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一种基于多孔板格式聚丙烯酰胺的检测方法，用于研究细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响

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DOI：

10.3791/57361

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2018年7月5日

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine, 2Department of Mechanical and Aerospace Engineering, University of California San Diego, 3Departments of Biochemistry, Microbiology and Immunology and Howard Hughes Medical Institute, Stanford University School of Medicine

本文内容

摘要

我们开发了一种基于多孔板格式的聚丙烯酰胺检测方法，用于研究细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响。该检测方法可与流式细胞术、免疫染色以及牵引力显微镜兼容，能够对细胞、其细胞外基质与致病菌之间的生物力学相互作用进行定量测量。

摘要

细胞外基质刚度是多种已知可影响细胞行为、功能及命运的微环境力学刺激之一。尽管越来越多的贴壁细胞类型对基质刚度的响应已被表征，但贴壁细胞对细菌感染的易感性如何依赖于基质刚度仍 largely 未知，细菌感染对宿主细胞生物力学特性的影响也同样不清楚。我们假设，宿主内皮细胞对细菌感染的易感性取决于其所在基质的刚度，且细菌感染宿主细胞后会改变其生物力学特性。为验证这两个假设，本研究采用内皮细胞作为宿主模型，单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）作为病原体模型。通过建立一种新型的多孔板检测方法，我们证明可通过流式细胞术结合免疫染色和显微镜观察，定量评估基质刚度对L. monocytogenes感染内皮细胞的影响。此外，利用牵引力显微镜技术，可研究L. monocytogenes感染对宿主内皮细胞生物力学的影响。该方法可用于分析组织相关力学特性对贴壁细胞细菌感染的影响，这是理解细胞、其细胞外基质与致病菌之间生物力学相互作用的关键步骤。该方法还可广泛适用于其他多种涉及细胞生物力学及对基底刚度响应的研究，尤其适用于需要在单次实验中并行完成大量重复样本的研究场景。

引言

大多数动物组织中的细胞通常具有黏附性，能够与邻近细胞以及细胞外基质（ECM）相黏附。细胞与ECM的锚定对于多种细胞过程至关重要，包括细胞运动、增殖和存活。1,2细胞对细胞外基质（ECM）的锚定依赖于ECM的组成和刚度。细胞通过动态重排其细胞骨架、细胞-ECM黏附及细胞-细胞黏附来响应ECM刚度的变化，进而显著改变细胞的生物力学特性和功能。3,4,5,6。细胞外基质（ECM）的刚度在空间上可能有所不同（即，解剖位置），在时间上（即，衰老），以及在病理生理过程（例如动脉硬化，癌症，感染 等等。例如，普遍认为，位于较硬基质上的内皮细胞与位于较软基质上的相比，会对其细胞外基质（ECM）及彼此之间施加更大的作用力，并表现出更高的迁移性和增殖活性。7,8同样，位于较硬基质上的成纤维细胞对其细胞外基质施加较高的收缩力，并表现出增殖、迁移和细胞外基质生成增加9,10,11尽管不同细胞类型的细胞力学特性及其对细胞外基质（ECM）刚度的响应已被广泛研究，但黏附性宿主细胞、其细胞外基质的刚度与细菌感染之间的关系在很大程度上仍不清楚。

为了研究细胞外基质刚度在细菌-宿主细胞相互作用中的作用， L. monocytogenes 单核细胞增生李斯特菌（Lm）被选为模式病原体。Lm 是一种普遍存在的食源性细菌，可在多种哺乳动物宿主中引起全身性感染。这种兼性胞内病原体可通过穿越不同类型的血管内皮，从肠道上皮迁移至远端器官。若其突破血脑屏障，可导致脑膜炎；当其穿过胎盘屏障时，则可引发自然流产。12,13单核细胞增生李斯特菌（Lm）可感染多种宿主细胞类型，并可通过不同的致病策略实现感染。目前对Lm感染的研究主要集中于上皮细胞，而关于Lm如何感染并穿越血管腔内衬的内皮细胞，相关了解仍较为有限。14,15,16此外，细胞外基质（ECM）的刚度如何调控李斯特菌（Lm）侵入其宿主内皮细胞并进一步扩散的能力，在很大程度上仍不清楚。Lm 以及多种其他细菌物种（即, Rickettsia parkeri利用其感染的宿主细胞的肌动蛋白细胞骨架，以侵入细胞质并促进细胞间的扩散17,18,19它们通过表达特定蛋白质，干扰宿主细胞的肌动蛋白聚合通路，并产生肌动蛋白彗尾，从而实现向前推进。16,20由于感染，宿主细胞的肌动蛋白细胞骨架需要发生动态重排，这一过程目前尚未被完全阐明，可能会影响宿主细胞的生物力学特性，包括细胞对其细胞外基质（ECM）以及彼此之间施加的物理力。为了研究这些过程，选择人微血管内皮细胞（HMEC-1）作为模型宿主细胞，原因如下：1. 内皮细胞已知具有高度的机械敏感性，因其持续暴露于多种变化的物理刺激之下21；2. 单核细胞增生李斯特菌（Lm）感染内皮细胞的策略在很大程度上仍不清楚22；3. HMEC-1 是一种永生化细胞系，因此易于培养并可进行遗传操作。

宿主细胞的细菌感染研究主要在体外（in vitro）进行，通常将细胞接种于玻璃或聚苯乙烯基底上，而这些基底的刚度显著高于大多数细胞的生理细胞外基质（ECM）12,14,23。为了研究接种于具有生理相关刚度的基质上的细胞感染情况，并阐明ECM刚度对细菌病原体感染细胞的影响，我们采用了一种创新方法，即在多孔板上制备可调节刚度的、嵌有微珠的薄层聚丙烯酰胺水凝胶。该方法的新颖之处在于，其多孔板格式可实现多种条件的同时监测，且由于基底的特殊构建方式，可与多种技术兼容。将HMEC-1细胞接种于这些蛋白包被的水凝胶上，随后用不同单核细胞增生李斯特菌（Lm）菌株感染，这些菌株在被内化后可产生荧光，或本身具有组成性荧光。通过流式细胞术评估ECM刚度对宿主HMEC-1细胞感染易感性的影响。此外，采用免疫荧光染色和荧光显微镜技术区分黏附于细胞表面与已被内化的细菌。最后，成功实施牵引力显微镜（Traction Force Microscopy, TFM），以表征Lm感染对宿主内皮细胞在感染过程中施加于基质的牵引应力的影响。本研究所展示的检测方法可轻松改造，用于进一步研究ECM刚度对不同细胞系或病原体感染下贴壁细胞感染易感性的影响。

