部分肝叶切除术：一种用于研究肝脏形态学再生的手术模型

摘要

本文介绍了一种对新生（出生第0天）小鼠进行左肝叶部分切除的新方法。该新方案适用于研究新生期急性肝损伤及损伤应答反应。

摘要

急性组织丧失后发生形态学上的器官再生在低等脊椎动物中较为常见，但在哺乳动物出生后的生命过程中却极为罕见。成年肝脏在70%部分肝切除术后，残余肝叶中的肝细胞主要通过肥大并伴随一定程度的增殖来恢复代谢功能，但受损肝叶的原有形态和结构将永久丧失。本文详细介绍了一种适用于新生个体的新型外科手术方法，该方法保留了有利于再生的生理环境。该模型通过切除左肝叶顶端并采用后续保守管理方案实现，无需结扎主要肝血管或造成化学性损伤，从而维持了一个适宜再生发生的生理环境。我们将此方案进一步扩展至幼年期（出生后第7至14天）小鼠的肝叶截除实验，在此阶段，受损肝脏的修复方式由器官再生逐渐转变为以细胞肥大为主的代偿性生长。本研究所提供的这一简短的30分钟操作流程，为探索器官再生机制、哺乳动物再生能力随年龄增长而衰退的现象，以及潜在肝干细胞或前体细胞的鉴定提供了研究框架。

引言

长期以来，人们认为器官再生能力或形态与功能恢复能力在进化过程中基本丧失。已发现成年哺乳动物肝脏在急性化学或物理损伤后具有再生潜能，该过程涉及所有残存肝细胞的动员，引发细胞肥大波及少数几轮细胞分裂，最终形成一个功能正常但结构不同的器官^1,2,3,4,5。近年来，研究开始关注新生哺乳动物器官在出生后第一周内对损伤的再生反应^6,7,8。这些研究表明，在新生儿发育阶段受到损伤时，某些哺乳动物器官会表现出形态学上的再生反应，而非代偿性生长或纤维化^7,8。

近期研究表明，在新生早期阶段，肝脏的整体结构和功能均能实现再生^6,7,8。目前 established 的肝损伤模型包括化学性损伤或使用乙醇^9,10,11、对乙酰氨基酚^12,13,14,15、四氯化碳^16,17,18,19诱导损伤，以及70%部分肝切除^4,20,21或切除左叶和中叶。化学试剂诱导的损伤可导致肝细胞死亡，但通常保留了微细结构和宏观结构的完整性。在此类模型中，由于肝脏整体结构未被完全破坏，因此难以对形态学上的再生过程进行研究。70%部分肝切除术需要对主要血管进行缝合结扎以止血，但会造成非生理性的环境，并永久性破坏血管系统。此外，该方法仅在成年啮齿类动物中应用，将其用于新生动物在技术上极为困难。鉴于上述局限，我们建立了一种方法：在出生后第0天（P0）的新生小鼠中，切除左叶顶端的20–30%（图1A-1B）。该方法手术操作保守、微创、技术难度低，可在不结扎血管的情况下造成明显的形态学缺损，从而为肝脏再生提供空间。下文详述的分步操作方案，可使任何研究人员均能对新生小鼠实施部分肝小叶切除术，以研究哺乳动物在出生后早期阶段的再生能力。该方法在再生医学和干细胞生物学的比较研究中也具有明确的应用价值，因其亦可用于动物生命后期阶段的肝脏研究。

最常见的急性肝损伤研究包括化学诱导损伤、成年肝脏截除或70%部分肝切除。化学性损伤通常通过静脉内、腹腔内或口服给予对乙酰氨基酚、四氯化碳或乙醇实现，是一种相对简便且非侵入性的损伤模型。如前所述，化学性损伤会导致肝细胞死亡，但通常保留间质和实质结构完整，因此难以对形态学上的再生作出明确结论。化学性损伤通常以肝血管为中心，使其成为研究特定部位和特定细胞损伤的有用技术；但同时也使得在全器官水平上探究那些距离血管较远、可能参与再生的其他细胞群体变得困难。尽管存在这些局限性，化学性损伤仍是一种有用且高度符合生理相关性的损伤模型。

