颈静脉至颈总动脉移植血管中持久外源基因表达的兔模型

摘要

本方法描述了在兔子体内植入间置静脉移植物、对移植物进行转导以及实现持久的外源基因表达。该技术可用于研究外源基因及其蛋白产物在移植静脉中的生理与病理作用，并可用于静脉移植物疾病基因治疗的测试。

摘要

静脉移植旁路手术是治疗闭塞性动脉疾病的一种常见方法；然而，由于血栓形成、内膜增生和动脉粥样硬化导致的移植物失效，其长期疗效受到限制。本文旨在展示一种在兔体内建立双侧静脉移植段的方法，并通过基因转移载体对移植物进行转导，以实现外源基因的持久表达。该方法可用于研究基因及其蛋白产物在正常静脉移植物稳态中的生物学作用，同时也可用于检测外源基因是否具有预防静脉移植物失效的活性。 例如，无论是在高脂饮食喂养的兔子中，转基因的表达是否能够防止新生内膜增生、减轻血管炎症或减少动脉粥样硬化。在首次存活手术中，切除右侧和左侧颈外静脉段，并以反向端-侧方式双侧移植至颈总动脉作为间置移植物。在28天后进行的第二次存活手术中，使用血管夹将每条移植物从循环中隔离，并通过动脉切口向管腔内注入含有辅助依赖型腺病毒（HDAd）载体的溶液。经过20分钟孵育后，吸除载体溶液，修复动脉切口，恢复血流。根据各自实验方案规定的时间点收获静脉移植物。移植物植入与转导之间28天的间隔是必要的，以确保静脉移植物适应动脉血液循环。这种适应可避免在移植前或移植后立即进行转导时所发生的转基因表达快速丢失。该方法的独特之处在于能够在移植静脉中实现持久且稳定的转基因表达。与其他大型动物静脉移植物模型相比，兔子具有成本低和易于操作的优势；与啮齿类动物静脉移植物模型相比，兔子的血管更大且更易于操作，可提供充足的组织用于分析。

引言

动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，其特征是血管壁内脂质积聚和炎症反应，导致血管腔狭窄，进而引发心肌梗死、脑卒中和肢体缺血坏死^1,2。经皮介入治疗（例如，血管成形术和支架植入术）和药物治疗（例如，他汀类药物和抗血小板药物）对动脉粥样硬化具有一定的疗效；然而，对于冠状动脉和外周循环中的严重阻塞性病变，这些方法往往效果不佳。利用自体静脉段进行旁路移植术，仍是治疗严重且弥漫性冠状动脉和外周血管疾病患者的常用手段^3,4。然而，无论是用于冠状动脉还是外周循环的静脉移植物，其长期通畅率均不理想。在冠状动脉旁路移植术中，约有10%-20%的静脉移植物在术后1年内发生闭塞，至术后10年闭塞率高达50%^5,6。在外周循环中，静脉移植物在5年内的失败率约为30%-50%⁷。

基因治疗是一种预防静脉移植物失效的有吸引力的方法，因为它能够将治疗性基因产物精确地递送至病变部位。因此，已有大量临床前研究测试了静脉移植物基因治疗的效果^8,9。然而，这些研究基本上均仅评估了早期时间点（2–12周）的疗效^{10,11,12,13,14,15,16,17}。目前尚无证据表明基因治疗干预能够对通常由新生内膜增生和动脉粥样硬化引起的晚期静脉移植物失效提供持久（数年）的保护作用⁴。我们开发了一种可在移植静脉中实现持久转基因表达的方法，从而能够对基因治疗干预在晚期以及早期时间点的效果进行检测。为实现持久的转基因表达，该方法采用了HDAd载体和延迟转导策略。HDAd载体由于缺乏病毒基因，可避免免疫系统对转导细胞的识别与清除，因而能够实现长期的转基因表达^18,19,20,21。延迟转导（在移植术后28天进行）可防止转导细胞在移植后早期发生的动脉化过程中丢失²²。

其他实现静脉移植物管壁治疗性转基因表达的方法依赖于在移植术实施时对静脉移植物进行转导^{10,11,12,15,16,17}。采用该方法时，若进行连续检测，转基因表达在转导后迅速下降^22,23。因此，使用该方法的研究通常未考察静脉移植术后12周以上的疗效，大多数研究甚至未评估超过4周的疗效。相比之下，我们的方法所实现的静脉移植物转基因表达可稳定持续至少24周，并且——基于在动脉中开展的类似研究——很可能维持更长时间^22,24。据我们所知，目前尚无其他静脉移植物基因治疗干预手段能够实现如此持久的稳定转基因表达。