方案

1. 在多孔板上制备薄双层聚丙烯酰胺（PA）水凝胶

  1. 将过硫酸铵（APS）溶于超纯蒸馏水中，配制成终浓度为 10 g/mL 的溶液。分装后于 4 °C 保存，用于短期使用（3 周）。
    注意：上述溶液可在水凝胶制备前预先配制。
  2. 24 孔板的玻璃活化
    1. 将带玻璃底的 24 孔板（孔径 13 mm，参见材料表）每孔加入 500 µL 2 M NaOH，在室温下孵育 1 小时。
    2. 用超纯水冲洗各孔 1 次，然后每孔加入 500 µL 含 2% (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（参见材料表）的 95% 乙醇溶液，孵育 5 分钟。
    3. 再次用水冲洗各孔 1 次，每孔加入 500 µL 0.5% 戊二醛，孵育 30 分钟。用水冲洗各孔 1 次，然后在 60 °C 下敞盖烘干。

聚合物涂层工艺示意图，包含聚酰胺（PA）溶液、紫外光活化、胶原蛋白及细胞接种步骤。
图1在具有不同刚度的荧光微球嵌入型双层聚丙烯酰胺（PA）水凝胶上培养的宿主细胞的细菌感染实验。A. 玻璃盖玻片经过化学修饰以实现水凝胶的附着。 B. 3.6 µL 将PA混合物沉积在玻璃底部。 C用12 mm圆形玻璃盖玻片覆盖混合物，以促进聚合。 D用针头注射器移除盖玻片。 E. 2.4 µL 将含有微珠的PA溶液加到底层上方，并用圆形玻璃盖玻片封片。 F在孔中加入缓冲液，然后移去盖玻片。 G紫外线照射1小时可确保灭菌。 H将含有 Sulfo-SANPAH 的溶液加入凝胶中，随后将凝胶置于紫外光下照射 10 分钟。 I水凝胶用缓冲液洗涤后，与I型胶原蛋白共同孵育过夜。 J水凝胶用细胞培养基进行平衡。 K将宿主细胞接种。 L. 将 Lm 细菌加入溶液中，并通过离心实现感染的同步化。 M感染后1小时，洗去溶液中的细菌，并加入含抗生素的培养基。 N感染后4小时，Lm（JAT985）开始发出荧光。 OHMEC-1 细胞从基质上解离后，将溶液转移至离心管中，用于进行流式细胞术检测。请注意，图中还标注了实验各步骤的天数及大致时间。该图已根据 Bastounis 和 Theriot 的原图修改59. 请点击此处以查看此图的放大版本。

  1. 聚丙烯酰胺水凝胶的制备
    注意：参见 图1。
    1. 配制含有3–10%的40%储备丙烯酰胺溶液（见材料表）和0.06–0.6%的2%储备双丙烯酰胺溶液（见材料表）的水溶液，以制备弹性模量范围为0.6 kPa至70 kPa的可调刚性水凝胶。参见表1。
      1. 对于0.6 kPa水凝胶，混合3%丙烯酰胺与0.045%双丙烯酰胺；对于3 kPa水凝胶，混合5%丙烯酰胺与0.074%双丙烯酰胺；对于10 kPa水凝胶，混合10%丙烯酰胺与0.075%双丙烯酰胺；对于20 kPa水凝胶，混合8%丙烯酰胺与0.195%双丙烯酰胺；对于70 kPa水凝胶，混合10%丙烯酰胺与0.45%双丙烯酰胺。
        注意：有关实现理想聚丙烯酰胺水凝胶刚性的更多细节，可参见其他文献24,25,26,27。
    2. 为每种目标刚性的水凝胶分别配制两种水溶液：溶液1不含微珠，溶液2含有0.03%的直径为0.1 µm的荧光微珠（见材料表）。
    3. 将溶液1和溶液2置于真空环境中脱气15分钟，以去除已知会抑制溶液聚合的氧气。
    4. 向溶液1中加入0.6%的10 g/mL过硫酸铵（APS）储备液和0.43%四甲基乙二胺（TEMED），以引发聚合反应。操作需迅速。
    5. 将3.6 µL溶液1滴加至24孔板每个孔的中心（其制备方法见步骤1.2）。
    6. 立即用12 mm未处理的圆形盖玻片覆盖各孔，并静置20分钟，使溶液1充分聚合。
    7. 轻敲注射器针头使其尖端形成微小钩状，以便于移除盖玻片。使用注射器针头小心提起盖玻片。
    8. 向溶液2中加入0.6%的10 g/mL APS储备液和0.43% TEMED。将2.4 µL该混合液滴加至24孔板各孔第一层水凝胶的上方。
    9. 用12 mm圆形玻璃盖玻片覆盖溶液2，并用镊子轻轻向下按压，确保第二层厚度最小。让溶液2聚合20分钟。
    10. 向每个孔中加入500 µL 50 mM HEPES缓冲液（pH 7.5），然后用注射器针头和镊子小心移除玻璃盖玻片。
  2. 聚丙烯酰胺水凝胶的灭菌、胶原包被及平衡
    1. 在组织培养超净台中用紫外光照射水凝胶1小时，以实现灭菌。
    2. 配制含0.5%（w/v）磺基琥珀酰亚胺基-6-(4′-叠氮-2′-硝基苯氨基)己酸酯（Sulfo-SANPAH，见材料表）的溶液，溶剂为1% DMSO和50 mM HEPES缓冲液（pH = 7.5）。
    3. 将200 µL该溶液加至水凝胶的上表面。迅速操作，并用紫外光（302 nm）照射10分钟以活化水凝胶表面。
    4. 用1 mL 50 mM HEPES缓冲液（pH = 7.5）洗涤水凝胶两次。如有需要可重复洗涤，以确保彻底去除未反应的交联剂。
    5. 在水凝胶上加入200 µL含0.25 mg/mL大鼠尾腱I型胶原蛋白（见材料表）的50 mM HEPES缓冲液进行蛋白包被。将水凝胶置于室温下孵育过夜，胶原溶液需覆盖在水凝胶表面。
      注意：为防止脱水或蒸发，将多孔板置于次级容器中，并在容器内周缘放置浸湿的实验室擦拭纸。
    6. 使用配备40倍物镜的落射荧光显微镜或共聚焦显微镜测量水凝胶的厚度。通过定位水凝胶底部（即玻璃表面所在z位置）和顶部（即荧光微珠信号最强处的z位置），相减后计算其高度。
      注意：我们使用倒置落射荧光显微镜和数值孔径为0.65的40倍物镜测量水凝胶厚度。此时也可进行原子力显微镜（AFM）测量，以确认水凝胶的确切刚性（参见图2）。
    7. 在将目标细胞接种至水凝胶前，向每个孔中加入1 mL培养基，并在37 °C孵育30分钟至1小时，以确保充分平衡。
      注意：我们使用MCDB-131完全培养基，因为该培养基是模型宿主细胞（HMEC-1）的培养体系（详见步骤2.1）。

杨氏模量散点图与显微镜图像；3、20、70 kPa 水凝胶；相位/原子力显微镜（AFM）与微珠成像。
图 2：PA 水凝胶刚度的原子力显微镜（AFM）测量及微珠分布情况。A. 数据显示了根据所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺的量预期的 PA 水凝胶杨氏模量（刚度的度量），与通过 AFM 实测的杨氏模量之间的对比（N = 5 - 6）。水平条表示均值。0.6 kPa 水凝胶的刚度无法测量，因为该水凝胶非常柔软并会粘附在 AFM 探针上。B. 此图为融合状态的 HMEC-1 细胞的相差图像，以及嵌入在柔软的 3 kPa PA 水凝胶最表层的微珠对应的图像。HMEC-1 细胞以每孔 4 × 105 个细胞的浓度接种，并培养 24 小时。C. 本图像与图 2B相同，但细胞位于较硬的 70 kPa PA 水凝胶上。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 人微血管内皮细胞在水凝胶上的培养与接种

