Summary
Här presenterar vi en ny metod för partiell resektion av vänster nedsatt LOB i neonatal (dag 0) möss. Detta nya protokoll är lämplig för att studera akut leverskada och skada svar i neonatal inställningen.
Abstract
Morfologiska orgel förnyelse efter akut vävnad förlust är vanligt bland lägre ryggradsdjur, men observeras sällan i däggdjur postnatal liv. Vuxna lever förnyelse efter 70% partiell hepatectomy resulterar i hepatocyte hypertrofi med vissa replikering i återstående lober med restaurering av metabolisk aktivitet, men med permanent förlust av den skadade loben morfologi och arkitektur. Här, detalj vi en ny kirurgisk metod i det nyfödda barnet som lämnar en fysiologisk miljö bidrar till förnyelse. Denna modell innebär amputation av vänster LOB spetsen och en efterföljande konservativ behandlingsregim, och saknar nödvändigheten för ligering av stora levern kärl eller kemisk skada, lämnar en fysiologisk miljö där regenerering kan förekomma. Vi förlänga detta protokoll till amputationer på juvenil (P7-14) möss, under vilken den skadade levern övergångar från orgel förnyelse till kompensatoriska tillväxten av hypertrofi. Presenteras, kort 30 min protokollet ger en ram för att studera mekanismerna för regenerering, dess ålder-associerade nedgång hos däggdjur och karakterisering av förmodad nedsatt stammen eller stamfäder.
Introduction
Förmågan att regenerera ett organ, eller att återställa form och funktion, har ansetts vara mestadels förlorade evolutionära tiden. Regenerativ potentialen hos den vuxna däggdjur levern efter akut kemisk eller fysisk skada har befunnits innebära mobilisering av alla återstående hepatocyter vilket resulterar i vågor av hypertrofi och några rundor av celldelning, vilket resulterar i en funktionell men arkitektoniskt olika organ1,2,3,4,5. Studier har nyligen börjat karakterisera regenerativ svar på neonatal däggdjur organ skada inom den första veckan av livet6,7,8. Dessa studier har visat att när skadad under neonatal utveckling, svarar vissa däggdjur organ med morfologiska förnyelse i stället för kompenserande tillväxt eller fibros7,8.
Nyligen genomförda studier har visat att förnyelse av både globala struktur och funktion uppstår under den tidiga neonatala periodiska6,7,8. Etablerade leverskada protokoll innebär kemisk skada eller administrering av etanol9,10,11, paracetamol12,13,14,15 , koltetraklorid16,17,18,19, 70% partiell hepatectomy4,20,21, eller avlägsnande av vänster och Median lober. Kemiska administration leder till hepatocyte celldöd, men ofta lämnar mikro - och makro-strukturer intakta. Morphologic förnyelse kan inte lätt studeras i detta sammanhang som den övergripande nedsatt arkitekturen inte var utplånas. Den 70% partiell hepatectomy innebär suturen ligering av större fartyg, som är nödvändiga för att stoppa blödning, men lämnar en icke-fysiologisk miljö med permanent avbrott i kärlsystemet. Dessutom denna metod endast använts på vuxna gnagare, och dess tillämpning på nyfödda är tekniskt mycket svårt. Med detta i åtanke vi utvecklat en metod där 20-30% av spetsen av den vänstra loben avlägsnas i en nyfödd P0-mus (figur 1A-1B). Denna metod är kirurgiskt konservativ, minimalt invasiv, inte tekniskt utmanande, och leder till brutto förlust av morfologi utan ligering av kärlsystemet, vilket lämnar utrymme för förnyelse ska ske. Protokollet för det resulterande stegvisa, beskrivs nedan, kan för någon forskare att utföra en partiell lobulär hepatectomy på neonatala möss för att studera däggdjur neonatal förnyelse i de tidiga stadierna av postnatal liv. Denna metod har också tydliga ansökningar till jämförande studier inom regenerativ medicin och stamcellsbiologi, eftersom den kan användas i levern under senare skeden av livet.