我们采用兔模型来建立本方法。其他研究者曾使用啮齿类动物、兔或更大的动物来测试静脉移植基因治疗^{10,11,12,15,16,17,25,26}。与啮齿类动物模型相比，兔的成本更高，且受到更严格的监管要求。然而，与较大的动物（e.g.，猪和狗）相比，兔的购买和饲养成本显著更低，且操作更为简便。此外，兔的血管在生理上与人类血管相似²⁷，其尺寸足够大，可用于经皮干预措施的测试^28,29，并能提供足够的组织，使得利用单个血管标本即可检测多个终点指标（e.g.，组织学、蛋白质、RNA）^22,30。此外，当携带静脉移植物的兔被喂食高脂饮食时，会发展出静脉移植物动脉粥样硬化^31,32，而这是冠状动脉旁路移植术中静脉移植物失效的常见原因^4,5。这些动脉粥样硬化的兔静脉移植物可作为利用本方法递送基因治疗干预措施的实验基质。所提供的实验方案可帮助研究人员掌握在兔静脉移植物中实现持久外源基因表达所需的技术技能。

方案

所有动物实验方案和研究均获得华盛顿大学动物福利办公室的批准。

1. 术前准备（适用于所有手术）

1. 通过在竖脊肌处进行肌内注射（IM），给予兔每公斤体重30 mg的氯胺酮和每公斤体重1.5 mg的赛拉嗪以实施麻醉。
   ​注意：手术前不限制食物和饮水。
2. 在等待达到足够麻醉深度的同时，准备术前准备室和手术室（OR）的台面。
   1. 准备术前准备室，用于剃除兔颈部毛发，并在耳部放置静脉（IV）通路（仅限存活手术）。将眼科软膏、芬太尼贴片（存活手术）、毛发剪、酒精消毒片、24-G × ¾" 导管、注射端口和手术胶带放置在准备台上。
   2. 在手术室内，设置监测设备及相关探头（心电图（EKG）、脉搏血氧饱和度（SpO₂）和体温）。使用100 mL生理盐水袋连接静脉泵，并插入18-G或19-G针头，设定输注速率为10 mL/h/kg（仅限存活手术）。为静脉移植或取材手术准备氧气和异氟烷设备，并配备鼻罩。
      1. 为帮助固定鼻罩，将一条纱布条缠绕在向鼻罩供气的管路上。该缠绕位置应位于管路与鼻罩连接处。纱布条两端应各留出约45 cm长度。将带有纱布条的鼻罩放置在手术台头部位置。
   3. 开启手术台上的循环水浴和/或强制空气加温毯。在加温毯上放置卷起的毛巾作为颈部支撑，并安置电凝分散电极板。
   4. 作为局部镇痛，用注射器混合1 mL的2%盐酸利多卡因和1 mL的0.5%盐酸布比卡因。将病毒稀释至所需浓度（此处，HDAd使用2 × 10¹¹ 病毒颗粒/mL），溶于无菌DMEM中并置于冰上保存（仅限基因转导手术）。
   5. 当达到充分麻醉深度后，开始为兔进行手术准备。
      ​注意：通过检测足底回缩反射是否消失来确认麻醉深度是否足够。在整个手术过程中持续监测足底反射。
      1. 将眼科软膏涂抹于兔的眼睛上。
      2. 为便于插入直肠温度探头，戴手套的手指轻压直肠上方，并向肛门方向推动以清除兔直肠内的粪便。
      3. 从胸骨切迹至下颌边缘剃除兔颈部毛发。剃除一只耳朵用于静脉通路建立，另一只耳朵用于贴敷芬太尼贴片（仅限存活手术）。剃除左后肢中间脚趾以放置SpO₂探头。
   6. 对于载体输注手术，对兔进行气管插管。使用外径4 mm/内径3 mm的无套囊气管导管，并将其沿关节镜引导插入。将兔置于胸卧位并过度伸展颈部。保持兔口腔充分张开，利用关节镜观察声门及喉部皱襞。在吸气过程中，轻柔地将气管导管经喉部插入气管。
   7. 对于存活手术，在兔左耳静脉内置入并固定24-G静脉导管，并用注射端口封闭。在兔右耳贴敷25 µg/h芬太尼贴片。
      注意：本方案默认术者位于兔右侧。若术者位于兔左侧，则需在本步骤中对调左右侧，以确保导线和静脉通路位于术者对侧。后续步骤中根据需要相应调整左右侧。
   8. 对于静脉移植和取材手术，通过鼻罩给予全身麻醉；对于载体输注手术，则通过气管导管给予全身麻醉。
      注意：气管插管可用于所有手术类型。  然而根据我们的经验，插管过程中可能引起的气管和喉部创伤所带来的并发症风险，可能超过插管本身带来的益处。  仅在涉及移植物基因转导的手术（特别是在喂饲高胆固醇饮食的兔中）中，气管插管似乎具有净收益。
   9. 将兔转移至手术室。将兔仰卧于手术台上，颈部支撑毛巾置于兔头部下方。轻柔地伸展兔颈部，使其保持平直且大致水平。
   10. 为兔佩戴鼻罩（静脉移植和取材手术）或将气管导管（载体输注手术）连接至1 L/min的O₂，并开始使用异氟烷。若使用鼻罩，可通过将附着的纱布条两端缠绕在颈部支撑毛巾上来固定鼻罩。根据需要调整异氟烷浓度（通常为1–2%），以维持外科麻醉水平。
   11. 将电凝分散电极板居中放置于兔背部下方。插入直肠温度探头，并连接SpO₂探头和EKG导联线。
   12. 将生理盐水静脉通路连接至兔左耳的导管端口，并以10 mL/h/kg的速率启动静脉输注泵。1小时后，将生理盐水输注速率降低至5 mL/h/kg。
   13. 用松散结扎的方式将兔前肢固定于手术台上以限制活动。
       ​注意：可选择在兔体上放置一个小塑料板，以防止术者压迫兔胸部/腹部，从而避免可能引起的胃食管反流和误吸。
   14. 沿计划切口线，在颈部皮下（SQ）注射利多卡因/布比卡因混合液（2 mL，1:1混合，见步骤1.2.4），以实现局部麻醉。
   15. 助手使用氯己定葡萄糖酸盐与异丙醇交替擦拭三次对术区进行消毒，随后喷洒聚维酮碘。术者按照无菌原则进行刷手、穿手术衣和戴手套。
       1. 存活手术必须在无菌条件下进行。助手负责处理非无菌物品，并以无菌方式将无菌材料传递给术者，或无菌地放置于覆盖布巾的器械台上。
       2. 术者使用无菌毛巾无菌操作非无菌设备（如显微镜）。术者在手术前半程佩戴2倍放大手术放大镜进行操作。