  1. 在含有 MCDB-131 培养基、10% 胎牛血清、10 ng/mL 表皮生长因子、1 µg/mL 氢化可的松和 2 mM L-谷氨酰胺的 MCDB-131 完全培养基中培养 HMEC-1（人源微血管内皮）细胞（参见材料表）。
  2. 每 3 - 4 天将融合的细胞以 1:6 的比例传代，细胞使用至第 40 代为止。
  3. 实验前一天，使用 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 将细胞从培养容器中消化下来。首先用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞及培养容器一次，然后加入适量 0.25% 胰蛋白酶/EDTA（每 100 mm 培养皿或 75 cm² 培养瓶加 2 mL，每 60 mm 培养皿或 25 cm² 培养瓶加 1 mL），于 37 °C 孵育 5 - 10 分钟，使细胞从基质上脱落。
  4. 加入所需体积的 MCDB-131 完全培养基以中和胰蛋白酶，轻轻吹打以分散细胞团块，然后将细胞悬液转移至锥形离心管中。
  5. 轻轻混匀细胞悬液以确保细胞分布均匀，取 20 µL 悬液，轻柔地将液体加入血细胞计数板盖玻片下方的两个计数室中。
  6. 将锥形离心管中的细胞悬液在 500 × g 条件下离心 10 分钟，使细胞沉淀。
  7. 在等待离心的 10 分钟内，使用血细胞计数板进行细胞计数。在显微镜下使用 10X 物镜对焦于血细胞计数板的网格线，用手持计数器统计一个 1 mm × 1 mm 方格内的细胞数量。
  8. 将血细胞计数板移动至另一个 1 mm × 1 mm 方格，计数该区域细胞，并重复此过程再进行两次。计算四个方格计数结果的平均值，再将该平均值乘以 104，所得数值即为正在离心的细胞悬液中每毫升的活细胞数量。
  9. 小心吸除锥形离心管中的上清液，注意勿扰动细胞沉淀。用 MCDB-131 完全培养基将细胞重悬，调整细胞浓度至 4 × 105 个细胞/mL。
  10. 将细胞悬液接种至水凝胶上：首先移除水凝胶中孵育用的培养基，然后在每块水凝胶上加入 1 mL 细胞悬液。

3. 人微血管内皮细胞的感染 L. monocytogenes

  1. 提前准备
    注意：请提前配制以下溶液。
    1. 链霉素、氯霉素和庆大霉素储备液
      1. 通过称取0.5 g硫酸链霉素并将其完全溶解于10 mL超纯水中，配制50 mg/mL的链霉素储备液。
      2. 称取75 mg氯霉素，溶于10 mL 100%乙醇中，充分溶解，配制成7.5 mg/mL的氯霉素母液。
      3. 称取0.2 g硫酸庆大霉素，溶于10 mL超纯水中，充分溶解，配制成20 mg/mL的庆大霉素储备液。
      4. 使用 0.2-μm 滤器对所有储备液进行过滤除菌µm 注射器滤器过滤后于-20 °C 用于长期使用（1 - 2 个月）。
    2. 脑心浸液（BHI）培养基及琼脂平板
      1. 找到两个1 L的烧瓶，并在每个烧瓶中放入一根磁力搅拌子。
      2. 对于BHI培养基，将37 g BHI粉末加入一个烧瓶中，再加入超纯水至1 L。将烧瓶置于磁力搅拌器上，剧烈搅拌溶液，直至粉末完全溶解。
      3. 对于BHI琼脂平板，加入37 g BHI粉末和15 g颗粒状琼脂（参见 材料列表在第二个烧瓶中加入超纯水至1 L。将烧瓶置于磁力搅拌器上，剧烈搅拌溶液，直至粉末完全溶解。
      4. 锥形瓶瓶盖勿拧得过紧，使用液体程序或根据灭菌锅的规格对溶液进行高压灭菌。
      5. 从高压灭菌器中取出溶液，然后将琼脂-BHI 溶液冷却至 55 °C如果1 L烧瓶中的BHI培养基保持无菌，可使用长达一个月。
      6. 制备细菌琼脂-BHI 平板时，首先根据所培养的细菌菌株，在含有 BHI 和琼脂的烧瓶中加入适当的抗生素（如需要）。将烧瓶短暂置于磁力搅拌器上，以促进快速混匀。
        注意：此处使用的抗生素是针对所用的单核细胞增生李斯特菌（Lm）菌株的，但可根据需要在BHI琼脂平板中使用其他适当的抗生素。我们添加链霉素至以下浓度 200 µg/mL 和氯霉素至浓度为 7.5 µg/mL 因为10403S Lm菌株对链霉素具有抗性。这些菌株已与含有氯霉素乙酰转移酶开放阅读框的质粒进行了接合，因此具有对氯霉素的抗性。
      7. 将混合物倒入10 cm聚苯乙烯细菌培养皿中（每皿约20 mL）。为去除气泡，短暂灼烧培养皿表面。室温下静置过夜冷却。
      8. 第二天，密封干燥的培养板并置于 4 °C.
  2. 人源微血管内皮细胞感染 L. monocytogenes
    1. 感染前3天，从甘油保存液（储存于-80 °C）中划线接种将要使用的单核增生李斯特菌（Lm）菌株80 °C) 接种到含有 BHI-琼脂平板上 7.5 µg/mL 氯霉素 200 µg/mL 链霉素，视情况而定。
      注意：待划线培养的菌株可以是野生型或突变型，可组成型表达荧光（免疫染色使用 JAT1045），或在 ActA 启动子下表达荧光（流式细胞术或牵引力显微镜实验使用 JAT983 或 JAT985）22.
    2. 将培养板置于 37 °C 直至形成单个菌落（1 - 2 天）。
    3. 感染前一天，将目标菌株在150 rpm振荡条件下培养过夜， 30 °C 在BHI培养基中 7.5 µg/mL （如适用）氯霉素的
      1. 将5 mL BHI培养基加入15 mL锥形离心管中，添加 7.5 µg/mL 氯霉素（如适用），然后用无菌的从琼脂平板上接种单个菌落 10 µL 尖端
    4. 次日，在感染前，将细菌溶液稀释5倍后，在600 nm处测定其光密度（OD600）；使用仅含BHI的比色皿作为空白对照。
    5. 将过夜培养物稀释至OD600为0.1，于37°C振荡培养2小时 30 °C，于BHI培养基中 7.5 µg/mL 加入氯霉素（如适用），使细菌达到对数生长期。
    6. 测定细菌溶液的OD600，预期值约为0.2 - 0.3。若OD600过高，仅用BHI稀释至0.2 - 0.3。
    7. 取1 mL细菌溶液至微量离心管中，在室温下以2,000 × g离心4 min。弃去上清液，并在组织培养操作台中将细菌沉淀重悬于1 mL组织培养级PBS中。在室温下以2,000 × g再次离心4 min，重复此洗涤步骤两次。每次均弃去上清液，最后将细菌重悬于1 mL PBS中。
    8. 通过混合10或 50 µL 将重悬于PBS中的细菌与1 mL MCDB-131完全培养基混合，以达到感染复数（MOI； 即每个宿主细胞内的细菌数量（即每个宿主细胞的胞内菌数）约为50个或10个。
    9. 从24孔板的各孔中移除培养基，注意不要破坏水凝胶或细胞。用1 mL MCDB-131完全培养基将细胞洗涤1次，然后向每孔加入1 mL细菌悬液。
    10. 保留部分感染液（至少 100 µL) 用于测定感染复数（MOI）（参见 步骤 3.3).
    11. 用培养皿盖盖住培养皿，并用聚乙烯食品保鲜膜包裹培养皿以防止泄漏。将培养皿放入离心机，于200 × g离心10分钟，以同步化侵袭过程。随后将培养皿转移至组织培养孵箱，于37 °C孵育30分钟 37 °C.
    12. 用 MCDB-131 完全培养基洗涤样本 4 次，并将其转移至组织培养孵育箱中。再孵育 30 分钟后，更换为添加有补充成分的培养基 20 µg/mL 的庆大霉素。
  3. 感染复数（MOI）的测定
    1. 在宿主细胞与细菌共孵育的最初30分钟内，准备感染混合物的10倍系列稀释液以确定感染复数（MOI）。通过混合制备10倍稀释液 100 µL 感染混合物的 900 µL 1×PBS（10-1 稀释）。然后，混合 100 µL 10 的-1 稀释与 900 µL PBS（10-2 稀释）。
    2. 继续操作直至完成10-5 稀释液制备完成。
      注意：所有溶液在稀释前均需充分混匀，且每一步骤均应使用新鲜洁净的移液器吸头。
    3. 稀释完成后，放置 100 µL 10 的-2 - 10-5 在BHI/琼脂/氯霉素/链霉素平板中央进行稀释（如适用）。
    4. 使用火焰将玻璃移液管弯曲成钩状，制备涂布棒。将移液管浸入100%乙醇中进行消毒，随后用火焰烧尽乙醇。
    5. 待涂布棒冷却后，从10⁻¹开始，将细菌稀释液均匀涂布于平板上-5 稀释并转移至更高浓度的混合液中。将培养皿倒置孵育于 37 °C 2 天。
    6. 根据菌落数量密度，确定10倍稀释梯度中任一稀释度的菌落数目-3 和 10-4 或 10-4 和 10-5 稀释平板。按如下方法计算感染复数（MOI）：
      菌落数 × 稀释倍数 ÷ 初始加入体积 = 每毫升菌落形成单位（CFU）数 µL
      每 CFU 数量 µL 每孔细菌混合物体积 = 每孔菌落形成单位（CFU）数量
      每孔菌落形成单位数 × 每孔细胞体积 = 每个细胞的细菌数
      注：CFU 代表菌落形成单位。
    7. 将两块培养板的MOI取平均值，得到最终的MOI。

