片层的存在及其对渗漏的预防作用。

随访期用于评估结直肠吻合情况。不同的评估结果如图和表所示。与对照组动物相比，移植组动物在术后第3天发生吻合口裂开和渗漏的频率较低，在术后第7天形成脓肿的频率也较低。与对照组动物相比，移植组动物未出现明显的粘连或狭窄形成。表1显示了移植组与非移植组动物在随访期结束时的肉眼观察结果。

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讨论

吻合口漏是结肠切除术并行一期吻合术后最严重的不良事件。目前仍缺乏预防吻合口破裂和漏出的最佳技术。已有研究尝试局部应用多种生物材料，但结果不一25,26,27。细胞治疗的目标是通过组织替代或旁分泌分泌来刺激局部愈合，从而促进组织修复。

在此大鼠模型中，ASC片移植在技术上是成功的。临床和组织学评估表明，ASC片在减少结肠切除术后一期吻合的渗漏方面具有有效性。

将ASC细胞片移植至结直肠吻合口是结直肠外科领域的一种新方法。在本研究中，首次移植了高密度ASC细胞片。选择以细胞片形式递送ASC细胞，是基于既往研究报道的细胞片技术相较于传统细胞移植技术所具有的优势28,29。此外，选择ASC细胞还基于多项研究结果，这些研究证实了ASC细...

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披露

作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

致谢

作者感谢整形外科的 S.E.R. Hovius 教授、M.A.M. Mureau 博士以及所有外科医生在收集皮下脂肪组织方面提供的帮助。P. Sukho 在研究期间获得了荷兰奖学金项目（NFP-12/435）的资助。Y.M. Bastiaansen-Jenniskens 获得了荷兰关节炎基金会（LP11）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
低糖DMEMGibco, Life technologies22320022ASC分离与培养
I型胶原酶Gibco, Life technologies17100-01ASC分离
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA9418ASC分离
胎牛血清Gibco, Life technologies10270-106FBS，ASC分离与培养
含亚甲蓝的3%乙酸Stemcell Technologies7060ASC分离
庆大霉素Gibco, Life technologies15750-037ASC分离与培养
两性霉素BGibco, Life technologies15290-018ASC分离与培养
摇床（Gallenkamp环境摇床型号10X 400）Akribis ScientificF240ASC分离
离心机HettichlabRotina380ASC分离与培养
磷酸盐缓冲液Gibco, Life technologies14190-094PBS，ASC分离与培养
抗坏血酸-2-磷酸Sigma-AldrichA8960ASC分离与培养
人重组成纤维细胞生长因子2AbD SerotecAF-100-15FGF2，ASC分离与培养
胰蛋白酶EDTAGibco, Life technologies25200-056ASC培养
二甲基亚砜Sigma-AldrichD2650-5xDMSO，ASC冻存
温敏型培养皿Nunc Thermo scientific174904ASC片制备
不可吸收编织丝线4/0B Braun21151042手术
不可吸收单丝聚酰胺缝线8/0B BraunG1118170手术
可吸收编织聚乙醇酸缝线5/0B BraunC1048207手术