2. 静脉移植手术（存活）

1. 准备器械和无菌区域。
   1. 让助手打开无菌包（包括一张手术台巾、一张纸巾和6条毛巾），并以无菌方式将内容物传递给外科医生。
   2. 铺置器械台。将纸巾和无菌毛巾放置在已铺好的器械台上。使用4条毛巾包裹兔子，仅暴露颈部手术区域。将纸巾覆盖在兔子身上。其中一条毛巾稍后使用，最后一条作为备用。
   3. 让助手打开已灭菌的器械包，并以无菌方式将器械托盘传递给术者。将器械整齐摆放在器械台上。
   4. 让助手打开以下器械，并以无菌方式将其传递给外科医生或放置于器械台上：1 mL注射器一支、3 mL注射器一支、20 mL注射器一支、21 G针头一支、3-0聚乙醇酸（PGA）缝线、5-0 PGA缝线、7-0聚丙烯缝线，以及24 G静脉导管一支。
   5. 使用7.25号针将电灼器导线固定在覆盖兔子的手术巾上" Kantrowitz止血钳。将电缆的插头端垂放至手术台边缘，由助手连接至电外科设备并开启。
   6. 用助手持握的生理盐水袋或小瓶中的无菌生理盐水填充一支20 mL注射器。根据需要使用该生理盐水，以防止手术过程中暴露组织脱水。
   7. 将 0.1 mL 浓度为 5,000 IU/mL 的肝素加入 5 mL 生理盐水中，配制 5 mL 肝素化生理盐水溶液。 即，100 IU 肝素/mL，置于小型外科手术碗中。在移植过程中，用此溶液定期冲洗颈动脉和静脉移植物。
   8. 在兔子颈部手术部位的手术巾上剪一个洞。使用巾钳夹住洞口的四个角并固定。 底层的毛巾。
2. 血管解剖
   ​注意：手术此步骤建议使用2倍外科放大镜辅助操作。
   1. 沿胸骨切迹与下颌之间中线处使用电刀切开皮肤（长度约7-9 cm），用巾钳将兔颈部皮肤固定于手术巾上。在尾端，使用电刀通过钝性分离在筋膜上做一短的侧向切口。用大剪刀沿中线在筋膜下进行钝性解剖。沿中线使用电刀切开已解剖的筋膜层。
   2. 从右侧开始，在覆盖气管的胸骨舌骨肌与V形的胸头肌之间进行分离，以暴露颈总动脉。
   3. 仔细游离一段4-5 cm长的颈总动脉及其较大的分支（通常每侧1-2支），去除周围组织。游离范围从颈部基底部近端开始，至咽部神经交叉处远端结束。解剖过程中使用外科硅胶牵开环辅助牵拉颈总动脉。在远端切断各较大分支前，先用5-0丝线结扎这些分支。
      ​注意：操作时需小心，避免触碰与颈总动脉平行的迷走神经，以及横跨该动脉的较小神经。
   4. 在左侧重复解剖步骤（步骤 2.2.3）。
   5. 使用组织钳暂时闭合皮下组织层。从右侧皮肤分离浅筋膜，直至暴露颈外静脉。游离一段4-5 cm的颈外静脉，将其分支从周围组织中分离，并在切断前用5-0丝线结扎细小分支。
   6. 在左侧重复解剖步骤（步骤 2.2.5）。
   7. 在静脉导管中注入肝素（150 IU/kg），并用10 mL生理盐水冲洗。
   8. 测量右侧颈外静脉一段3 cm长的血管节段，用5-0丝线结扎该节段的远端。使静脉充盈血液后，再结扎静脉节段的近端。在近端处切断颈外静脉节段，用连接24 G静脉留置针的3 mL注射器，以含肝素的生理盐水（100 U/mL）小心冲洗血管腔。在远端处切断静脉节段。将静脉节段置于标准化位置，确保远端和近端可明确辨识。
3. 静脉移植
   1. 让助手取下外科医生的手术放大镜，并将手术显微镜（25X）移至指定位置。
      注意：术者应在显微镜上覆盖无菌毛巾。这使得术者在保持无菌状态的同时能够操作显微镜。
   2. 用微型夹子夹闭右侧颈总动脉隔离段的两端，先放置头侧的夹子以允许动脉充盈，再放置尾侧的夹子。