成年小鼠70%部分肝切除术涉及结扎肝血管后切除左叶和中叶。肝切除后的反应已有充分表征：在70%部分肝切除术后14天，残余肝脏的宏观结构与原始未损伤肝叶明显不同，剩余的右叶和尾状叶肝细胞发生肥大并经历数轮细胞分裂^4,5。这一过程可弥补丢失的肝脏质量和功能，但无法再生被切除的两个肝叶，因此不能恢复原有的宏观形态。因此，70%部分肝切除所引发的损伤反应适用于研究具有有限再生能力的代偿性生长机制。

本文详细描述了一种新生小鼠部分肝小叶切除术的实验方案。该操作包括合适的动物选择与准备、手术区域准备、手术过程以及术后恢复。针对该方案的不同应用，可能需要对上述各个步骤进行优化和调整。

我们已在野生型 C57BL/6J 幼鼠（JAX 000664）中广泛实施并优化了该实验方案；然而，为了研究不同的细胞群体及再生机制，我们也使用了多种转基因动物，包括携带不同 Cre 和 CreERT2 转基因和/或基因敲入的小鼠（Axin2^CreERT2 JAX 018867、和 Sox9^CreERT2 JAX 018829），并结合荧光报告系统，如 Rainbow 和 mTmG 系统（R26^VT2/GK3、R26^mT/mG）^22，23。我们发现，针对不同小鼠品系无需修改本方法，因在存活结果或再生潜能方面未观察到差异。

除了使用不同品系的动物外，我们还对经小分子化合物（如4-羟基他莫昔芬和5-乙炔基-2′-脱氧尿苷，EdU）处理的新生小鼠进行了部分小叶肝切除术。二甲基亚砜（DMSO）和乙醇被用作溶剂，因为玉米油被发现是导致发病的重要因素。此外，我们发现腹腔注射小分子化合物并不影响小鼠的存活率或再生结果。我们预计该实验方案将被进一步应用于其他小分子化合物，以探究再生过程中的不同方面。

新生小鼠手术在技术上具有挑战性，可能需要动物操作和显微解剖方面的特殊专业知识。必须具备动物饲养方面的专业知识，以防止手术后及术后即刻恢复期间母鼠发生食仔行为。

方案

所有动物实验均严格遵循国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）以及斯坦福大学实验动物护理行政小组（APLAC）（方案编号 #10266）的指南，在美国或欧盟动物福利法、指令 2010/63/EU 框架下进行。该方案已获德国巴伐利亚州政府动物实验伦理委员会批准，并取得许可编号：55.2-1-54-2532-150-2015。

1. 动物准备

1. 在加热垫上准备一个带有适当垫料的空笼子。
2. 在戴手套接触动物之前，先将母鼠的垫料擦拭在手套上。
3. 将所有仔鼠从母鼠身边移出，并放入空笼中。取部分母鼠的垫料放入空笼内与仔鼠一起。
4. 将母鼠放入另一个干净、干燥且远离手术区域的笼子中。
5. 在准备手术区域前，更换新的无菌手套。 

2. 手术区域准备

1. 使用10 mL移液管，向10 cm培养皿中加入10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）。
2. 用移液管向10 cm培养皿中加入2 mL聚维酮碘或等效的消毒溶液。
3. 在手术区域放置一台体视显微镜。打开体视显微镜的光源，并根据术者的舒适度调节光照强度。可将仔鼠置于体视显微镜光源下方的手术区域中。通过观察仔鼠腹面无阴影即可确认光照充足。
4. 准备含鼻罩的异氟烷麻醉舱（见材料表），确保舱内清洁，无尿液或粪便残留。将鼻罩及其连接管路置于体视显微镜下的手术区域中，并将氧气和异氟烷气流完全导向鼻罩。
5. 准备术后恢复区域，其中放置设定温度约为37 °C的加热垫。术后恢复区域应由4块纱布铺在加热垫上构成。如有可能，用纱布擦拭母鼠的垫料、粪便和尿液，以保留母鼠的气味。
   注意：不建议使用加热灯，因其难以控制温度。过高的温度将导致新生小鼠死亡。
6. 使用高压灭菌器准备并灭菌所有手术器械。所需工具包括：显微剪刀、显微镊子、纱布、止血钳以及任意6-0单股不可吸收缝合线。手术器械可使用玻璃珠灭菌器进行重复灭菌。 