De vanligaste akut leverskada studierna är kemiskt-inducerad skada, vuxen lever amputation eller 70% partiell hepatectomy. Kemiska skador ofta innebär intravenös, intraperitoneal eller oral administrering av paracetamol, koltetraklorid eller etanol, och är en relativt lätt och icke-invasiv skador modell. Som tidigare diskuterats, kemiska skador resulterar i hepatocyte celldöd, men ofta bladen stroma och parenkymet strukturer intakta, vilket gör det svårt att göra påståenden om morphologic regenerering. Kemiska skador centers ofta på nedsatt fartyg, vilket gör det till en användbar teknik för att studera webbplats och cell-specifika skada, men också gör det svårt att förhöra, på nivån hela orgel, andra populationer som får befinna sig längre från fartyg och som kan bidra till förnyelse. Trots dessa begränsningar, kemiska skador är fortfarande en användbar och mycket fysiologiskt relevanta skador modell.
Vuxen 70% partiell hepatectomy innebär avlägsnande av vänster och median loberna efter ligering av nedsatt kärlsystemet. Att bemöta hepatectomy har karakteriserats väl: amputerade levern 14 dagar post 70% partiell hepatectomy framkallar en grovt annan arkitektur än den ursprungliga oskadade loben, som hepatocyterna av resterande höger och caudatus loberna genomgå hypertrofi och ett par rundor av celldelning4,5. Detta gör upp förlorade massa och funktion, men misslyckas att regenerera två amputerade loberna och därför ersätta inte brutto morfologi. Som ett resultat, är 70% partiell hepatectomy skada svar användbart att studera kompensatoriska tillväxten mekanismer med begränsad regenerering.
Här beskriver vi fullt ett protokoll för en neonatal partiell lobulär hepatectomy. Förfarandet innebär att lämpliga djur urval och förberedelse, operationsområdet förberedelse, operation och återhämtning. Optimering och anpassning av dessa steg kan krävas för olika tillämpningar av protokollet.
Vi har i stor utsträckning utfört och optimerad detta protokoll på vildtyp C57BL/6J valpar (JAX 000664), dock för att studera olika cellpopulationer och mekanismer för regenerering, vi använde också olika transgena djur inklusive möss härbärgerat olika Cre och CreERT2 transgener eller knock-ins (Axin2CreERT2 JAX 018867, och Sox9CreERT2 JAX 018829) i kombination med fluorescerande reportrar, såsom de Rainbow och mTmG system (R26VT2/GK3, R26 mT/mG) 22 , 23. Vi hittade ingen anledning att ändra denna metod för olika mus stammar, som observerades inga skillnader i överlevnad utfall eller regenerativ potential.
Förutom att använda olika djura stammar, genomfört vi även partiell lobulär hepatectomies på neonatala möss behandlades med små molekyler, såsom 4-hydroxi-tamoxifen och 5-ethynyl-2′-deoxiuridin (EdU). Dimetyl sulfoxid (DMSO) och etanol användes som lösningsmedel, eftersom det konstaterades att majs olja var en betydande orsak till sjuklighet. Vi hittade annars att intraperitoneal administrering av små molekyler inte påverkar överlevnad eller regenerativ resultat. Vi förutspår att detta protokoll kommer att anpassas för användning med andra små molekyler att förhöra olika aspekter av regenerering.
Neonatal mus operationer kan vara tekniskt utmanande och kan kräva särskild sakkunskap i djurhantering och mikroskopisk dissektion. Djurhållningen expertis är nödvändig för att undvika maternell kannibalism efter operationen och under den omedelbara återhämtningsperioden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur experiment utfördes i strikt överensstämmelse med de riktlinjer som anges av föreningen för bedömning och ackreditering av Laboratory Animal Care International (AAALAC) och Stanford University administrativa panelen på försöksdjur Vård (APLAC), (protokollnummer #10266) och i USA, eller Europeiska djurskyddslagen, direktiv 2010/63/EU. Protokollet godkändes av kommittén för etik av djur experimenten av regeringen av Bayern, Tyskland, och fått behörigheten inte: 55.2-1-54-2532-150-2015.