   3. 剪取一块1 × 2 cm的硬纸片（可从无菌缝线包装中获取），置于颈总动脉下方，以改善暴露。
   4. 在尾侧夹头近头端处行动脉切开术（尾侧动脉切开术）。动脉切开的长度应等于静脉段头端的直径。将带有静脉导管的注射器经尾侧动脉切口插入，并用肝素化生理盐水冲洗颈动脉管腔。
   5. 将静脉的颅端与尾侧动脉切口用7-0聚丙烯缝线行单针缝合图1).
      1. 将第一针缝合于尾端动脉切口的尾侧末端与静脉节段的头侧末端。在与第一针相隔180°的位置缝合第二针，将尾端动脉切口的头侧末端与静脉节段的头侧末端缝合。
      2. 将第三针缝合在吻合口外侧，位于前两针等距的位置。将第四针缝合在吻合口内侧，与前两针等距，且与第三针相对。在第1至第4针之间各插入4针（第5至第8针）。
      3. 在颅侧动脉切开术中，于颅侧后部进行切口 夹闭。颅端动脉切口的颅侧末端与尾端动脉切口的尾侧末端之间的距离应与静脉节段的长度相等。颅端动脉切口的长度等于静脉节段尾端的直径。
   6. 将静脉从吻合口向头端延伸，平铺于颈动脉上方，避免产生任何扭曲。通过头端动脉切口，用含肝素的生理盐水冲洗颈动脉和静脉。生理盐水将流经动脉，经尾端吻合口进入静脉，并从静脉未缝合的游离端流出。冲洗静脉的同时也可防止其发生扭曲。
   7. 将静脉的尾端缝合至头端的动脉切口图1).
      1. 将第一针缝合于颅端动脉切口的尾端与静脉段的尾端。将第二针缝合于颅端动脉切口的颅端与静脉段的尾端。按照步骤2.3.5.2所述完成吻合。在颅端吻合口打最后一个结之前，短暂打开分离出的颈总动脉段颅端的血管夹，使回流血液冲出颈动脉及移植静脉内的空气，随后收紧最后一个结。
   8. 松开颅侧夹钳，使静脉移植物充盈血液，随后松开尾侧夹钳。应在静脉移植物中观察到明显的搏动。用干纱布轻压吻合口处，以止住任何出血。
   9. 用3-0丝线结扎连接吻合口的颈总动脉段两端，并在两结扎线之间中点处切断颈总动脉。图1)。在每处吻合口附近的颈动脉上滴加数滴罂粟碱（3.5 mg/mL）。
   10. 经耳缘静脉导管注射肝素（75 IU/kg），并用10 mL生理盐水冲洗。此时皮下注射布托啡诺（0.02 mg/kg）以提供术后镇痛，直至芬太尼透皮贴剂达到有效的血浆镇痛浓度。
       注意：在首次注射后6小时，可能需要追加一次布托啡诺注射（皮下，0.02 mg/kg），以维持镇痛效果，直至血浆芬太尼浓度达到治疗水平。
   11. 在左侧重复移植操作（步骤 2.2.8、2.3.2–2.3.9）。
   12. 使用5-0 PGA缝线连续缝合皮下组织。使用3-0 PGA缝线行皮内缝合关闭皮肤。两端均埋藏结。
4. 术后恢复、清理与护理
   ​注意：让兔子在安静、平和的环境中从麻醉中恢复。持续监测兔子的氧合情况和体温，直至其完全恢复。
   1. 关闭异氟烷和氧气，将麻醉机与兔子断开。断开兔子的静脉输液管，但保留耳缘静脉中的静脉留置端口以备紧急使用。
   2. 将兔子转运至恢复笼中，侧卧放置。使用温水毯（或强制空气加温系统）提供保温支持。给予氧气₂ 直至鼻锥处的SpO₂ 是稳定的。
   3. 在兔子能够自行在笼内坐起并行走之前，每隔15分钟将其翻转至另一侧。随后移除耳缘静脉留置针，并将兔子放回笼中。只有在兔子完全从麻醉中恢复后，方可将其与其他动物放在一起。
   4. 按照生物危害物和锐器废弃物处理的适当规程处置所有废弃物。
   5. 术后每天检查兔子的健康状况和手术伤口。若芬太尼贴剂无法控制疼痛，则按需给予布托啡诺。术后第3天移除芬太尼贴剂。