3. 部分肝小叶切除术

1. 将幼鼠仰卧置于鼻罩中，并用胶带轻轻固定其四肢。幼鼠应接受5%异氟烷与氧气混合气体麻醉。
   1. 让幼鼠静置5分钟，或直至麻醉充分，可通过脚趾夹捏试验验证麻醉深度。
   2. 在切口前，皮下注射5 mg/kg的卡洛芬。
      注意：整个手术时间不应超过30分钟。若新生鼠全身麻醉时间超过30分钟，可能出现较差的术后结果。应通过充分的术区准备、以及缝合前用液体湿润皮肤等措施，尽量缩短手术时间，以减少缝线引起的皮肤撕裂。
2. 用浸有聚维酮碘的小纱布轻轻擦拭后腹壁，聚维酮碘作用1分钟后自然晾干。
3. 使用显微解剖剪刀和镊子，在肋缘下方沿左侧锁骨中线做0.5 cm的切口，并用镊子轻轻分离皮肤，再做第二层更深的切口进入腹膜腔（见 图1C，左图和中图）。
4. 使用显微解剖剪刀和镊子的钝端背面，从腹部两侧轻轻施加侧向压力，将左叶尖端挤出腹膜腔。左叶的尖端应清晰可见（图1C，右图）。
5. 从尖端开始，切除并称量需移除的组织量。
   1. 使用显微解剖剪刀，从左叶尖端轻轻切除所需量的组织。
   2. 将切除的组织放入含有PBS的1.5 mL离心管中。使用分析天平称量切除组织的质量（见 材料表）。
      注意：在天平上放置一片纱布或滤纸并去皮归零，然后将切除的组织置于纱布或滤纸上称重。
   3. 将切除部位在室温下用2%多聚甲醛固定1小时，随后置于干冰上冷却的OCT包埋剂中，用于冷冻切片分析。使用标准恒冷切片机切取7–10 µm的冷冻切片进行分析。
6. 用卷成团的纱布轻轻将左叶推回腹膜腔内。将纱布留置于腔内，直至出血停止。
7. 取出纱布，并用PBS浸湿的纱布轻轻擦拭手术部位及其周围区域。
8. 使用6-0单股非吸收缝线，采用连续缝合法关闭手术切口。腹膜和皮肤应分别缝合。
   注意：缝合前用PBS浸湿的纱布轻轻润湿皮肤，有助于减少缝线引起的皮肤撕裂。
9. 用PBS浸湿的纱布轻轻但彻底地清洁幼鼠，确保无血液或聚维酮碘残留。将浸湿的纱布卷成团，轻轻擦拭伤口周围，清除任何残留的血液或聚维酮碘。
   注意：此步骤尤为重要，因为若幼鼠清洁不彻底，母鼠可能会发生食仔行为。
10. 将幼鼠从鼻罩中取出，放置于恢复区域，该区域应包含暴露于母鼠粪便和尿液的纱布垫。待幼鼠苏醒后，将其放回装有母鼠垫料的空笼中。
    注意：不要使用加热灯。使用加热灯可能导致新生鼠体温过高。
11. 对所需数量的幼鼠重复上述操作。尽管所有幼鼠均可用于实验，但通常建议保留少数未手术的幼鼠，与手术组幼鼠一同归巢。
12. 将所有幼鼠同时连同母鼠的垫料一起放回母鼠笼中。

