基于聚丙烯酰胺的多井格式实验研究细胞外基质硬度对黏附细胞细菌感染的影响

大多数动物组织中的细胞通常附着在相邻细胞和细胞外基质 (ECM) 上。细胞的锚固对他们的 ECM 是关键的许多细胞过程, 从细胞的运动到细胞增殖和生存^1,2。细胞锚定对 ecm 取决于 ecm 构成和刚性。细胞对后者的变化作出反应, 动态地重新排列细胞骨架, 电池 ECM 和细胞的粘连, 这反过来批判地改变细胞生物力学和功能^3,4,5,6.ECM 刚度可以在空间 (即解剖位置)、时间 (即衰老) 和病理生理学过程 (如动脉硬化、癌症、感染等) 中变化。例如, 人们普遍认为, 与软矩阵相比, 居住在更硬的内皮细胞会增加它们的 ECM 和相互之间的作用力, 并表现出增加的运动和增殖^7,8。同样, 居住在较硬矩阵上的成纤维细胞会向 ecm 传递高收缩力, 并显示增加的增殖、运动和 ECM 产量^9、10、11。虽然细胞力学和对 ECM 刚度的反应已被广泛研究的各种细胞类型, 黏附宿主细胞之间的关系, 其 ECM 的硬度, 和细菌感染仍然是很大的未知。

为了研究 ECM 刚度在细菌-宿主细胞相互作用中的作用, 本文选择了李斯特菌 (Lm) 作为模型病原体。Lm 是一种无处不在的食物传播细菌, 它能在各种各样的哺乳动物宿主体内引起全身感染。这种兼性的胞内病原体通过遍历不同类型的血管内皮, 可以从肠道上皮转移到远端器官。如果它破坏血脑屏障, Lm 会引起脑膜炎, 当它穿过胎盘时, 它会导致自发性流产^12,13。Lm 可以感染不同的宿主细胞类型, 并可以使用不同的致病策略。lm 感染主要是在上皮细胞的背景下进行的, 而对于 lm 如何感染和绕过血管腔内血管内皮细胞^14、15、16的研究, 则知之甚少。此外, 在很大程度上还不知道内皮细胞的 ECM 的刚度是如何调节 Lm 入侵这些宿主细胞并传播的能力。Lm 和几个额外的细菌物种(即立克次体 parkeri) 利用它们感染的宿主细胞的肌动蛋白细胞骨架侵入他们的细胞质, 促进细胞对细胞的传播^17,18,19. 它们通过表达蛋白质, 使它们能够干扰宿主肌动蛋白聚合通路, 并产生肌动蛋白彗星尾巴, 促进其向前推进^16,20。由于感染, 宿主细胞的肌动蛋白细胞骨架需要动态重新排列的方式, 仍然没有充分的特点, 可能影响的生物力学的宿主细胞, 包括他们所施加的物理力量对他们的 ECM 和每个其他。为了检查这些过程, 人类微血管内皮细胞 (HMEC-1) 被选择为模型宿主细胞三的原因: 1. 内皮细胞被称为高度 mechanosensitive, 因为它们经常暴露在不同的物理线索²¹;2. 我所使用的用于感染内皮细胞的策略在很大程度上仍然未知²²;和3。HMEC-1 是一个永生化的细胞系, 因此, 可以很容易地培养和受到遗传操作。

宿主细胞的细菌感染主要是通过在玻璃或聚苯乙烯基质上的播种细胞来研究的, 它们比大多数细胞^12、14、23的生理 ECM 明显僵硬。为了检查其硬度与生理相关的基质细胞的感染情况, 并阐明 ECM 刚度对细菌感染细胞的作用, 我们遵循了一种基于制备薄microbead 聚丙烯酰胺水凝胶在多井板上可调谐刚度。所提出方法的新颖之处在于, 它允许同时监测多个条件, 因为它的多井格式和它是兼容的多种技术, 由于特定的方式, 基板的建立。HMEC-1 细胞被播种在这些蛋白涂层的水凝胶, 然后感染了不同的 Lm 菌株, 要么成为荧光在内化或组成性荧光。采用流式细胞仪评价 ECM 刚度对宿主 HMEC-1 细胞感染敏感性的影响。此外, 染色和荧光显微术用于区分附着和内化细菌。最后, 对牵引力显微镜 (TFM) 进行了成功的表征, 表明 Lm 感染对宿主内皮细胞在感染过程中对其基质施加牵引应力的影响。所提出的检测方法可以很容易地进行修改, 以便进一步研究 ECM 刚度对不同细胞系或病原体对黏附细胞感染敏感性的影响。