3. 经皮超声

1. 为评估移植物通畅性，在静脉移植物手术和基因转导手术后5至7天，对未麻醉的兔子进行超声检查。
   1. 将未麻醉的兔子用毯子牢固包裹，仰卧置于兽医用V形槽中，使其颈部伸展。剃除颈部毛发，必要时可使用脱毛剂去除毛发。在颈部涂抹超声耦合剂，进行超声检查。
      注意：在麻醉状态下，还需对兔子进行超声检查 基因转移手术和终末移植物的 在收获手术中检查移植物通畅性并测量移植物管腔直径。该检查在颈部消毒前进行，操作方法与未麻醉兔的操作方法相似。

4. 移植物植入后约 28 天进行的基因转导手术（存活手术）

1. 准备器械和无菌区域。
   1. 按照静脉移植物手术中的步骤 2.1.1-2.1.3 操作。
   2. 让助手打开以下设备，并以无菌方式递交给外科医生或放置于器械台上：六个 1 mL 注射器（带针头）、一个 3 mL 注射器、一个 20 mL 注射器、一个 21 G 针头、一个 19 G 针头、3-0 PGA 缝线、5-0 PGA 缝线、7-0 聚丙烯缝线、两个 24 G 静脉留置针，以及一个无菌血流探头。
   3. 按照静脉移植物手术中的步骤 2.1.5-2.1.6 操作。
   4. 准备一个 1 mL 注射器，内含 1 mL DMEM，用于冲洗动脉和静脉移植物；另准备两个 1 mL 注射器，各装有病毒溶液（约每根静脉移植物 0.5–0.7 mL）。让助手将病毒溶液解冻并用 DMEM 稀释。再准备一个 3 mL 注射器，内含 0.5 mL 利多卡因/布比卡因（50/50 混合液，见步骤 1.2.4）。
   5. 按照静脉移植物手术中的步骤 2.1.8 操作。
2. 分离静脉移植物及邻近颈动脉
   ​注意：此部分应使用 2 倍手术放大镜。
   1. 使用电凝刀沿胸骨切迹至下颌之间的中线切开皮肤（长度约 7–9 cm），用巾钳夹住皮肤使其张开。向皮下组织注射 0.5 mL 利多卡因/布比卡因（50/50 混合液，见步骤 1.2.4）。
   2. 在尾端，用电凝刀横向切开筋膜一小段。沿中线在筋膜下方进行钝性分离。再用电凝刀沿中线切开已分离的筋膜。
   3. 从右侧开始。在覆盖气管的胸骨舌骨肌与 V 形的胸头肌之间进行分离，以暴露静脉移植物。仔细分离静脉移植物，并在头侧和尾侧各游离邻近移植物的颈动脉 1.5–2.0 cm。
   4. 在左侧重复上述分离操作，参照步骤 4.2.3。
3. 测量静脉移植物中的血流。
   1. 用生理盐水充满右侧手术创腔，以利于声波传导。将一个 2 mm 的血管周围血流探头（连接至体积流量计）浸入创腔内的盐水中，并将流量调零。
   2. 将血流探头环绕置于静脉移植物头侧或尾侧的颈动脉上。使用电子数据采集系统记录探头数据。
   3. 在左侧重复血流测量，参照步骤 4.3.2。
   4. 根据收缩期峰值流速、舒张期最低流速和平均流速计算搏动性指数。同时根据流速和管腔直径（通过经皮超声测量）计算层流剪切应力。
4. 向静脉移植物内灌注载体溶液
   ​注意：根据需要使用手术显微镜（16 倍）进行穿刺、灌注及颈动脉修复。
   1. 让助手取下外科医生的手术放大镜，并将手术显微镜移至适当位置。外科医生用无菌毛巾覆盖显微镜。该无菌毛巾可使医生在保持无菌条件下操作显微镜。
   2. 让助手通过静脉留置针注射肝素（150 IU/kg），并用生理盐水冲洗。
   3. 使用大号持针器在 21 G 针头斜面稍上方将其弯曲至约 80°（切勿弯曲斜面； 图 2A）。