4. 流式细胞术定量分析细胞外基质刚度依赖性宿主细胞对感染的易感性

  1. 称取 5 mg 胶原酶，放入 15 mL 圆锥形离心管中。加入 10 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，充分混匀。
  2. 感染后 8 小时，从 24 孔板各孔中移除培养基，并用组织培养用 PBS 洗涤各孔 1 次。吸除 PBS，向每孔加入 200 µL 胰蛋白酶-EDTA/胶原酶混合液。将板放入组织培养孵箱中孵育 10 分钟，以确保细胞完全脱落。
  3. 每个孔使用新的移液器，将液体轻轻吹打 8 次。操作需轻柔，避免损伤细胞。向每孔中加入 200 µL 完全培养基以中和胰蛋白酶活性。
  4. 将每孔的 400 µL 细胞悬液转移至带有 35 µm 细胞筛网帽的 5 mL 聚苯乙烯管中（参见 材料表）。
  5. 通过流式细胞术对每个样本分析 10,000 - 20,000 个细胞。利用流式细胞术进行数据采集，并使用相应的商业软件确定每孔中感染细胞的百分比。使用前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）图，圈选细胞计数分布的主要细胞群。
    ​注意：此步骤可确保对单个细胞进行分析，排除碎片或双联体、三联体细胞。
    1. 检测未感染对照细胞的荧光信号，并设门排除自发荧光，圈定感染细胞群体。

5. 胞外细菌的免疫染色、显微镜观察及图像处理

注意：该方法用于区分宿主细胞表面的细胞外基质刚度依赖性细菌黏附与细菌在宿主细胞内的内化（侵袭）。

不同压力下细菌侵袭效率的细胞与细菌显微图像及分析图。
图 4：在不同刚度水凝胶上培养的 Lm 感染 HMEC-1 细胞的免疫荧光染色，用于区分细菌黏附与侵袭。 这些图像展示了差异免疫荧光染色的代表性结果，其中 A. 细胞核（DAPI 染色），B. 所有细菌（GFP 标记），以及 C. 细胞外细菌（Alexa-546 标记）。HMEC-1 细胞培养于柔软的 3-kPa 水凝胶上。箭头所指为已被细胞内化的细菌，仅在绿色荧光通道中可见。图 D–F 数据基于在柔软 3-kPa 和坚硬 70-kPa 水凝胶上培养的感染 HMEC-1 细胞所采集的 N = 20 张图像，分别显示 D. 每个细胞核对应的总细菌数；E. 每个细胞核对应的内化细菌数；以及 F. 侵袭效率（内化细菌数与总细菌数的比值）。水平条表示数据的均值。P 值采用非参数 Wilcoxon 秩和检验计算得出。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 感染后30分钟，用培养基将感染了JAT1045（组成型表达绿色荧光蛋白（GFP）的单核增生李斯特菌）的HMEC-1细胞洗涤4次。
  2. 第四次洗涤后，将1 µL 1 mg/mL的Hoechst染料与1 mL MCDB-131完全培养基混合，加入每孔中以染色细胞核。将细胞置于组织培养箱中孵育10分钟。
  3. 用PBS洗涤细胞1次。使用非通透性固定剂在室温下固定20分钟，用于差异免疫染色28。
    注意：固定剂包含0.32 M蔗糖、10 mM MES（pH 6.1）、138 mM KCl、3 mM MgCl2、2 mM EGTA和4%甲醛（电镜级）。
  4. 用PBS洗涤细胞1次。在PBS中加入5%牛血清白蛋白（见材料表）封闭样本30分钟。
  5. 将样本与抗-Lm一抗（见材料表）在含2% BSA的PBS中按1:100稀释，孵育1小时。
  6. 用PBS洗涤样本3次，然后与AlexaFluor-546标记的山羊抗兔二抗（见材料表）在含2% BSA的PBS中按1:250稀释，孵育1小时。再用PBS洗涤3次。将样本保存在1 mL PBS中用于成像。
  7. 每种条件下成像并分析超过1,000个细胞。
    1. 成像时使用配备CCD相机（见材料表）和40倍空气平面荧光物镜（数值孔径NA为0.6）的倒置落射荧光显微镜。
      注意：激发光功率设置为25%，曝光时间为100 ms。mCherry的显微镜滤光片激发/发射波长分别为470/525 nm，GFP为530/645 nm，DAPI为395/460 nm。所用显微镜由开源显微镜软件包控制29。
    2. 进行差异免疫染色时，将与单个细胞相关的所有“绿色”细菌计为黏附细菌；将同时呈“绿色”和“红色”（因抗体结合）的细菌计为非内化细菌。
      注意：我们通过运行自定义脚本和CellC软件（见材料表）对细菌数量进行计数，并确定细胞核数量30。