1. 在多井板上制造薄层双层聚丙烯酰胺水凝胶

1. 在蒸馏水中溶解过硫酸铵 (APS), 以达到10克/毫升的最终浓度。整除和存储的解决方案在4°c 短期使用 (3 周)。
   注: 上述溶液可在水凝胶制备前制备。
2. 玻璃活化24井菜肴
   1. 孵化24井玻璃底部板与13毫米直径井 (参见材料表) 为 1 h 与500µL 的 2 M 氢氧化钠每井在室温下。
   2. 用超纯水冲洗水井 1x, 然后在95% 乙醇中加入500µL 2% (3-氨基丙基) triethoxysilane (见材料表), 每口井为5分钟。
   3. 再用清水冲洗水井 1x, 再加500µL 0.5% 戊二醛, 每井30分钟. 用清水冲洗水井 1x, 在60˚C 用盖子擦干。

图 1: 在薄层双层荧光珠嵌入聚丙烯酰胺 (PA) 水凝胶的不同刚度下, 对宿主细胞进行细菌感染检测。玻璃盖玻片化学改性, 使水凝胶附着。B. 3.6 µL 的 PA 混合物沉积在玻璃底部。该混合物覆盖12毫米圆形玻璃盖玻片, 以实现聚合。盖玻片用针头注射器取出。E. 2.4 µL 的 PA 溶液与微球被添加到底部层的顶部, 并加盖圆形玻璃盖玻片。F. 在井中添加缓冲区, 并删除盖玻片。G. 紫外线照射1小时, 确保杀菌。H. 在凝胶上加入磺 SANPAH 溶液, 然后将其置于 UV 下10分钟. 水凝胶用缓冲液冲洗, 然后一夜之间用胶原蛋白 i. J进行孵化。水凝胶与细胞介质平衡。宿主细胞被播种。L.Lm 细菌被添加到溶液中, 感染通过离心同步。1 h 溶液中的感染后细菌被冲走, 添加了抗生素补充的培养基。N. 在感染后4小时, Lm (JAT985) 开始荧光。O. HMEC-1 细胞从母体中分离出来, 溶液被转移到试管进行流式细胞仪测量。请注意, 该检测的每一步的天数和近似时间也被指出。此数字已从 Bastounis 和 Theriot⁵⁹进行了修改。请单击此处查看此图的较大版本.

3. 聚丙烯酰胺水凝胶制造
   注: 见图 1.
   1. 准备含有 3-10% 40% 库存丙烯酰胺溶液的水溶液 (见材料表) 和 0.06 0.6% 的2% 库存双丙烯酰胺溶液 (见材料表), 制造可调谐刚度的水凝胶, 范围从0。6人民军至70帕。见表 1。
      1. 0.6 帕水凝胶, 混合3% 丙烯酰胺0.045% 双丙烯酰胺。3帕水凝胶, 混合5% 丙烯酰胺0.074% 双丙烯酰胺。10帕水凝胶, 混合10% 丙烯酰胺0.075% 双丙烯酰胺。20帕水凝胶, 混合8% 丙烯酰胺0.195% 双丙烯酰胺。70帕水凝胶, 混合10% 丙烯酰胺0.45% 双丙烯酰胺。
         注: 有关达到理想的 PA 水凝胶刚度的进一步细节可以在别处找到^24,25,26,27。
   2. 为每个理想的水凝胶刚度准备两个水溶液。准备解决方案1是无珠和解决方案2包含 0.03% 0.1-µm 直径荧光微珠 (见材料表)。
   3. 德加解决方案1和2由真空15分钟, 以消除氧气, 这是已知的抑制溶液聚合。
   4. 添加0.6% 的10克/毫升股票 ap 解决方案和 0.43% tetramethylethylenediamine (TEMED) 到解决方案 1, 以使聚合启动。动作快点
   5. 将溶液1的3.6 µL 添加到24井道的每一个井的中心 (见步骤 1.2为其准备)。
   6. 立即用12毫米未经处理的圆形盖玻片盖好井, 让溶液1坐20分钟, 使其完全聚合。
   7. 轻轻地敲击注射器到表面, 以创建一个小钩在其尖端, 以方便去除盖玻片。用注射器针抬起盖玻片。
   8. 将0.6% 的10克/毫升库存 ap 解决方案和 0.43% TEMED 添加到解决方案2中。将混合物的2.4 µL 在 24-井菜的每个井的第一层的顶部。
   9. 盖解决方案2与12毫米圆形玻璃盖玻片, 轻轻按下向下使用一对钳, 以确保第二层的厚度是最小的。让解决方案2聚合为20分钟。
   10. 添加500µL 50 毫米 HEPES pH 7.5 到每个水井, 然后取出玻璃盖玻片与注射器针和镊子。
4. 聚丙烯酰胺水凝胶的杀菌、胶原涂层及平衡
   1. 紫外线-暴露在组织培养罩1小时的水凝胶, 以允许绝育。
   2. 准备0.5% 重量/体积 sulfosuccinimidyl 6-(4′--叠氮基--2′-nitrophenylamino) 己酸酯 (磺 SANPAH, 见材料表) 的混合物1% 亚砜和50毫米 HEPES pH = 7.5。
   3. 将此溶液的200µL 添加到水凝胶的上表面。动作快, 使他们暴露在紫外线 (302 nm) 10 分钟, 以激活它们。
   4. 用1毫升的50毫米 HEPES pH = 7.5 洗涤水凝胶两次。重复, 如果需要, 以确保任何多余的交联剂被删除。
   5. 蛋白质涂层水凝胶与200µL 0.25 毫克/毫升鼠尾胶原蛋白 i (见材料表) 在50毫米的 HEPES。在室温下, 用胶原蛋白溶液在顶部孵化水凝胶。
      注: 为了防止脱水/蒸发, 将多井板放在二次容器中, 并在容器内外围添加浸泡在水中的实验室清洁组织。
   6. 使用荧光或共焦显微镜40X 目标测量水凝胶的厚度。通过定位底部的 z 位置 (玻璃表面是) 和水凝胶的顶面 (其中荧光珠的强度最大)。然后减去 z 位置以确定高度。
      注: 我们使用了倒置荧光显微镜和40X 目标的数值孔径0.65 测量水凝胶的厚度。原子力显微镜测量 (AFM) 也可以在这一点上进行, 以确认水凝胶的确切刚度 (见图 2)。
   7. 在将感兴趣的细胞播种到水凝胶上之前, 在水凝胶上加入1毫升的介质, 并将它们孵化在37˚C 30 分钟到1小时, 以确保平衡。
      注意: 我们添加了 MCDB-131 完全介质, 因为这是在模型宿主单元格 (HMEC-1) 中培养的介质 (请参见步骤 2.1以了解详细信息)。