   4. 使用微型夹钳在静脉移植物两端夹闭颈总动脉，先放置头侧夹钳以便动脉充盈，再放置尾侧夹钳。尾侧夹钳应置于吻合口尾侧约 10 mm 处，为动脉切开留出操作空间。
   5. 在移植物尾侧的动脉上绕两根丝线结，每根打一个单结，但暂不收紧。
   6. 使用弯曲的 21 G 针头在尾侧血管夹头侧穿刺移植物尾侧的颈动脉。注意避免穿破血管后壁或侧壁。将针头在管腔内前后推进两次以确保通畅，然后小心撤出针头。
      说明：可通过精细镊子夹住动脉外膜并轻轻提起前壁，同时将针尖插入提起点尾侧，辅助完成颈总动脉穿刺（图 2A）。此操作可降低针头刺破后壁的风险。
   7. 使用数块未展开的纱布垫制作一个“巢”，用于放置灌注用的注射器。将该纱布巢置于手术区域尾侧。
   8. 将一个 24 G 静脉留置针连接至仅含 DMEM 的注射器上，拧紧至刚好防止漏液即可（该注射器将在后续手术中移除），并将导管尖端前约 4 mm 处弯曲，使释放后弯折角度保持约 75°。
   9. 将静脉留置针插入颈总动脉切口，直至弯折处。用 0.5 mL DMEM 冲洗静脉移植物管腔两次。每次操作时，先用 DMEM 充满移植物管腔，然后在移植物头端轻压手套手指，将 DMEM 排出。小心地将手指向尾端滑动，通过动脉切口冲洗管腔内容物。
   10. 将含 DMEM 的注射器从导管上取下，保留导管在血管内。连接含有病毒溶液的注射器，确保无空气进入导管。将未收紧的丝线结沿动脉向下滑动，使其环绕导管尖端，但仍不收紧。
   11. 注入 0.03 mL 病毒溶液，以排出导管中残留的 DMEM。用手指从头侧向尾侧轻压，将静脉移植物管腔内的所有液体排尽。
   12. 收紧环绕动脉和导管尖端的两根丝线，封闭管腔。继续注入病毒溶液，直至静脉充分扩张。
       注意：静脉移植物必须扩张至转导前的管径，并在整个病毒灌注过程中保持充盈状态。否则，基因转导效率将显著降低。
   13. 让含病毒的溶液在静脉移植物管腔内保留 20 分钟，然后将连接导管的含病毒注射器更换为空注射器。轻柔抽吸移植物内的病毒溶液，直至血管塌陷。取下注射器，保留导管在原位。剪断并解开丝线结，将导管从血管中撤出。撤出颈动脉导管时应小心操作，避免损伤内皮。
   14. 在手术显微镜辅助下，使用 7-0 聚丙烯缝线以 X 形方式缝合动脉切口（图 2B）。
       1. 用持针器夹住缝线，从动脉切口右下角进针，左下角出针。在血管外跨越切口，第二次进针从右上角至左上角。
       2. 在收紧缝线前，短暂松开头侧血管夹，以冲洗静脉移植物和动脉中的空气及残余病毒。松开夹钳时，血液将从动脉切口流出。
       3. 轻柔牵拉缝线两端，闭合动脉切口，并以两个方结打结固定。
          注意：过度牵拉缝线会导致组织皱缩，影响血流，增加血栓风险，并可能引入不可控变量。
   15. 先松开头侧 血管夹，再松开尾侧 血管夹。使用纱布轻压止血。
   16. 此时，皮下注射布托啡诺（SQ，0.02 mg/kg），以在芬太尼贴片达到有效血药浓度前提供术后镇痛。
       ​注意：首次注射后 6 小时可能需要追加一次布托啡诺注射（SQ，0.02 mg/kg），以维持镇痛效果，直至血浆芬太尼浓度达到治疗水平。
   17. 在左侧重复病毒灌注操作，参照步骤 4.4.5–4.4.15。
5. 伤口闭合
   1. 使用连续缝合法，以 5-0 PGA 缝线缝合皮下组织；使用皮内缝合法，以 3-0 PGA 缝线缝合皮肤。两端打结均埋入皮下。
6. 术后恢复、清理与护理
   1. 参照步骤 2.4 操作。