6. 多孔牵引力显微镜与单层应力显微镜

随时间变化的细胞形态与力分布图；显微镜图像及压力分布图。
图5：单核细胞增生李斯特菌（Lm）感染的HMEC-1细胞在感染期间对细胞外基质（ECM）施加的牵引力显著降低。 图A显示相差图像，B显示形变场，C显示牵引应力场，D显示未感染的HMEC-1细胞在20 kPa水凝胶上的胞内张力场。形变图（µm）、牵引应力图（Pa）和胞内张力图（nNµm-1）的颜色标尺显示在热图上方。各列展示了三个代表性时间点：感染后3、8和18小时。E-H：与图A-D相同，但为以MOI为300感染Lm的细胞。细菌图像（红色通道）叠加在细胞的相差图像上。TFM记录通过同时成像多个孔进行。PIV的窗口大小为32像素，重叠16像素。比例尺为32 µm。本图改编自Bastounis和Theriot59。请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 在24孔板上制备PA水凝胶（参见步骤1）。接种HMEC-1细胞（参见步骤2），并按上述方法用JAT983感染细胞（参见步骤3）。
  2. 通过在Leibovitz’s L-15培养基中添加10%胎牛血清、10 ng/mL表皮生长因子和1 μg/mL氢化可的松，配制活细胞显微镜成像用培养基。
    注：L-15培养基已含有2 mM L-谷氨酰胺，因此无需像MCDB-131培养基那样额外添加。
  3. 感染后4小时（当内化的JAT983开始发出荧光时），将1 μL浓度为1 mg/mL的Hoechst染料与1 mL完全L-15培养基混合，加入每孔中以标记细胞核。将细胞置于组织培养孵箱中孵育10分钟，随后将每孔中的完全L-15培养基替换为含20 µg/mL庆大霉素的1 mL完全L-15培养基。
  4. 将培养板盖上盖子，放入已平衡至37 ˚C的显微镜环境培养室中（参见材料表）。
    注：成像时使用配备CCD相机（参见材料表）和NA为0.6的40倍空气平面荧光物镜的倒置落射荧光显微镜。
  5. 每隔10分钟采集一次荧光微球和荧光细菌的多通道延时图像，以及宿主细胞的相差图像，持续4至12小时。
    注：成像时设定光强为25%，曝光时间为100 ms。用于mCherry和GFP的显微镜滤光片（激发/发射）分别为470/525 nm和530/645 nm。
  6. 记录结束后，向每个孔中加入500 µL水中含10%十二烷基硫酸钠（SDS）的溶液。
    注：细胞将从水凝胶上脱落，水凝胶由于具有弹性，会恢复至初始未变形状态。
  7. 拍摄水凝胶图像，并将其作为参考的未变形图像。
  8. 通过粒子图像测速法（PIV）31，将延时序列中的每一帧图像与未变形水凝胶的参考图像进行比较，确定水凝胶在每个时间点的二维形变。根据实验情况选择合适的窗口尺寸和重叠区域。
    注：我们采用32像素的窗口尺寸，重叠16像素。
  9. 按照其他文献所述方法32,33，计算细胞施加于水凝胶上的二维牵引应力。
  10. 通过求解受薄弹性板力学平衡方程，计算单层细胞张力34，该薄板受到PA水凝胶对单层细胞产生的反作用力，其方向与测得的牵引应力相反。
    注：参见补充材料1。

7. 定量延时显微镜技术评估细胞外基质刚度依赖性 L. monocytogenes 通过内皮细胞的扩散

在不同基质刚度下细胞迁移分析；径向距离的显微镜图像和图表。
图6：在3 kPa和70 kPa刚度基底上接种的HMEC-1单层细胞中单核细胞增生性李斯特菌（Lm）扩散的延时定量显微镜数据。A. 该图显示了两个代表性感染灶在0、200、400和600分钟时的静态图像。相位通道显示HMEC-1细胞单层，红色通道显示细胞内Lm（参见方案中的步骤7）。B。该图显示了随时间变化的感染灶凸包面积。3 kPa条件（红色）的感染灶面积增长速度快于70 kPa条件（绿色）。C. 该图显示了从中心到感染灶边缘的径向距离随时间的变化，数据来自在3 kPa（红色）和70 kPa（绿色）刚度PA基底上接种的HMEC-1单层细胞中生长的代表性感染灶。3 kPa条件下的径向速度（dr/dt）保持恒定，而70 kPa条件下呈双相变化。D。这些数据显示了10个独立感染灶在最初200分钟内的径向速度。红色（3 kPa）和绿色（70 kPa）数据点表示前图中两个感染灶的斜率。水平条表示数据的平均值。P值通过非参数Wilcoxon秩和检验计算得出。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 在24孔板上制备PA水凝胶（参见步骤1），接种HMEC-1细胞（参见步骤2），并按照上述方法培养过夜JAT983培养物（参见步骤3）。
  2. 感染当天，通过将每毫升MCDB-131完全培养基中加入10 µL细菌沉淀来配制感染混合液。小心吸去24孔板各孔中的培养基，每孔加入1.9 mL MCDB-131完全培养基和0.1 mL细菌混合液。
    注意：本实验中使用较低的感染复数（MOI）是为了分析从单个细菌侵入宿主细胞开始的播散事件。
  3. 用孔板盖盖好后，再用塑料封口膜密封以防止泄漏。将孔板放入离心机中，以200 × g离心10分钟，以同步化细菌侵袭过程。
  4. 将孔板转移至组织培养孵箱中，孵育5分钟。
  5. 用培养基洗涤样本4次，然后将其转移回组织培养孵箱。再孵育5–7分钟后，更换为含20 µg/mL庆大霉素的培养基。
  6. 将孔板在孵箱中继续孵育额外5小时，以使actA启动子激活并驱动mTagRFP开放阅读框的表达35。
  7. 通过在Leibovitz's L-15培养基中添加10%胎牛血清、10 ng/mL表皮生长因子和1 µg/mL氢化可的松，配制活细胞显微镜成像用培养基。
    注意：L-15培养基已含有2 mM L-谷氨酰胺，因此无需像MCDB-131培养基那样额外添加。
  8. 将1 μL浓度为1 mg/mL的Hoechst染料与1 mL L-15完全培养基混合，加入各孔以标记细胞核。将细胞在组织培养孵箱中孵育10分钟，然后将各孔中的L-15完全培养基更换为1 mL含20 µg/mL庆大霉素的L-15完全培养基。盖上孔板盖，将其置于已平衡至37 ˚C的显微镜环境培养室中（参见材料表）。
    注意：成像时使用倒置落射荧光显微镜，配备CCD相机（参见材料表）和20X空气平场萤石物镜（NA 0.75）。光源功率设为50%，曝光时间为50 ms。用于mCherry检测的显微镜滤光片激发波长和发射波长分别为470/525 nm。
  9. 利用自动对焦功能，每5分钟对多个视野进行成像，以监测单核细胞增生李斯特菌（Lm）在不同硬度水凝胶上接种的HMEC-1单层细胞中的扩散情况。
    注意：L-15培养基使用HEPES缓冲，因此成像过程中无需使用CO2。