1. animaliskt förberedelse
- Förbereda en tom bur med lämpliga sängkläder på en värmedyna.
- Före att röra djur med handskar, gnugga moderns sängkläder på handskarna.
- Ta bort alla valpar från sin mor och plats in i tomma buren. Ta bort några av moderns sängkläder och placera den i tom bur med valparna.
- Placera mor i en separat, torr bur från operationsområdet.
- Don nya, rena sterila handskar innan operationsområdet förberedelse.
2. operationsområdet förberedelse
- Med pipett 10 mL, tillsätt 10 mL av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en 10-cm petriskål.
- Överför med pipett 2 mL betadine eller motsvarande anti-septiska lösning i 10-cm petriskål.
- Placera en dissekera omfattning på operationsområdet. Aktivera dissekera omfattning lampa och justera ljusnivån till kirurgens komfort. En valp kan placeras i operationsområdet under lampan dissekera omfattning. Tillräckligt med ljus kan bekräftas genom avsaknad av skuggor på den ventrala ytan av pup.
- Förbereda isofluran anestesi kammaren (se Tabell för material) med en Kona. Kammaren bör rengöras utan bevis av urin och avföring. Placera näsan konen och associerade slangar dissekera omfattas i operationsområdet. Avleda flödet av syre och isofluran enbart till näsan konen.
- Förbereda en postoperativ återhämtning område med en värmedyna på ca 37 ° C. Postoperativa återhämtningen bör bestå av 4 bitar av gasbinda som placeras ovanpå värmedyna. Om möjligt, gnugga Flor Madrassera i moderns sängkläder, avföring och urin att bevara mammans doft.
Obs: Det är oklokt att använda en värmelampa, eftersom detta gör det svårt att styra temperaturen. Förhöjda temperaturer resulterar i döden av neonatala möss. - Förbereda och sterilisera alla kirurgiska instrument med en autoklav. Verktyg behövs inkluderar: micro-dissekera saxen, mikro-dissekera pincett, gasväv, hemostat och några 6-0 monofilament icke-resorberbar sutur. Kirurgiska instrument kan vara resterilzed med några glas pärla autoklaven.
3. partiell lobulär Hepatectomy
- Söva pup genom att placera den i näsan konen på dess baksida och försiktigt tejpa sina fötter och händer på plats. Valpen bör ta emot 5% isofluran i syre.
- Låt den pup till sitta i 5 min eller tills tillfredsställande sövda, vilket kan kontrolleras genom en tå nypa.
- Injicera 5 mg/kg av karprofen subkutant innan snittet.
Obs: Hela operationen bör inte ta mer än 30 min. sämre utfall kan observeras hos nyfödda barn som är under narkos för över 30 min. Vidta försiktighetsåtgärder för att minimera längden på kirurgi genom grundlig fältet förberedelser och fuktning av huden före stängning att minimera suturen inducerad hudflikar.
- Försiktigt torka bort den bakre bukväggen med en liten kompress våt med betadine. Låt betadine torka i 1 min.
- Gör en vänster mitten-nyckelben 0,5 cm snitt omedelbart nedanför revbenen med mikro-dissekera sax och pincett. Försiktigt separera huden med hjälp av pincetten och göra en andra djupare snitt in i bukhålan (se figur 1 c, vänster och center)
- Applicera försiktigt laterala trycket från båda sidor av buken använder ryggen, trubbiga ändar av mikro-dissekera sax och pincett för att tvinga spetsen av den vänstra loben ur i bukhålan. Vänstra toppen av den vänstra loben bör vara enkelt visualiseras (figur 1 c, höger).