参考文献

  1. Kawahara, H., et al. Single-incision laparoscopic right colectomy for recurrent Crohn's disease. Hepatogastroenterology. 57 (102-103), 1170-1172 (2010).
  2. Saia, M., Buja, A., Mantoan, D., Agresta, F., Baldo, V. Colon Cancer Surgery: A Retrospective Study Based on a Large Administrative Database. Surg Laparo Endo Per. 26 (6), e126-e131 (2016).
  3. Snijders, H. S., et al. Meta-analysis of the risk for anastomotic leakage, the postoperative mortality caused by leakage in relation to the overall postoperative mortality. Eur J Surg Oncol. 38 (11), 1013-1019 (2012).
  4. Daams, F., Luyer, M., Lange, J. F. Colorectal anastomotic leakage: aspects of prevention, detection and treatment. World J Gastroentero. 19 (15), 2293-2297 (2013).
  5. Testini, M., et al. Bovine pericardium patch wrapping intestinal anastomosis improves healing process and prevents leakage in a pig model. PLoS One. 9 (1), e86627(2014).
  6. Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
  7. Mussano, F., et al. Growth Factor Profile Characterization of Undifferentiated and Osteoinduced Human Adipose-Derived Stem Cells. Stem Cells Int. , 6202783(2017).
  8. Hassan, W. U., Greiser, U., Wang, W. Role of adipose-derived stem cells in wound healing. Wound Repair Regen. 22 (3), 313-325 (2014).
  9. Shudo, Y., et al. Addition of mesenchymal stem cells enhances the therapeutic effects of skeletal myoblast cell-sheet transplantation in a rat ischemic cardiomyopathy model. Tissue Eng Pt A. 20 (3-4), 728-739 (2014).
  10. Otsuki, Y., et al. Adipose stem cell sheets improved cardiac function in the rat myocardial infarction, but did not alter cardiac contractile responses to beta-adrenergic stimulation. Biomed Res. 36 (1), 11-19 (2015).
  11. Hamdi, H., et al. Epicardial adipose stem cell sheets results in greater post-infarction survival than intramyocardial injections. Cardiovasc Res. 91 (3), 483-491 (2011).
  12. Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
  13. Perrod, G., et al. Cell Sheet Transplantation for Esophageal Stricture Prevention after Endoscopic Submucosal Dissection in a Porcine Model. PLoS One. 11 (3), e0148249(2016).
  14. Pascual, I., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells in biosutures do not improve healing of experimental colonic anastomoses. Brit J Surg. 95 (9), 1180-1184 (2008).
  15. Yoo, J. H., et al. Adipose-tissue-derived Stem Cells Enhance the Healing of Ischemic Colonic Anastomoses: An Experimental Study in Rats. J Korean Soc Coloproctol. 28 (3), 132-139 (2012).
  16. Okano, T. Cell sheet engineering. Rinsho Shinkeigaku. 46 (11), 795-798 (2006).
  17. Chen, G., et al. Application of the cell sheet technique in tissue engineering. Biomed Rep. 3 (6), 749-757 (2015).
  18. Labbe, B., Marceau-Fortier, G., Fradette, J. Cell sheet technology for tissue engineering: the self-assembly approach using adipose-derived stromal cells. Methods Mol Biol. 702, 429-441 (2011).
  19. Sukho, P., et al. Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet Application for Tissue Healing In Vivo: A Systematic Review. Tissue Eng Part B-Re. , (2017).
  20. Sukho, P., et al. Effects of adipose stem cell sheets on colon anastomotic leakage in an experimental model: Proof of principle. Biomaterials. 140, 69-78 (2017).
  21. Verseijden, F., et al. Angiogenic capacity of human adipose-derived stromal cells during adipogenic differentiation: an in vitro study. Tissue Eng Pt A. 15 (2), 445-452 (2009).
  22. Sukho, P., et al. Effect of Cell Seeding Density and Inflammatory Cytokines on Adipose Tissue-Derived Stem Cells: an in Vitro Study. Stem Cell Rev. 13 (2), 267-277 (2017).
  23. Surface, N. U. Cell Harvesting by Temperature Reduction. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/AppNote-Nunc-UpCell-N20230.pdf (2008).
  24. Wu, Z., et al. Colorectal anastomotic leakage caused by insufficient suturing after partial colectomy: a new experimental model. Surg Infect (Larchmt). 15 (6), 733-738 (2014).
  25. Wu, Z., et al. Reducing colorectal anastomotic leakage with tissue adhesive in experimental inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 21 (5), 1038-1046 (2015).
  26. Servier. Smart servier medical art. , http://smart.servier.com (2017).
  27. Wu, Z., et al. Reducing anastomotic leakage by reinforcement of colorectal anastomosis with cyanoacrylate glue. Eur Surg Res. 50 (3-4), 255-261 (2013).
  28. Aysan, E., Dincel, O., Bektas, H., Alkan, M. Polypropylene mesh covered colonic anastomosis. Results of a new anastomosis technique. Int J Surg. 6 (3), 224-229 (2008).
  29. Suarez-Grau, J. M., et al. Fibrinogen-thrombin collagen patch reinforcement of high-risk colonic anastomoses in rats. World J Gastrointest Surg. 8 (9), 627-633 (2016).
  30. Kobayashi, J., Okano, T. Fabrication of a thermoresponsive cell culture dish: a key technology for cell sheet tissue engineering. Sci Technol Adv Mat. 11 (1), 014111(2010).
  31. Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).
  32. Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).
  33. Makarevich, P. I., et al. Enhanced angiogenesis in ischemic skeletal muscle after transplantation of cell sheets from baculovirus-transduced adipose-derived stromal cells expressing VEGF165. Stem Cell Res Ther. 6, 204(2015).

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