结果

人微血管内皮细胞 HMEC-1 对单核增生李斯特菌（Lm）感染的 ECM 刚度依赖性敏感性：
按照方案中步骤 1所述方法，在多孔玻璃底板上构建了不同刚度且表面均包被 I 型胶原的 PA 水凝胶（见图 1）。如前所述26,27，通过原子力显微镜（AFM）测量确认水凝胶的实际刚度（见图 2）。以往研究表明，内皮细胞基底膜的局部顺应性可在 1 kPa（例如，脑组织）至 70 kPa（例如，主动脉）之间变化36,37,38,39,40。因此，我们选择检测 HMEC-1 细胞在以下刚度基质上的感染情况：0.6 kPa、3 kPa、20 kPa 和 70 kPa。针对每种水凝胶刚度，制备六个重复样本以评估结果的可重复性。

采用流式细胞术评估细胞外基质（ECM）刚度依赖性对HMEC-1细胞感染单核细胞增生李斯特菌（Lm）易感性的影响（见图3）。HMEC-1细胞感染了一种在内化后表达荧光标记的Lm菌株（JAT985）（actAp::mTagRFP），从而仅能检测到细胞内细菌（见图1L–1N）。JAT985菌株还缺失ActA蛋白，导致细菌无法在细胞间传播，因为ActA是形成肌动蛋白彗星尾并实现细菌扩散所必需的。感染后7–8小时，通过流式细胞术评估HMEC-1细胞的感染情况。为确保对单个细胞进行分析，首先利用前向散射与侧向散射图对细胞计数分布的主要部分设门，随后进行第二步设门以排除具有自发荧光的细胞（见图3A–3C）。如图3所示的初步结果表明，生长在较硬的70 kPa水凝胶上的HMEC-1细胞感染Lm的程度约为生长在较软的0.6 kPa水凝胶上细胞的两倍（见图3B–3D）。与生长在软基质上的细胞相比，生长在硬基质上的HMEC-1细胞对Lm感染的易感性增加可能归因于以下原因：1. Lm与HMEC-1细胞的黏附增强；2. Lm侵入HMEC-1细胞的能力增强；或3. 上述两种情况同时发生。为验证哪一假设成立，将HMEC-1细胞接种于软（3 kPa）和硬（70 kPa）水凝胶上，并用持续表达GFP的Lm进行感染（见图4A–4C）。感染后不久即固定样品，并使用抗体对胞外（黏附）细菌进行染色。通过定量显微镜分析发现，当宿主细胞生长在硬凝胶上时，黏附于HMEC-1细胞的细菌数量显著多于生长在软凝胶上的情况（见图4D）。与流式细胞术结果一致，当宿主细胞生长在硬凝胶上时，HMEC-1细胞内化的细菌数量也显著更多（见图4E）。然而，无论基底刚度如何，Lm侵入HMEC-1细胞的侵袭效率（内化细菌数/总细菌数）均相似（见图4F）。

单核增生李斯特菌感染的 HMEC-1 细胞的牵引力显微镜分析：
单核增生李斯特菌（Lm）对 HMEC-1 细胞的感染可能改变感染宿主细胞的生物力学特性，包括细胞与细胞外基质（ECM）或彼此之间的黏附强度，从而影响其屏障完整性。我们试图通过牵引力显微镜技术32计算细胞-ECM 间的牵引力，并结合单层细胞应力显微镜技术41计算细胞内张力，以评估上述变化是否发生。图5展示了感染后不同时间点，生长在 20-kPa 水凝胶上的 HMEC-1 细胞的形变场、牵引应力场和细胞内张力场的分布图。图5A–5D为未感染的对照组 HMEC-1 细胞，而图5E–5H为以感染复数（MOI）300 细菌/细胞的剂量感染单核增生李斯特菌（Lm）的 HMEC-1 细胞。该初步研究表明，在 Lm 感染过程中，感染的 HMEC-1 细胞的细胞-ECM 牵引力及细胞内应力强度有所降低，而未感染的对照组细胞则未观察到此类变化。

基质刚度依赖性Lm在HMEC-1单层细胞上的播散：
采用延时显微镜研究基质刚度对单核增生李斯特菌（Lm）通过HMEC-1单层细胞扩散的影响。随着Lm在单层细胞中扩散，细菌形成感染灶，其大小随时间呈函数关系增长（见 图6A 和 视频图 1 和 2）。通过在细菌周围绘制凸包（即包含该点集的最小凸多边形）来测量感染灶的面积42. 该领域尚无标准指标用于衡量效率 L. monocytogenes 通过宿主细胞单层进行的细胞间传播。为评估传播效率，一些研究者已对感染灶内的宿主细胞数量进行计数41，以及其他研究者已手动勾画出感染宿主细胞群体的边界43我们选择在细菌周围绘制一个凸多边形，因为这是一种自动化、一致性高且计算成本较低的方法，用于测量效率 L. monocytogenes 扩散。通过这种方式，我们发现接种于70 kPa水凝胶上的HMEC-1细胞感染灶面积较接种于3 kPa基质上的细胞略有减小（见 图6B 和 视频图 1 和 2）。为了确定感染灶的生长速率，通过取感染灶面积的平方根并除以π，将径向距离对时间作图。该数学变换假设感染灶的形状大致为圆形。44. 为测量焦点生长速度，需计算变化速率（即，测量了3 kPa和70 kPa基质上径向距离的斜率。该方法揭示出，接种于3 kPa基质上的HMEC-1细胞中感染灶的生长速度更快且呈单调增长。然而，在接种于70 kPa基质上的细胞中，感染灶在前200分钟内显著减慢，而在200至600分钟期间则略微减慢（见 图6C）。事实上，对更多数据的分析证实，在70 kPa基质中，感染灶的生长速度平均减慢了两倍，尤其是在前200分钟内（见 图6D).