-
Från spetsen, amputera och väger mängden vävnad tas bort.
- Med mikro-dissektion sax, försiktigt att amputera önskad mängd vävnad från toppen av den vänstra loben.
- Placera den amputerade vävnaden i en 1,5 mL tub fylld med PBS. Väger den amputerade vävnaden med hjälp av en Analysvåg (se Tabell för material).
Obs: Placera en bit gasväv eller papper på balansen och Taravikt det. Sedan placera den amputerade vävnaden på gasväv eller papper och mäta dess massa. - Fixa det amputerade området i 2% PARAFORMALDEHYD i rumstemperatur i 1 h och plats i optimal skärtemperatur (ULT) förening över torr-is för frusna delen analys. Analysera frusna snitt av skärande 7-10 µm sektioner med någon standard kryostaten.
- Använder en rullade bit gasbinda, försiktigt ersätta den vänstra loben in i bukhålan. Lämna gasväv i hålrummet tills blödningen upphör.
- Ta bort gasväv och våta operationsområdet och det omgivande området med en kompress indränkt med PBS.
- Stäng av operationsområdet med 6-0 monofilament, icke-resorberbara suturer med en rakstygn. Den bukhinnan och hud bör vara stängda separat.
Obs: Försiktigt blöta huden med en kompress indränkt med PBS kan minimera suturen inducerad tårar. - Varsamt men noggrant rengör valpen med en kompress indränkt med PBS och säkerställa att inga blod- eller betadine kvarlevor. Rulla den indränkt kompress och försiktigt skrubba över skylten såret att rensa bort eventuella blod eller betadine.
Obs: Detta är särskilt viktigt eftersom mor kan kannibalisera valparna om de rengörs otillräckligt. - Ta bort pup från näsan konen och placera den på området återställning som innehåller de Flor Madrassera utsätts för mammans avföring och urin. När pup återvinner, ersätta pup i tom bur med moderns sängkläder.
Obs: Använd inte en värmelampa. Användning av en värmelampa kan orsaka nyfödda överhettas. - Upprepa proceduren på önskat antal valpar. Även om alla valpar kan användas, är det allmänt tillrådligt att lämna några ungar inte opererade bytas tillsammans med den opererade pups.
- Ersätta alla ungar samtidigt med sin mors sängkläder i moderns bur.
4. återhämtning och analys
-
Följa upp möss dagligen.
- Kontrollera att såret är stängd och ta bort eventuella döda ungar, om den finns.
- Om såret återöppnar, förbereda området kirurgiska webbplats och återhämtning som tidigare beskrivits, och upprepa steg 3,8 till 3.12.
- Injicera 5 mg/kg av carpofen subkutant 24 och 48 h efter förfarandet.
- Följ valparna på 56 dagar eller mer.
- Euthanize djuren efter önskad mängd postoperativa dagarna av koldioxid (CO2) exponering och cervikal dislokation.
- Placera möss i induktion / dödshjälp kammare och slå på CO2 tills möss slutar andas.
- Säkerställa dödshjälp genom cervikal dislokation. Tryck ned musen använder den fore-tummen och pekfingret dorsala hals och med den andra handen, dra ner på svansen.
-
Ta bort de hela levern i klump och tynga.
- Försiktigt separera varje lob och väga separat.
Obs: Ta bort levern genom noggrann dissektion av membran och nedsatt och portalen fartyg. Separera loberna från varandra genom noggrant dissekera varje lob på dess proximala fastsättning.
- Försiktigt separera varje lob och väga separat.
- Avgöra omfattningen av regenerering genom att jämföra massan av de amputerade vänster LOB till massan av hela levern. En oskadd vänster LOB är cirka 30% av hela levern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A Detaljer en allmän tidslinje av den neonatala partiell lobulär hepatectomy (schematiskt i figur 1B), och den förväntade tid vänta tills regenerering observeras. Subtila regenerering av den vänstra loben kan vara observerade 7-14 dagar efter operation. Fullständig regenerering observerades ofta efter 56 dagar efter operation. Möss ska visa några tecken på fysiologiska avvikelser efter operation.