图 2: AFM 对 PA 水凝胶刚度和珠子分布的测量.A. 数据显示 PA 水凝胶的预期杨氏模量 (刚度测量), 考虑到使用的丙烯酰胺和双丙烯酰胺的用量与用 AFM 测量的杨氏模量 (N = 5-6)。水平条形图描述平均值。0.6 帕水凝胶的刚度无法测量, 因为水凝胶非常柔软, 并附着在 AFM 尖端。B. 这是一个融合 HMEC-1 细胞的相图, 以及嵌入在软3帕-PA 水凝胶最上层表面的珠子的相应图像。HMEC-1 的种子为24小时, 浓度为每井 4 x 10⁵细胞。C. 此图像与图 2B相同, 但对于居住在70帕 PA 的硬水凝胶中的细胞。请单击此处查看此图的较大版本.

2. 水凝胶中的人微血管内皮细胞培养和播种

1. 培养 HMEC-1 (人, 微血管内皮) 细胞在 MCDB-131 全媒体包含 MCDB-131 培养基辅以10% 胎牛血清, 10 毫升的表皮生长因子, 1 µg/毫升的松, 和2毫米的 l-谷氨酰胺 (见材料表).
2. 分裂融合文化1:6 每 3-4 天, 保持细胞直到通道40。
3. 在实验前的一天, 用0.25% 胰蛋白酶/EDTA 将细胞从培养容器中分离出来。首先清洗细胞和他们的培养容器1x 与无菌磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS), 然后加入适量的0.25% 胰蛋白酶/EDTA (2 毫升每100毫米菜或75厘米瓶, 1 毫升每60毫米菜或25厘米瓶), 孵化瓶在37°c 5-10 分钟使细胞脱离基底。
4. 通过添加所需的 MCDB-131 全介质的体积, 将胰蛋白酶中和, 吸管轻轻地分解细胞的团簇, 然后将溶液放入锥形离心管中。
5. 轻轻地旋转细胞的溶液, 以确保细胞均匀分布, 然后取出20µL 的溶液, 并非常温和地填写盖玻片玻璃 hemocytometer 下面的两个腔室。
6. 用离心法在 500 x g 10 分钟内将锥形离心管中所含细胞的溶液颗粒向下。
7. 在10分钟等待期间, 使用 hemocytometer 计数单元格。使用显微镜, 专注于 hemocytometer 的网格线与10X 目标, 然后使用手计数计数器来计算1毫米 x 1 毫米正方形中的单元格数。
8. 将 hemocytometer 移动到另一1毫米 x 1 毫米正方形, 计算那里的单元格, 然后重复两次该过程。计算四测量的平均值, 然后将平均值乘以 10⁴。最终的值是细胞悬浮中存活的细胞/mL 的数量离心。
9. 从锥形离心管中取出液体, 同时确保细胞颗粒不被破坏。并用重悬在 MCDB-131 全介质中的细胞浓度为 4 x 10⁵细胞/毫升。
10. 先去除水凝胶的培养基, 然后在每个水凝胶上加入1毫升的细胞悬浮液, 将悬浮在水凝胶上的细胞播种。