4. 回收与分析

1. 每天对小鼠进行随访观察。
   1. 检查伤口是否保持闭合，并移除任何死亡的幼崽（如有）。
   2. 如果伤口重新裂开，按照前述方法准备手术部位和恢复区域，并重复步骤 3.8 至 3.12。
   3. 术后24小时和48小时，皮下注射卡泊芬5 mg/kg。
   4. 对幼崽进行56天或更长时间的观察。
2. 在术后所需天数后，通过二氧化碳（CO₂）安乐死动物₂暴露与颈椎脱位。
   1. 将小鼠放入麻醉/安乐死舱内，并打开 CO₂ 直到小鼠停止呼吸。
   2. 通过颈椎脱位确保安乐死。用一只手的拇指和食指按压小鼠背部颈部，同时用另一只手向下拉尾部。
3. 切除整个肝脏 整块 并称重。
   1. 仔细分离每个叶并分别称重。
      注意：通过仔细解剖膈肌以及肝和门静脉血管来切除肝脏。在每个肝叶近端附着处进行精细解剖，将各肝叶彼此分离。
4. 通过比较截除的左叶质量与整个肝脏质量，确定再生程度。未受损的左叶质量约为整个肝脏质量的30%。

结果

图1A 详细展示了新生小鼠部分肝小叶切除术的时间线（示意图见图1B），以及预期观察到肝再生所需等待的时间。术后7-14天可观察到左叶的轻微再生，完全再生通常在术后56天观察到。小鼠术后应无任何生理异常表现。

接受部分肝小叶切除术的小鼠分别恢复了2、7、14、35和56天。这些小鼠在恢复后，受损左叶的苏木精-伊红（H&E）染色结果如图2所示。值得注意的是，术后56天时，被切除的左叶可能与未受伤的对照叶在形态上难以区分。此外，为进行比较，还对出生后14天（P14）的幼年小鼠进行了手术，并分别让其术后恢复7、14和56天（图S1）。

讨论

急性肝损伤的传统研究方法包括使用化学物质（如对乙酰氨基酚、乙醇、四氯化碳）或手术模型（如70%部分肝切除）。研究表明，70%部分肝切除后的再生反应涉及肝细胞的普遍肥大以及多轮细胞分裂^4,5。然而，为了防止出血，该模型必须结扎主要血管，从而造成异常的再生微环境，限制了其应用。因此，许多研究采用化学性损伤等侵入性较小的急性损伤模型，以保留肝脏整体结构，便于再生过程的发生。最近，Porrello et al. 和 Chang et al. 研究发现，心脏、指尖和耳部在急性损伤后，新生个体表现出显著不同的再生反应^7,8。这些结果与已有结论相呼应，即肝脏在新生儿期也经历一种独特的再生现象⁶。随着多个主要器官中出现类似的发现，出生后发育早期的再生能力正成为一个新兴研究领域，对干细胞生物学具有潜在的重要意义。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
动物
产后第0天幼崽的母鼠（任何品系）
代孕母鼠及代孕幼崽（可选）
名称	公司	目录编号	备注
常规试剂
磷酸盐缓冲液（PBS）
聚维酮碘或等效消毒液
名称	公司	目录编号	备注
手术器械
解剖显微镜	Zeiss	ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000
3mm直型弹簧显微剪刀	Vannas	72932-01
5SF镊子	Dumont	11252-00
直型Kelly止血钳	Grainger	17-050G
加热垫	Sunbeam	000771-810-000
异氟烷	Abbott Labs	0044-5260-05
啮齿类动物麻醉系统	Kent Scientific	1205S
纱布，10.16 × 10.16 cm	Fisher Scientific	13-761-52
名称	公司	目录编号	备注
常规设备
1.5 ml 微量离心管	Eppendorf	22363204
6-0 Monocryl 缝合线	Ethicon	MCP489G
培养皿	Fisher Scientific	S35839
Pipet-Aid，普通型，110V	Drummond	4-000-110
Mettler Toledo NewClassic ME 分析天平	Fisher Scientific	01-912-402
低成本诱导室	Kent Scientific	SOMNO-0730