5. 收获手术（终末期）

1. 准备器械和手术区域。
   1. 按照静脉移植手术中的步骤 2.1.1-2.1.3 操作。
   2. 让助手打开以下物品并以无菌方式放置在器械台上（或传递给术者）：一支 20 mL 注射器、一支 21G 针头、3-0 丝线缝线和一个无菌血流探头。
   3. 按照静脉移植手术中的步骤 2.1.5-2.1.6 和 2.1.8 操作。
2. 分离颈总动脉和静脉移植物
   1. 使用电凝刀沿胸骨切迹至下颌之间的中线切开皮肤（长度约 7–9 cm），并用巾钳将兔颈部皮肤固定在毛巾上。
   2. 在尾端，使用电凝刀横向切开筋膜一小段。沿中线在筋膜下方进行钝性分离。再用电凝刀沿中线切开已分离的筋膜。
   3. 从右侧开始。在气管上方的胸骨舌骨肌与V形的胸头肌之间进行分离，以暴露颈总动脉和静脉移植物。
   4. 将右侧静脉移植物和颈总动脉从周围组织中游离出来。分离过程中使用外科硅胶牵引环牵拉动脉和静脉移植物。
   5. 在左侧重复步骤 5.2.3–5.2.4 的分离操作。
3. 按照基因转导手术中的步骤 4.3.1–4.3.3 进行血流测量。
4. 采集静脉移植物
   1. 使用 3-0 丝线缝线，在移植物近头侧结扎右侧颈总动脉；然后在移植物近尾侧结扎颈总动脉。
   2. 切断每条结扎线与邻近吻合口之间的邻近颈总动脉，切除右侧静脉移植物。将静脉移植物从兔体内取出，并用生理盐水冲洗管腔。
   3. 修剪静脉移植物两端的颈总动脉及吻合口组织。去除静脉移植物上多余的外膜组织，并根据后续终点分析的需要将其切成若干段。
   4. 通过重复步骤 5.4.1–5.4.3 采集左侧静脉移植物。
5. 静脉注射 1 mL 苯妥英钠/戊巴比妥进行安乐死。
6. 按照生物危害物和锐器废弃物处理的相关规程处置所有废弃物。

结果

在新操作者使用本方法生成实验数据之前，必须验证其技术熟练程度。新操作者需要达到的首个关键指标是在初次静脉移植手术以及后续的延迟转导手术后，均能实现稳定的静脉移植物通畅。每次手术后的通畅率超过90%是理想且可实现的目标。可通过经皮超声无创评估移植物通畅性，我们通常在术后第5至7天进行该项检查。在静脉通畅的家兔中，超声检查将显示颈部前侧双侧存在一条较大的血管，并可见快速的尾端向头端血流（图3A）。若任一静脉移植物发生闭塞，则在该侧将无法检测到尾端向头端的血流；然而，颈内静脉中仍可检测到头端向尾端的血流（图3B）。

新操作者必须达到的第二个里程碑是高效转导静脉移植物内皮细胞。在此过程中，使用表达β-半乳糖苷酶的腺病毒载体来评估内皮基因转移的效率。本实验室的一名新操作者采用上...

讨论

本方案中的关键步骤包括麻醉管理、抗凝处理、动脉/移植静脉的外科操作以及移植静脉的血流动力学测量。在此涉及两次相对较长时间手术（通常双侧静脉移植手术为3-3.5小时，双侧移植物转导手术为1.5-2.5小时）的多次存活手术模型中，麻醉的恰当管理至关重要。我们曾通过鼻罩和经气管插管两种方式给予麻醉，发现插管可提高移植物转导手术后的存活率，可能是因为正压通气可预防肺不张及相关呼吸衰竭。兔的气管插管操作具有挑战性，插管相关的气道创伤可能导致术后喘鸣。然而，与插管相关的困难和并发症，相较于其在消除静脉移植手术围手术期大多数发病率和死亡率方面的益处而言，是较小的代价。