3. 人微血管内皮细胞与l-李斯特菌的感染

1. 提前准备
   注: 提前准备以下解决方案。
   1. 链霉素、氯霉素和庆大霉素库存
      1. 通过对硫酸链霉素0.5 克的称量, 并将其完全溶解成10毫升的超纯水, 制备50毫克/毫升的链霉素库存溶液。
      2. 通过称量75毫克氯霉素并将其完全溶解为10毫升100% 乙醇, 制备7.5 毫克/毫升氯霉素库存溶液。
      3. 通过称量0.2 克硫酸庆大霉素并将其完全溶解成10毫升的超纯水, 制备庆大霉素20毫克/毫升的溶液。
      4. 过滤-消毒所有的库存解决方案与一个0.2 µm 注射器过滤器, 并储存在-20 摄氏度长期使用 (1-2 月)。
   2. 脑心输液 (BHI) 培养基和琼脂板
      1. 找到两个1升烧瓶, 并在每个烧瓶内添加一个磁搅拌棒。
      2. 对于 BHI 介质, 在一瓶中加入37克 BHI 粉, 并将超纯水加至 1 l. 将烧瓶放在磁搅拌板上, 直到粉末溶解后, 将溶液搅拌均匀。
      3. 对于 BHI 琼脂板, 添加37克 BHI 粉和15克的颗粒琼脂 (见材料表) 在第二瓶, 并添加超纯水高达 1 l. 将烧瓶放在磁搅拌板上, 直到粉末溶解后, 将溶液搅拌均匀。
      4. 拧紧烧瓶的盖子不太紧密和蒸压的解决方案使用的液体设置或根据高压釜的规格。
      5. 从高压釜中取出溶液, 然后将琼脂-BHI 溶液冷却到55摄氏度。如果1升瓶中的 BHI 介质保持不育, 可以使用最多一个月。
      6. 要准备细菌琼脂-BHI 板, 首先添加抗生素, 如果适当的话, 对含有 BHI 和琼脂的瓶子 (取决于细菌菌株的生长)。简单地把瓶子放在一个磁力搅拌板上, 允许快速搅拌。
         注: 这里使用的抗生素是特定于 Lm 菌株使用, 但任何必要的抗生素可用于 BHI 琼脂板。我们增加了链霉素的浓度为200µg/毫升和氯霉素的浓度为7.5 µg/毫升, 因为 10403S Lm 菌株耐链霉素。这些菌株与含有氯霉素乙酰转移酶开放阅读框架的质粒相结合, 因此对氯霉素有抗药性。
      7. 将混合物倒入10厘米聚苯乙烯细菌培养板 (每板约20毫升)。要除去气泡, 请简单地将盘子的上部表面点燃。在室温下过夜的冷盘子。
      8. 第二天, 密封干燥板, 并储存在4摄氏度。
2. 人微血管内皮细胞与l-李斯特菌的感染
   1. 感染前三天, 将 Lm 菌株从甘油 (贮存在-80 摄氏度) 的 BHI 琼脂板上取出, 并在适当的情况下含有7.5 µg 氯霉素和200µg/毫升链霉素。
      注: 被条纹的菌株可以是野生型或突变体, 组成性表达荧光 (用于染色 JAT1045) 或表达荧光在学报启动子 (流式细胞术或牵引力显微镜 JAT983 或 JAT985使用了)²²。
   2. 孵化板在37°c, 直到离散的殖民地形成 (1-2 天)。
   3. 在传染的前一天, 生长期望的劳损隔夜, 摇晃它在 150 rpm 在30°c 在 BHI 媒介与7.5 µg 或毫升氯霉素 (如果适当)。
      1. 将5毫升的 BHI 介质放在15毫升锥形离心管中, 加入7.5 µg/毫升氯霉素 (如果合适), 然后用不育的10µL 提示, 从琼脂盘中接种单一菌落。
   4. 第二天, 就在感染之前, 通过稀释样品1:5 测量 600 nm (OD600) 细菌溶液的光密度;使用仅包含 BHI 的试管作为空白。
   5. 稀释隔夜文化到 OD600 0.1 和孵化它, 摇晃2小时在30°c, 在 BHI 媒介与7.5 µg 或毫升氯霉素 (如果适当) 允许细菌到达日志阶段成长。
   6. 测量细菌溶液的 OD600, 预计约为 0.2-0.3。如果 OD600 更高, 稀释它到 0.2-0.3 与 BHI 单独。
   7. 将1毫升细菌溶液放入离心管中。用室温离心法在 2000 x g 处旋转4分钟。在组织培养罩中除去上清和并用重悬1毫升组织培养级 PBS 中的细菌颗粒。在室温下, 在 2000 x g 处旋转4分钟, 将细菌清洗两次。清除上清液, 并用重悬1毫升的 PBS 中的细菌。
   8. 通过混合10或50µL 的细菌悬浮在 PBS 与1毫升 MCDB-131 全媒体, 以多种感染来制备感染混合体 (语言;即每宿主细胞的细菌数量), 每个宿主细胞大约有50个细菌, 或者每个宿主细胞有10个细菌。
   9. 将介质从24井板井中取出, 小心不要破坏水凝胶或细胞。用1毫升的 MCDB-131 全培养基冲洗细胞 1x, 然后将1毫升的细菌添加到每一个井中。
   10. 保持一些感染混合 (至少100µL), 以确定语言 (见步骤 3.3)。
   11. 用盖子盖住盘子, 用聚乙烯食品包装包装盘子以避免渗漏。将盘子放在离心机中, 在 200 x g 处旋转样品10分钟以同步入侵。将盘子移入组织培养孵化器, 在37摄氏度孵化30分钟。
   12. 用 MCDB-131 完整的培养基冲洗样品 4x, 并将其移入组织培养孵化器。在额外的30分钟后, 用培养基替换介质, 辅以20µg/毫升庆大霉素。
3. 感染多样性的测定 (语言)
   1. 在最初的30分钟孵化的宿主细胞与细菌, 准备10倍稀释的感染混合, 以确定的语言。10倍稀释混合100µL 的感染混合与900µL 的 1x PBS (10^-1稀释)。然后, 混合100µL 的 10^-1稀释与900µL 的 PBS (10^-2稀释)。
   2. 继续, 直到获得 10^-5稀释。
      注意: 所有的解决方案都需要在稀释之前混合好, 并且在每一步都要使用新鲜干净的吸管提示。
   3. 一旦稀释, 放置100µL^-2 -10^-5稀释在 BHI/琼脂/氯霉素/链霉素板的中心 (如果适当)。
   4. 用火焰弯曲吸管来制造一个钩子, 用玻璃吸管做一个吊具。将吸管浸泡在100% 乙醇中进行杀菌, 然后用火焰将乙醇烧掉。
   5. 一旦摊铺机冷却后, 从 10^-5稀释开始, 将细菌稀释均匀地分布在板材上, 然后转移到更浓的混合物中。在37摄氏度的2天内将盘子孵化。
   6. 根据菌落密度, 确定 10^-3和 10^-4或 10^-4和 10-5 稀释板的菌落数.按如下方式计算教学语言:
      菌落数 x 稀释因子÷体积初始添加 = 每µL CFU 数
      每µL 的 CFU 数量 x 每个井的细菌混合量 = 每井 CFU 数
      每个井的 CFU 数 x 细胞的体积 = 每个细胞的细菌数量
      注: CFU 代表菌落形成单位。
   7. 平均 mois 》杂志从两个板块获得最后的 mois 》杂志。