流式细胞术图谱、细胞分布分析；散点图显示荧光信号及基质刚度影响。
图 3：利用流式细胞术检测细胞外基质刚度依赖性对 HMEC-1 细胞受单核增生李斯特菌侵染易感性的影响。 HMEC-1 细胞被单核增生李斯特菌（JAT985 株）感染，并通过流式细胞术分析感染情况。A．该图显示来自单个孔的代表性 HMEC-1 细胞的侧向散射与前向散射散点图。通过设门排除碎片（左侧）以及细胞双联体或三联体（右侧），选择主要细胞群分布。B．该图显示接种于柔软（0.6 kPa）水凝胶上的 HMEC-1 细胞单个细胞的单核增生李斯特菌荧光强度对数分布直方图。C．该图显示接种于坚硬（70 kPa）水凝胶上的 HMEC-1 细胞单个细胞的单核增生李斯特菌荧光强度对数分布直方图。N = 4 - 6 次重复实验的直方图以不同颜色表示。未感染对照组细胞的直方图为紫色，用于定义感染状态的设门范围以红色标示。感染复数（MOI）为 100，感染后 8 小时进行检测。D．数据表示感染的 HMEC-1 细胞百分比随水凝胶刚度的变化（N = 5）。水平条形表示数据均值。P 值采用非参数 Wilcoxon 秩和检验计算。请点击此处查看该图的放大版本。

突出显示细胞结构的细胞培养显微图像；细胞生长动态研究。
视频 图1：在3-kPa基质上接种的HMEC-1细胞单层（相差图像）中细胞内单核细胞增生性李斯特菌（Lm，红色通道）的扩散过程。 细胞在含10%胎牛血清（FBS）和20 µg/mL庆大霉素的Leibovitz L-15培养基中培养，并置于37 ˚C恒温环境培养箱内进行成像。图像每5分钟采集一次。视频播放速度为15帧/秒。请点击此处观看该视频。（右键可下载。）

细胞培养显微镜图像；荧光显微镜以粉红色突出显示细胞结构。
视频 图2在70 kPa基质上接种的HMEC-1细胞单层（相差图像）中，单核细胞增生性李斯特菌（Lm，红色通道）在细胞内的扩散情况。 细胞在 Leibovitz's L-15 培养基（10% FBS， 20 µg/mL （庆大霉素）置于已平衡至环境室内的培养箱中 37 °C图像每5分钟采集一次。视频播放速度为每秒15帧。 请点击此处观看视频。（右键单击可下载。）

杨氏模量 (E, kPa)丙烯酰胺 % (来自 40% 储液)双丙烯酰胺 % (来自 2% 储液)
0.630.045
350.075
10100.075
2080.195
70100.45

表1. 不同硬度的聚丙烯酰胺（PA）水凝胶的组成 在此表中，不同列分别列出了为达到特定刚度（杨氏模量，E）所需的40%丙烯酰胺贮存液和2%双丙烯酰胺贮存液的百分比。

生物力学中的静力学平衡方程；应力张量与力平衡；研究示意图。
补充材料 1. 由计算得到的牵引应力计算细胞内张力。 请点击此处下载该文件。

讨论

细胞能够感知多种物理环境信号，这些信号不仅影响细胞的形态，还会影响其基因表达和蛋白质活性，从而影响细胞的关键功能和行为45,46。细胞外基质（ECM）的刚度 increasingly 被认为是调控细胞运动性、分化、增殖乃至细胞命运的重要调节因子47,48,49。尽管近年来在理解细胞与其ECM之间复杂的生物力学相互作用方面取得了诸多进展，但环境刚度如何影响细胞对细菌感染的易感性仍知之甚少。为了促进此类研究，我们开发了一种基于聚丙烯酰胺水凝胶制备的新型多孔检测方法，该水凝胶的刚度可调，并且适用于感染实验50。传统上，组织培养中细胞的细菌感染研究通常在玻璃或聚苯乙烯表面进行，而这些表面的刚度比大多数贴壁细胞的天然ECM高出约1至3个数量级8,51。本文所述的检测方法通过实现在生理相关环境刚度条件下研究细菌-宿主相互作用，开辟了新的研究途径。

为了验证本实验方法的概念，选用 HMEC-1 细胞作为模型贴壁宿主细胞，单核细胞增生李斯特菌（Lm）作为模型细菌病原体。然而，若经过适当修改，该方法可拓展用于进一步的研究。此类研究可涉及其他病原体（包括细菌和病毒）对不同类型哺乳动物贴壁宿主细胞的感染。在本实验中，凝胶使用 I 型胶原蛋白进行包被，但根据宿主细胞类型的不同，也可采用其他细胞外基质（ECM）蛋白包被，例如层粘连蛋白（laminin）或纤连蛋白（fibronectin），以促进目标宿主细胞在水凝胶上的贴附52。另一个与宿主细胞类型相关的考虑因素是所研究的水凝胶刚度范围。该刚度范围应依据特定宿主细胞类型的生理相关性，以及宿主细胞在特定刚度水凝胶上贴附并形成单层的能力而定。 同样，根据拟研究的病原体模型，可能需要对本文所述的感染实验方案进行适当调整。

与以往制备聚丙烯酰胺水凝胶的方法相比24,50,53，本检测方法的创新之处在于整合了若干独特特性。首先，水凝胶构建于多孔玻璃底板上，可实现多种实验条件的同时筛选以及部分操作的自动化。由于该方法的结果可能受到宿主细胞代次以及感染时加入细菌数量等实验间常存在差异的因素影响，因此同时监测多个条件或检测多个重复组至关重要。本检测方法的另一独特之处在于水凝胶厚度约为40 µm，足够薄，可使用常规显微镜成像。我们已证明，可成功进行活细胞显微观察以及细胞固定、免疫染色后成像，且不会引入高背景荧光。最后，水凝胶由两层构成，上层嵌有荧光微珠，并局限于单一焦平面内。该特性可确保成像过程中无离焦光干扰。微珠的存在不仅可用于检测凝胶表面形貌以确保其均匀性，还可提升TFM和MSM24,32,41的性能。利用TFM和MSM，可分别计算位于不同刚度基质上的细胞与细胞外基质（ECM）之间以及细胞与细胞之间的力学作用力。通过这一新型检测方法，可同时比较环境刚度和感染对物理力的贡献，从而进行相关测量。采用该方法，可确定感染在其整个过程中对宿主细胞力学特性的影响。此外，可利用MSM计算细胞内应力的演变过程，并将其作为单层屏障完整性的衡量指标。最后，鉴于该检测方法具有多孔特性，可在细菌感染的同时引入药理学或遗传学干扰，从而更深入地研究宿主细胞力学与感染之间的复杂相互作用。