Möss som genomgick partiell lobulär hepatectomies tilläts att återvinna för 2, 7, 14, 35, och 56 dagar. Hematoxylin och eosin (H & E) skadade vänster lober från dessa möss efter återställning visas i figur 2. Särskilt efter 56 dagar, kan den amputerade vänstra loben ser omöjlig att skilja från kontroll, oskadd lober. Operationer som görs på P14 juvenil möss var gjort för jämförelse och tillåtet att återvinna för 7, efter 14, och 56 dagar kirurgi (Figur S1).
För att karakterisera neonatal regenerering, 45 möss genomgick partiell lobulär hepatectomy vid dag 0 och massorna av alla deras lober togs 56 dagar efter operation. Massan av den skadade vänster LOB genomgick en större förändring i massa jämfört med de andra oskadda median, höger, och caudatus lober (figur 3A) och oskadd kontroller, närmar sig massan av en oskadd vänster LOB på P56. Detta indikerar att regenerering följande neonatal leverskada är lokaliserad till den vänstra loben. Operationer som görs på P14 juvenil möss var gjort för jämförelse, som visade minskad förnyelse i vänster LOB och ökad ersättning från oskadd loberna (figur 3B), vilket indikerar att av 14 dagar, skada svar akut resektion bytte från LOB specifika förnyelse till globala ersättning. Ytterligare karakterisering skedde genom färgning områden av vänster LOB från skadade möss på postoperativ dag 56 med fintrådiga aktin (f-aktin) att visualisera cellmembran (figur 4A). Områden distala och proximala till området skada jämfördes oskadd kontroller och vuxen lober 14 dagar efter 70% partiell hepatectomies. Hepatocyter befanns ha liknande områden som oskadd kontroller, om 1,5-2 x mindre än vuxna möss som genomgår förnyelse efter klassiskt 70% partiell hepatectomy (figur 4B). Detta tyder på att hypertrofi inte spelar en roll i regenerering. Slutligen, neonatala möss injicerades med 0,025 mg 5-ethynyl-2'-deoxiuridin (EdU) i 90% PBS och 10% etanol och 1, 3, 5, 7 och 14 dagar efter operation. Antalet EdU positiva celler räknades från möss som får återhämta sig i 7 dagar efter operation (figur 4 c). En betydande ökning av antalet EdU positiva celler hittades i den skadade/regenererande vänster LOB jämfört med oskadd kontroller, vilket indikerar att cellproliferation bidrar till neonatal regenerering.
Figur 1: partiell lobulär Hepatectomy översikt. (A) En allmän Schematisk och tidslinje för den partiella lobulär hepatectomy visas med neonatal leversjukdom resektion göras på P0. Analyser gjordes på P7, P14, P35 eller P56. Resektioner var också försökt på P7 och P14. (B) en schematisk bild av omfattningen av resektion av den vänstra loben visas avgränsar 20 och 30% resektioner. (Denna siffra har ändrats från Tsai et al.) 6. (C) bilder från neonatal operationer visar: höger sidiga mid-clavikularleds snitt (vänster, mitten) och exponering av vänster LOB apexen (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Regeneration efter partiell lobulär Hepatectomy. Möss som genomgick partiell lobulär hepatectomies på P0 följdes under 2, 7, 14, 35, och 56 dagar. Lever var fixeras och färgas med H & E, och omfattningen av regenerering av vänster apexen noterades. Pilarna anger områden där regenerering inträffade i P0 möss. Skalstapeln är 1 cm. Denna siffra ändrades från Tsai et al. 6 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: förnyelse per LOB efter partiell lobulär Hepatectomy. (A) möss som genomgått partiell lobulär hepatectomies på P0 analyserades 7, 35 och 56 dagar postoperativt. Möss var euthanized och massorna av alla lober från skadade möss (röd) togs och jämfört med ålder matchade massorna oskadd kontroll (röd). (B) Möss som genomgick partiell lobulär hepatectomies på P14 analyserades 7, 35 och 56 dagar postoperativt. Massorna av alla lober från skadade möss (röd) togs och jämfört med massor av oskadd kontroll (röd). * = p < 0,05, ** = p < 0,005, *** = p < 0,0005, NS = inte betydande. Detta räknat har ändrats från Tsai et al. 6 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: karakterisering av regenerering Post Hepatectomy. (A) möss som genomgått partiell lobulär hepatectomies på P0 var analyserat 56 dagar efter resektion och färgas för F-aktin. 