4. 流式细胞仪定量测定宿主细胞胞外基质刚度依赖性对感染的敏感性

1. 重5毫克的胶原酶, 并将其放置在15毫升圆锥离心管。加入10毫升的0.25% 胰蛋白酶-EDTA, 并将它们混合好。
2. 8 h 感染后, 从24井板井中取出介质, 用组织培养 PBS 冲洗井1x。从水井中取出 PBS, 并将胰蛋白酶-EDTA/胶原酶混合物的200µL 添加到每个井中。把这个放在组织培养孵化器中10分钟, 让细胞完全脱离。
3. 使用新鲜的吸管为每个井和吸管的混合上下8x。要温柔, 以免破坏细胞。在每个井中添加200µL 的全介质, 以中和胰蛋白酶。
4. 将每个井的400µL 细胞溶液转移到5毫升聚苯乙烯管中, 用 35-µm 细胞过滤器盖 (见材料表)。
5. 用流式细胞仪分析每样 1万-2万细胞。通过流式细胞仪进行数据采集, 并使用相关的商用软件确定受感染细胞的百分比。使用正向散射和侧向散射图对单元格计数的大部分分布进行浇口。
   注意: 这将确保对单个细胞的分析, 并消除碎片或细胞双峰或三胞胎。
   1. 测量受控未感染细胞的荧光信号, 并将受感染细胞的数量排除在自体荧光之外。

5. 细胞外细菌、显微术和图像处理的染色

注意: 采用这种方法, 将 ECM 硬度依赖性的细菌黏附力与宿主细胞表面的细菌内化 (入侵) 区分开来。

图 4: 染色的 HMEC-1 细胞驻留在不同硬度的水凝胶上, 以区分细菌黏附与侵袭.这些图像显示了一个典型的微分染色显示的例子。细胞核 (DAPI), B。所有细菌 (GFP) 和C。外部细菌 (Alexa-546)。HMEC-1 细胞居住在柔软的3帕水凝胶上。箭头指向已内化的细菌, 因此只在绿色通道上显示。dF中的数据指的是在软3帕和僵硬的70帕水凝胶上的受感染 HMEC-1 细胞捕获的 N = 20 图像, 并显示 d。每核的总细菌;E. 每个原子核内化的细菌;和F. 入侵效率 (内部细菌与总细菌的比例)。水平条形图描述数据的平均值。用非参数魏氏秩和检验计算P值。请单击此处查看此图的较大版本.