抗凝治疗对于预防移植静脉发生血栓至关重要，此类血栓可能在任一存活手术后出现。血栓形成似乎是一种早期术后事件，因为术后5–7天经皮超声检查显示通畅的静脉移植物，在取材时几乎总是保持通畅。为预防第一次手术后的血栓形成，即，静脉移植）中，在获取第一侧颈外静脉前，经静脉给予肝素。根据肝素在兔体内的血浆半衰期（1–2小时），在获取对侧颈外静脉前追加半剂量的静脉肝素。此外，在单根静脉移植物的动静脉吻合完成前，我们每隔约8分钟...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
一次性耗材
3 mL 注射器配 24G 针头	Becton Dickinson	309571	静脉移植手术使用 2 支；基因转导手术使用 2 支
1 mL 注射器配 27G 针头	Becton Dickinson	309623	静脉移植手术使用 2 支，基因转导手术使用 5 支
19G 针头	Becton Dickinson	305187	基因转导手术
20 mL 注射器，鲁尔锁扣	Nipro Medical Corp	JD+20L
导管，24G × 3/4”	Terumo Medical Products	SROX2419V
21G 针头	Becton Dickinson	305165	基因转导手术及用于 20 mL 生理盐水注射器
纱布 4” × 4”	Dynarex	3242	每台手术约需 10–15 块
3-0 丝线缝合线	Covidien Ltd.	S-244
5-0 丝线缝合线	Covidien Ltd.	S-182
7-0 聚丙烯缝合线	CP Medical	8703P	静脉移植手术
7-0 聚丙烯缝合线	CP Medical	8648P	基因转导手术
5-0 聚乙醇酸缝合线	CP Medical	421A
3-0 聚乙醇酸缝合线	CP Medical	398A
酒精棉片	Covidien Ltd.	6818	用于静脉通路建立
导管塞	Vetoquinol	411498
盐酸氯胺酮，100 mg/mL	Vedco Inc.	5098916106
赛拉嗪，100 mg/mL	Akorn Inc.	4821
利多卡因，20 mg/mL	Pfizer	409427702
布比卡因 0.5%	Pfizer	409161050
Beuthanasia D-Special	Intervet Inc.	NDC 00061047305	仅用于取材手术
盐酸丁丙诺啡，0.3 mg/mL	Patterson Veterinary	12496075705
生理盐水静脉输液袋，0.9% 氯化钠	Baxter	2B1309
肝素 （5000 U/mL）	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-047-10
罂粟碱（3.5 mg/mL）	American Reagent Inc.	NDC 0517-4002-25	由 30 mg/mL 储备液稀释；最大使用量为 1 mL
芬太尼透皮贴剂，25 mcg/h	Apotex Corp.	NDC 60505-7006-2
异氟烷	多个供应商	目录号不可用
病毒载体			仅用于基因转导手术
手术器械
Metzenbaum 持针器，7" 直头	Roboz	RS-7900
手术剪，6.5" 直头钝-钝	Roboz	RS-6828
持针器（带缝线剪）	Miltex	8-14-IMC
Castroviejo 剪刀	Roboz	RS-5658
Castroviejo 持针器，5.75" 直头带锁	Roboz	RS-6412
Stevens 剪刀，4.25" 弯头钝-钝	Roboz	RS-5943
Alm 牵开器，4" 4×4，5 mm 钝齿	Roboz	RS-6514	2 个
Backhaus 手巾钳，3.5"	Roboz		4 个
微型夹子放置钳，4.75"	Roboz	RS-6496
微型血管夹，11 mm	Roboz
Surg-I-Loop	Scanlan International	1001-81M	5 cm 长度
Bonaccolto 镊子，4”（10 cm）长纵向锯齿，尖端交叉锯齿，尖端宽度 1.2 mm	Roboz	RS-5210
Dumont #3 镊子，Inox 尖端尺寸 0.17 × 0.10 mm	Roboz	RS-5042
Graefe 镊子，4”（10 cm）长锯齿直头，尖端 0.8 mm	Roboz	RS-5280
Halstead 蚊式钳， 5" 直头，1.3 mm 尖端	Roboz	RS-7110	2 个
Halstead 蚊式钳， 5" 弯头，1.3 mm 尖端	Roboz	RS-7111
Jacobson 蚊式钳，5" 弯头超精细，0.9 mm 尖端	Roboz	RS-7117
Kantrowitz 镊子，7.25" 90 度精细，1.7 mm 尖端	Roboz	RS-7305
组织镊，5"，1×2 齿，尖端宽度 2 mm	Roboz	RS-8162
Allis-Baby 镊子，12 cm，4×5 齿，尖端宽度 3 mm	Fine Science Tools	11092-12	2 个
Adson 镊子，12 cm，锯齿状，直头	Fine Science Tools	11006-12
兽用电动手术手柄及电极	MACAN Manufacturing	HPAC-1; R-F11
手术室设备
循环温水毯及泵	多个供应商	目录号不可用
Bair hugger 加温系统	3M	型号 505
静脉输液泵	Heska	Vet IV 2.2
异氟烷挥发罐及废气清除系统	多个供应商	目录号不可用
兽用多参数监护仪	Surgivet	Surgivet Advisor
兽用电动手术系统	MACAN Manufacturing	MV-9
手术显微镜	D.F. Vasconcellos	M900	静脉移植手术使用 25 倍放大；基因转导手术使用 16 倍放大