14 dagar efter 70% partiell hepatectomy visas bilder av fläckar från områden proximala och distala till området för amputation, samt från och med åldersmatchade oskadd kontroller och vuxna möss. Skala barer är 100 µm. (B) områden av hepatocyter efter skada på områden proximala eller distala till webbplatsen resektion jämfördes med områden av hepatocyter från oskadd kontroller och vuxen 70% partiell hepatectomies.* = p < 0,05, ** = p < 0,005, *** = p < 0,0005, *** = p < 0,00005, NS = inte betydande. (C) möss som genomgår lobulär hepatectomies på P0 behandlades med EdU och analyserades 7 dagar efter resektion. EdU+ celler i den vänstra loben visas. (Skala bar, 100 µm). (D) kvantifiering av EdU+ celler i möss som behandlats med EdU 7 och 14 dagar efter partiell lobulär hepatectomy jämfört med kontroller. Värden är medel ± SEM. Detta tänkte man har ändrat från Tsai et al. 6 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur S1: ofullständig regenerering av juvenil möss. Möss som genomgick partiell lobulär hepatectomies på P14 följdes i 7, 35 och 56 dagar. Lever var fixeras och färgas med H & E och omfattningen av regenerering av vänster apexen noterades. Pilarna anger områden där regenerering inträffade i P0 möss. Skalstapeln är 1 cm. Detta tänkte ändrades från Tsai et al. 6 Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Akut leverskada har traditionellt studerats med hjälp av kemiska (paracetamol, etanol, koltetraklorid) eller kirurgisk modeller (70% partiell hepatectomy). Regenerativ svaret efter 70% partiell hepatectomy karaktäriserats för att engagera globala hepatocyte hypertrofi och flera rundor av celldelning4,5. För att stoppa blödningen, är denna modell dock begränsad, eftersom de största fartyg måste vara sammanskrivna lämnar en onormal miljö för regenerering. Många studier har därför anställt andra mindre invasiva modeller för akut skada genom kemiska skador, lämnar brutto arkitekturen för regenerering inträffar. Nyligen, Porrello et al. och Chang et al. har visat en markant olika neonatal regenerativ svar efter akut skada i hjärtat, siffran tips och öron7,8. Deras resultat parallell presenteras slutsatser att levern också genomgår en distinkt regenerativ fenomen i neonatal liv6. Med flera liknande fynd i viktiga organ är förnyelse i de tidiga stadierna av postnatal utveckling en framväxande område med potentiella konsekvenser för stamcellsbiologi.
Tidig dödlighet från neonatal partiell lobulär hepatectomies kommer ofta från otillräcklig återhämtning, stora blödningar eller mödrars försummelse. Som nämnts tidigare, användning av en högre intensitet värmekälla såsom en värmelampa för återhämtning, kan leda till döden efter kirurgi. Neonatala möss är beroende av sin mor för minst de första två veckorna i livet. Samtidigt, kommer mor ofta försummar och eller kannibalisera sina ungar om hon känner en abnormitet (till exempel doften av blod eller andra kemikalier)24,25. Det är därför mycket viktigt att det nyfödda barnet är rengöras grundligt postoperativt och gnuggade med moderns sängkläder att maskera någon offensiv dofter. Om dessa frågor hanteras tillfredsställande, kan överlevnad nå upp till 100%. Om moderns kannibalism blir ett problem, kan valparna placeras in i en bur med en surrogatmamma med några av hennes egna ungar. Om så är fallet, Använd surrogat moderns sängkläder i föregående steg.