1. 30分钟后感染, 洗涤 HMEC-1 细胞感染 JAT1045 (Lm, 组成性表达绿色荧光蛋白 (GFP)) 4x 与媒体。
2. 第四洗涤后, 混合1µL 1 毫克/毫升赫斯特染料1毫升 MCDB-131 全介质, 并添加到每个井, 以染色细胞的细胞核。将细胞放置在组织培养孵化器中10分钟。
3. 用 PBS 清洗细胞1x。在室温²⁸下, 用非 permeabilizing 固定剂在20分钟的染色中进行鉴别。
   注: 该固定剂含有0.32 米蔗糖, 10 毫米 MES pH 6.1, 138 毫米氯化钾, 3 毫米氯化镁₂, 2 毫米 EGTA, 4% 甲醛 (电子显微镜等级)。
4. 用 PBS 清洗细胞1x。用5% 牛血清白蛋白 (见材料表) 在 PBS 中阻断样品30分钟。
5. 用抗 Lm原抗体 (见材料表) 将1小时的样品孵化成含有 2% BSA 的 PBS 稀释1:100。
6. 在 pbs 3x 中冲洗样品, 然后用 AlexaFluor-546 山羊抗兔二级抗体 (见材料表) 在 pbs 中稀释 1:250, 其中含有 2% BSA。在 PBS 中清洗样品3x。将样品储存在1毫升的 PBS 中进行成像。
7. 图像和分析每个条件超过1000个细胞。
   1. 对于成像, 使用一个反荧光显微镜与 CCD 相机 (见材料表) 和40X 空气计划萤石空气目标与0.6 数字孔径 (NA)。
      注: 电源设置为 25%, 曝光时间为100毫秒. 用于 mCherry 的显微镜过滤器为 470/525 nm, 用于 GFP 530/645 nm, DAPI 395/460 nm, 分别用于激发和发射。我们使用的显微镜是由一个开放源码显微镜软件包²⁹控制的。
   2. 对于差异染色, 将所有与单个细胞相关的绿色细菌计数为粘附。计数细菌是 ' 绿色 ' 和 ' 红色 ' (由于抗体捆绑) 作为非内化。
      注: 我们通过运行一个定制的脚本和 CellC 软件 (见材料表) 来确定核数, 以列举细菌³⁰。

6. 多井牵引力显微镜和单层应力显微镜

图 5: Lm 感染的 HMEC-1 细胞降低了他们在感染过程中对其 ECM 施加的牵引力的大小.面板A显示相图, B显示变形场, C显示牵引应力场, D显示居住在20帕水凝胶上的未感染 HMEC-1 细胞的细胞内张力场。变形图 (µm) 的颜色条, 牵引应力图 (Pa) 和细胞内张力图 (nNµm^-1) 显示在热图的上部。列显示三个代表性的时间点: 3, 8 和 18 h 后感染。E H。与面板AD相同, 但对于在300的语言中感染 Lm 的细胞。细菌 (红色通道) 的图像叠加在细胞的相图像上。同时对多井 TFM 记录进行了成像。PIV 的窗口大小为32像素, 重叠为16。刻度条为32µm。此数字已从 Bastounis 和 Theriot⁵⁹进行了修改。请单击此处查看此图的较大版本.

1. 在24井板上准备 PA 水凝胶 (见步骤 1)。种子 HMEC-1 细胞 (见步骤 2), 并感染他们与 JAT983 如上文所述 (见步骤 3)。
2. 用10% 胎牛血清、10毫升表皮生长因子和1微克/毫升氢化莱博维茨补充 L-15, 制备活显微镜培养基。
   注: L-15 已经含有2毫米 l-谷氨酰胺, 所以没有必要增加额外的 MCDB-131 介质的情况下。
3. 4 h 感染后 (当内化 JAT983 开始荧光), 混合 1 ul 1 毫克/毫升赫斯特染料与1毫升 L-15 全介质, 并添加到每个井, 以染色细胞的细胞核。将细胞在组织培养孵化器中放置10分钟, 然后在每个井中替换 L-15 全介质与1毫升 L-15 全培养基辅以20µg/毫升庆大霉素。
4. 用盖子盖住盘子, 把它放在显微镜的环境室里 (见材料表) 平衡到37˚C。
   注: 对于成像, 使用一个反荧光显微镜与 CCD 相机 (见材料表) 和40X 空气计划萤石空气目标与 0.6 NA。
5. 获取荧光珠和荧光细菌的多通道时间推移图像, 以及宿主细胞的相对比图像, 每隔10分钟4到12小时。
   注: 对于成像, 电源设置为 25%, 曝光时间为100毫秒. 用于 mCherry 和 GFP 的显微镜过滤器 (激发/发射) 分别为 470/525 nm 和 530/645 nm。
6. 在录音结束时, 在每个水井中添加500µL 10% 的月桂酸钠 (SDS) 在水中。
   注: 这些细胞将从水凝胶中分离出来, 水凝胶将回到最初的变形状态, 因为它是弹性的。
7. 采取水凝胶的图像, 并将其作为参考变形图像。
8. 用粒子图像测速仪 (PIV)³¹对水凝胶的二维变形进行了测定, 并将时间序列的各个图像与变形水凝胶的参考图像进行了比较。根据实验的不同, 使用适当的窗口大小和重叠。
   注意: 我们使用了32像素的窗口, 重叠为16像素。
9. 计算2D 牵引应力, 细胞施加在水凝胶如其他地方^32,33。
10. 通过求解在单层上由 PA 水凝胶所产生的反应力的薄弹性板的力学平衡方程, 计算出前述牵引应力的单层张力, 这是一种对被测量的牵引重音的相反标志。
    注: 见补充材料 1。