该技术的一个内在局限性在于基底刚度可能对细胞增殖速率产生影响。通常在感染实验中，我们需要确保不同条件下宿主细胞的密度保持一致，因为细胞密度本身可能会影响宿主对感染的易感性。作为宿主细胞使用的HMEC-1细胞在水凝胶上接种24小时后，其数量未表现出显著差异。然而，不同类型的细胞可能会根据水凝胶的刚度表现出不同的增殖行为，从而对感染研究造成偏差。类似地，当细胞无法形成单层或在水凝胶上贴附不良时，也可能引起感染偏差，例如某些细胞类型接种于非常柔软的基质上时（例如，人脐静脉内皮细胞或马迪-达尔比犬肾上皮细胞接种于0.6 kPa水凝胶上54,55）。就病原体而言，某些细菌（例如，Borrelia burgdorferi）不仅能够黏附于宿主细胞并侵入其中，还可能穿过这些细胞56。我们尚未验证该实验方法是否适用于病原体跨细胞迁移研究，但已有研究表明中性粒细胞穿过接种于聚丙烯酰胺水凝胶上的内皮细胞进行跨内皮迁移的实验已成功实现57，因此该应用似乎是可行的。已有大量研究阐述了如何通过调节丙烯酰胺和双丙烯酰胺的适当浓度来制备具有特定杨氏模量的聚丙烯酰胺水凝胶24,25,26,27。然而，特别是在希望对生长于不同刚度水凝胶上的细胞进行牵引力显微镜（TFM）实验时，通过原子力显微镜（AFM）或其他压痕技术验证水凝胶的实际刚度至关重要58。由于使用了不同的溶剂、陈旧的丙烯酰胺储存液，或AFM测量方式的差异（例如，AFM探针的形状），可能导致实测值与预期值出现轻微偏差。最后，本文所述方法基于将宿主细胞接种于二维基质上，这与更接近生理状态且更具生理相关性的三维环境存在差异。然而，构建可调控刚度的三维凝胶、接种宿主细胞并进一步进行病原体感染，目前仍面临一定的技术挑战。尽管如此，我们预计在不久的将来能够将本实验方法拓展至三维环境下感染过程的研究。

综上所述，本研究所描述的实验方案及初步结果表明，这种新型检测方法有望成为一种极为有用的工具，可用于以定量方式研究病原菌对贴壁宿主细胞的感染过程，并且相较于以往研究条件，其可在更接近生理状态的环境中进行。本实验体系中制备聚丙烯酰胺水凝胶的优势在于，该检测方法可兼容多种技术手段，例如流式细胞术、免疫染色后结合光学显微镜观察，以及牵引力显微镜技术。该方法可应用于不同类型病原体对多种贴壁宿主细胞感染的研究，我们预期这将对揭示病原体感染宿主的策略以及促进抗感染治疗手段的开发产生重要影响。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 M. Footer、R. Lamason、M. Rengaranjan 以及 Theriot 实验室成员的讨论和实验支持。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）R01AI036929（J.A.T.）、霍华德·休斯医学研究所（HHMI）（J.A.T.）、HHMI 高级研究 Gilliam 奖学金（F.E.O.）、斯坦福研究生奖学金（F.E.O.）、 美国心脏协会（E.E.B.）、NIH 1R01HL128630（R.S.）和 NIH 1R01HL130840（R.S.）资助。流式细胞术在斯坦福共享 FACS 设施完成。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
氢氧化钠颗粒FisherS318-500
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷SigmaA3648
25% 戊二醛SigmaG6257-100ML
40% 丙烯酰胺SigmaA4058-100ML
双丙烯酰胺溶液 (2% w/v)Fisher ScientificBP1404-250
羧基修饰的荧光微球，0.1 μm，黄绿色荧光 (505/515)InvitrogenF8803
过硫酸铵FisherBP17925
TEMEDSigmaT9281-25ML
Sulfo-SANPAHProteochemc1111-100mg
大鼠I型胶原蛋白溶液SigmaC3867-1VL
二甲基亚砜 (DMSO)J.T. Baker9224-01
HEPES，游离酸J.T. Baker4018-04
Leibovitz L-15 培养基，无酚红Thermofischer21083027
MCDB 131 培养基，无谷氨酰胺Life technologies10372019
基础胎牛血清，批号：A37C48AGemini Bio-Prod900108 500ml
表皮生长因子 (EGF)SigmaE9644
氢化可的松SigmaH0888
L-谷氨酰胺 200 mMFisherSH3003401
DPBS 1XFisherSH30028FS
硫酸庆大霉素MP biomedicals194530
氯霉素SigmaC0378-5G
DifcoTM 琼脂，颗粒状BD214530
BBL TM 脑心浸液BD211059
Hoechst 33342，三盐酸盐三水合物 — 水中 10 mg/μl 溶液InvitrogenH3570
16% 电镜级甲醛Electron microscopy15710-S
单核细胞增生李斯特菌抗体Abcamab35132
山羊抗兔 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor® 546 标记ThermofischerA-11035
0.25% 胰蛋白酶-EDTA，含酚红Thermofischer25200056
梭菌胶原酶SigmaC8051
硫酸链霉素Fisher Scientific3810-74-0
蔗糖Calbiochem8510
十二烷基硫酸钠Thermofischer28364
MES 粉末SigmaM3885
KClJ.T. Baker3040-05
MgCl2J.T. Baker2444-1
EGTAAcros40991
一次性实验器材
12 mm 圆形玻璃盖玻片Fisherbrand12-545-81No. 1.5 盖玻片 | 10 mm 玻璃直径 | 未包被
玻璃底 24 孔板MattekP24G-1.5-13-F
5 ml 聚苯乙烯管，带 35 μm 细胞筛帽 Falcon352235
T-25 培养瓶Falcon353118
50 ml 锥形管Falcon352070
15 ml 锥形管Falcon352196
一次性移液管 (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)Falcon357551
巴斯德玻璃移液管VWR14672-380
移液器吸头 (1-200 μl, 101-1000 μl)DenvilleP1122, P1126
无粉检查手套MicroflexXC-310
细菌比色皿Sarstedt67.746
剃刀VWR55411-050
注射器针头BD305167
0.2 μm 灭菌瓶Thermo Scientific566-0020
20 ml 注射器BD302830
0.2 μm 滤器Thermo Scientific723-2520
木棒Grainger42181501
保鲜膜Santa Cruz Biotechnologiessc-3687
细菌培养皿Falcon351029
大型/非一次性实验设备
组织培养罩BakerSG504
血细胞计数板SigmaZ359629
细菌培养箱Thermo ScientificIGS180
组织培养箱NuAireNU-8700
尼康 Diaphot 200 倒置落射荧光显微镜NikonNIKON-DIAPHOT-200
培养笼HaisonCustom
Scanford FACScan 分析仪 Stanford 和 Cytek 升级的 FACScanCustom
移液器辅助器Drummond4-000-110
移液器 (10 μl, 200 μl, 1000 μl)GilsonF144802, F123601, F123602
pH 计Mettler Toledo30019028
镊子FST11000-12
1 L 烧瓶FisherbrandFB5011000 
高压灭菌器Amsco3021
磁力搅拌器Bellco7760-06000
磁力搅拌子Bellco1975-00100
分光光度计BeckmanDU 640
Scanford FACScan 分析仪Cytek BiosciencesCustom Stanford and Cytek upgraded FACScan
软件
显微镜软件 (μManager)Open Imaging
MatlabMatlab Inc
FlowjoFlowJo, LLC
自动化图像分析软件 CellChttps://sites.google.com/site/cellcsoftware/该软件可免费获取。可执行文件和 MATLAB 源代码可在 https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ 下载

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