Resektion av 20-30% av neonatal vänster LOB och efterföljande regenerering är sannolikt inte inneboende endast på vänster LOB. För närvarande, denna metod har endast testats till vänster, som utsätter medianen och mer bakre höger och caudatus lober skulle kräva en större laparotomi, vilket resulterar i en högre risk för blödning och, indirekt, en högre risk för maternell kannibalism för den nyfödda barnet. Dock om mekanismerna för neonatal regenerering är heterogena i levern är en viktig fråga att behandlas, och kirurgiska justeringar till detta protokoll bör därför göras att förhöra andra nedsatt loberna.
Resultaten från dessa neonatal hepatectomy studier har visat en tidsperiod (P0-P7) under vilken förnyelse är kan uppstå. Liknande nedsatt resektioner har gjorts på juvenil möss (P7, P10, P14) och resulterar inte i fullständig regenerering med påvisad ärr och fibros, märkning ett tydligt område där Amputationen inträffade. Även om den skada reaktion i juvenil möss efter partiell lobulär hepatectomy inte var i fokus för en inledande studie, skillnaderna i regenerativ potential mellan neonatala och juvenila möss och förlusten av förmågan att rekonstruera organ och vävnad arkitektur, kommer att vara nödvändig för att förstå vilken mekanism stamceller eller stamceller cell neonatal regenerering sker.
Vi har tidigare visat att neonatal regenererad lever inte bara visas samma i arkitektur och struktur, men är också omöjlig att skilja av funktion. Immunofluorescens fläckar för funktionella leverenzymer såsom glutamin kväveoxidsyntas (GS), carbamoylphosphate kväveoxidsyntas (CPS) och cytokrom p450 2E1 visar en liknande fördelning inom regenererad områden jämfört med oskadd lober. Den sekundära regenerativa potentialen hos en regenererad nyfödda har dock inte testats. Neonatala möss får återhämtning i 56 dagar är fysiologiskt omöjlig att skilja från oskadd kontroller, är det troligt att den klassiska regenerativ svar efter vuxen 70% partiell hepatectomy skulle inträffa. Men här lever regenerering begränsas ofta av hepatocyte utmattning och seriell hepatectomies efter partiell lobulär hepatectomies är därför en viktig studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga upplysningar.
Acknowledgments
Vi tackar P. Chu för att utföra H & E och histologi; och C. Wang och A. McCarty för bra diskussioner. Forskning stöddes genom finansiering från Virginia och D. K. Ludwig Fund för cancerforskning; den nationella hjärta, lunga och Blood Institute (R01HL058770 och U01HL099999); och California Institute for Regenerative Medicine (RC1 00354) bidrag till I.W. Y.R. stöddes av den Human Frontier Science Program karriär Development Award (CDA00017), den tyska forskningsfondens (RI 2787/1), Siebel Stem Cell Institute, och den Thomas och Stacey Siebel Foundation (1119368-104-GHBJI). J.M.T. stöddes av NIH (T32GM007365), National Research Service Award (1F30DK108561), och Paul och Daisy Soros Fellowship för nya amerikaner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain) | |||
| Surrogate mother and surrogate litter (optional) | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Reagents | |||
| Phosphate Buffered Serum (PBS) | |||
| Providine-iodine or equivalent antiseptic solution | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Dissecting microscope | Zeiss | ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000 | |
| 3mm straight spring micro scissors | Vannas | 72932-01 | |
| 5SF Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| Straight Kelly forceps | Grainger | 17-050G | |
| Heating pad | Sunbeam | 000771-810-000 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | 0044-5260-05 | |
| Rodent Anesthesia System | Kent Scientific | 1205S | |
| Gauze, 10.16 x 10.16cm | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Equipment | |||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Eppendorf | 22363204 | |
| 6-0 monocryl sutures | Ethicon | MCP489G | |
| Petri dish | Fisher Scientific | S35839 | |
| Pipet-Aid, Plain, 110V | Drummond | 4-000-110 | |
| Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances | Fisher Scientific | 01-912-402 | |
| Low Cost Induction Chamber | Kent Scientific | SOMNO-0730 |
References
- Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver Regeneration. Science. 276 (80), 60-66 (1997).