7. 定量的时间推移显微镜评估细胞外基质刚度依赖性的 L.通过内皮细胞传播的李斯特菌

图 6:通过在3帕和 70-帕刚度基板上播种的 HMEC-1 膜的 Lm 传播的时间推移定量显微数据。这个面板显示两个代表性感染病灶的静止图像, 0、200、400和600分钟。相通道描述 HMEC-1 细胞膜, 红色通道描述胞内 Lm (见协议步骤 7 )。这个面板显示了凸壳的面积, 包括被绘制为时间函数的感染焦点。3人民军状况 (红色) 的重点区域比70人民 (绿色) 的发展速度快。C.此面板显示从中心到感染焦点边缘的径向距离, 绘制为以3帕 (红色) 和 70-帕 (绿色) 刚度为载体的 HMEC-1 膜中生长的代表性感染灶的时间函数。径向速度 (dr/dt) 是恒定的3帕的条件, 但双相为70帕的条件。D. 这些数据显示了十个独立感染灶的前200分钟的径向速度。红色 (3 帕) 和绿色 (70 帕) 数据点描述了前面面板中描述的两个焦点的斜率。水平条形图描述数据的平均值。用非参数魏氏秩和检验计算P值。请单击此处查看此图的较大版本.

1. 在24井板上准备 PA 水凝胶 (见步骤 1), 种子 HMEC-1 细胞 (见步骤 2), 并根据上述 (见步骤 3) 长出隔夜 JAT983 文化。
2. 感染日, 通过混合10µL MCDB-131 全培养基的细菌颗粒, 准备感染混合。小心地从24井板的水井中取出介质, 并在每个井中加入1.9 毫升的 MCDB-131 全介质和0.1 毫升的细菌混合物。
   注意: 这种化验中使用的较低的语言是必要的, 以分析从单一细菌侵入宿主细胞开始的传播事件。
3. 用盖子盖上盘子, 用塑料包装封住, 以免漏水。将盘子放在离心机中, 在 200 x g 处旋转样品10分钟以同步入侵。
4. 将盘子移入组织培养孵化器, 孵化5分钟。
5. 用培养基冲洗样品 4x, 将其移至组织培养孵化器。再加 5-7 分钟后, 用培养基替换培养基, 辅以20µg/毫升庆大霉素。
6. 孵化在孵化器中的板块额外的5小时, 让学报发起人打开和驱动的表达 mTagRFP 开放阅读框架³⁵。
7. 用10% 胎牛血清、10莱博维茨表皮生长因子和1µg/毫升氢化钙补充 L-15, 制备活显微镜培养基。
   注: L-15 已经含有2毫米 l-谷氨酰胺, 所以没有必要增加额外的 MCDB-131 介质的情况下。
8. 混合 1 ul 1 毫克/毫升赫斯特染料与1毫升的 L-15 全介质, 并添加到每个井, 以染色细胞的细胞核。将细胞在组织培养孵化器中放置10分钟, 然后在每个井中替换 L-15 全介质与1毫升 L-15 全培养基辅以20µg/毫升庆大霉素。用盖子盖住盘子, 把它放在显微镜的环境室里 (见材料表) 平衡到37˚C。
   注: 对于成像, 反荧光显微镜使用 CCD 相机 (见材料表) 和20X 空气计划萤石空气目标与 0.75 NA。该电源设置为 50%, 曝光时间为50毫秒. 用于 mCherry 的显微镜过滤器分别为470/525 纳米的激发和发射。
9. 图像多个位置每5分钟使用自动对焦功能, 以监测 Lm 如何通过 HMEC-1 单分子膜播种在不同的硬度水凝胶。
   注意: L-15 是用 HEPES 缓冲的, 所以在成像过程中没有必要使用 CO₂ 。

电解 HMEC-1 细胞对 Lm 感染的依赖敏感性:
不同刚度的 PA 水凝胶, 所有表面涂层的胶原 i, 是建立在多井玻璃底部板, 如协议步骤 1所述 (见图 1)。AFM 的测量是为了确认水凝胶的确切刚度, 如前所述26,27 (见图 2)。过去的研究表明, 内皮细胞基底膜的局部顺应性可以从1帕 (例如, 脑组织) 到70帕 (例如, 主动脉)36,37,38,39,40. 因此, 我们选择测试驻留在矩阵上的 HMEC-1 细胞感染, 其刚度如下: 0.6 帕, 3 帕, 20 帕, 70 帕。对于每一个水凝胶刚度, 六水凝胶的制备, 以评估结果的重现性。