- Ponfick, V. A. Surgery of the Liver. Lancet. 1, 881 (1890).
- Higgins, G., Anderson, R. M. Experimental Pathology of the liver. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch. Pathol. 12, 186-202 (1931).
- Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and unconventional cell division of hepatocytes underlie liver regeneration. Curr. Biol. 22, 1166-1175 (2012).
- Miyaoka, Y., Miyajima, A. To divide or not to divide: revisiting liver regeneration. Cell Div. 8, 8 (2013).
- Tsai, J. M., et al. Localized hepatic lobular regeneration by central-vein-associated lineage-restricted progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, 3654-3659 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Shyh-Chang, N., et al. Lin28 enhances tissue repair by reprogramming cellular metabolism. Cell. 155, 778-792 (2013).
- Yin, M., et al. Essential role of tumor necrosis factor alpha in alcohol-induced liver injury in mice. Gastroenterology. 117, 942-952 (1999).
- Gao, B., Bataller, R. Alcoholic liver disease: pathogenesis and new therapeutic targets. Gastroenterology. 141, 1572-1585 (2011).
- Uesugi, T., Froh, M., Arteel, G. E., Bradford, B. U., Thurman, R. G. Toll-like receptor 4 is involved in the mechanism of early alcohol-induced liver injury in mice. Hepatology. 34, 101-108 (2001).
- Coen, M., et al. An integrated metabonomic investigation of acetaminophen toxicity in the mouse using NMR spectroscopy. Chem. Res. Toxicol. 16, 295-303 (2003).
- Oz, H. S., et al. Diverse antioxidants protect against acetaminophen hepatotoxicity. J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 361-368 (2004).
- Ruepp, S. U., Tonge, R. P., Shaw, J., Wallis, N., Pognan, F. Genomics and proteomics analysis of acetaminophen toxicity in mouse liver. Toxicol. Sci. 65, 135-150 (2002).
- Gunawan, B. K., et al. c-Jun N-terminal kinase plays a major role in murine acetaminophen hepatotoxicity. Gastroenterology. 131, 165-178 (2006).
- Manibusan, M. K., Odin, M., Eastmond, D. a Postulated carbon tetrachloride mode of action: a review. J. Environ. Sci. Health. C. Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 25, 185-209 (2007).
- Recknagel, R. O., Glende, E. a, Dolak, J. a, Waller, R. L.
- Sell, S. Heterogeneity and plasticity of hepatocyte lineage cells. Hepatology. 33, 738-750 (2001).
- Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J. Clin. Invest. 121, 4850-4860 (2011).
- Greene, A. K., Puder, M. Partial hepatectomy in the mouse: technique and perioperative management. J. Invest. Surg. 16, 99-102 (2003).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. FASEB J. 23, 3516-3525 (2009).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A Global Double-Fluorescent Cre Reporter Mouse. Genesis. 605, 593-605 (2007).
- Poley, W. Emotionality related to maternal cannibalism in BALB and C57BL mice. Anim. Learn. Behav. 2, 241-244 (1974).
- Smotherman, W. P., Bell, R. W., Starzec, J., Elias, J., Zachman, T. A. Maternal responses to infant vocalizations and olfactory cues in rats and mice. Behav. Biol. 12, 55-66 (1974).