流式细胞术用于评估 HMEC-1 细胞对 Lm 感染的 ECM 刚度依赖性 (见图 3)。HMEC-1 细胞感染了 Lm 应变 (JAT985), 在内化后表达荧光标记 (actAp: mTagRFP), 只允许检测细胞内细菌 (见图 1L - 1N)。JAT985 也缺乏学报, 禁止细菌从细胞扩散到细胞, 因为学报对于形成肌动蛋白彗星尾巴和随后的细菌传播是必要的。7-8 h 感染后, 使用流式细胞仪对 HMEC-1 细胞感染进行评估。为了保证对单个细胞的分析, 细胞计数分布的大部分是使用正向散射图进行封闭的, 然后再执行第二个浇口步骤, 以排除展示自体荧光的细胞 (见图 3A - 3C).图 3所示的初步结果表明, 与驻留在软0.6 人民军水凝胶上的 HMEC-1 细胞相比, Lm 的 HMEC-1 感染大约是两倍大的, 与住在柔软的70人民的帕里的细胞相比较 (见图 3B -3D). 与软矩阵相比, HMEC-1 细胞在僵硬时的 lm 感染敏感性增加可能是由于: 1. 增加 lm 对 HMEC-1 的黏附力;2. 增加 Lm 入侵 HMEC-1;或3。以上两种都是共同发生的。为了测试哪个假说持有, HMEC-1 细胞被播种在软 (3 帕) 和僵硬 (70 帕) 水凝胶和感染组成性 GFP 表示 Lm (见图 4A - 4C)。样品在感染后不久就被固定, 而外部 (附着) 的细菌则被抗体染色。使用定量显微镜, 我们发现, 当宿主细胞与软凝胶相比时, HMEC-1 的细菌附着在僵硬的情况下 (见图 4D)。与流式细胞仪数据一致, 当宿主细胞与软凝胶相比时, HMEC-1 的细菌内化程度明显增加 (见图 4E)。然而, 无论基底硬度 (见图 4F), Lm 进入 HMEC-1 细胞的入侵效率 (细菌内化/细菌总数) 是相似的。

Lm 感染 HMEC-1 细胞的牵引力显微术:
HMEC-1 细胞的 Lm 感染可改变受感染宿主细胞的生物力学, 包括附着于其 ECM 或彼此的强度, 影响其屏障完整性。我们试图用牵引力显微镜32计算细胞 ECM 牵引力和单层应力显微镜41计算胞内张力, 以此来评估这种情况是否可能。图 5描述了在不同时间点感染后的 20-帕水凝胶 HMEC-1 细胞的形变场、牵引应力场和细胞内张力场的分布图。图 5A - 5D指未感染的控制 HMEC-1 细胞, 而图 5E - 5H指的是 HMEC-1 细胞感染 Lm 在多重感染等于300细菌/细胞。这项初步工作表明, 受感染的 HMEC-1 细胞降低其细胞 ECM 和细胞内应力的程度, 在感染的过程中, Lm, 而这是没有观察到未感染的控制细胞。

ECM 刚度依赖性 Lm 在 HMEC-1 单分子膜中的传播:
采用时移显微术研究了基质刚度对 Lm 通过 HMEC-1 膜传播的影响。当 Lm 通过单层传播时, 细菌会产生一种感染的焦点, 作为时间的函数而增长 (参见图 6a和视频图 1和2)。感染焦点的面积是通过绘制一个凸壳来测量的, 这个最小的凸多边形包含一组点, 围绕细菌42。在这一领域中, 没有标准的指标来衡量L. 李斯特细胞对细胞的效率, 通过一层宿主细胞传播。为了评估传播效率, 一些人计算了感染焦点41中的宿主细胞数, 另一些人在感染宿主细胞组43周围手动绘制了边界。我们选择在细菌周围画一个凸多边形, 因为它是一个自动化的、一致的、计算性很低的过程, 用来测量李斯特菌传播的效率.通过这样做, 我们发现在70帕水凝胶上播种的 HMEC-1 细胞的感染焦点区域略有减少 (见图 6B和视频图 1和2)。为了确定感染焦点的生长速率, 通过取感染焦点区域的平方根并将其与 pi 进行划分, 将径向距离绘制为时间函数。这种数学变换假定感染焦点的形状大致为圆形44。为了测量聚焦生长的速度, 测量了3和70帕矩阵的径向距离的变化率 (即斜率)。这一方法阐明, 感染焦点增长更快, 单调的 HMEC-1 细胞播种到3人民军矩阵。然而, 聚焦在 70-帕矩阵上的单元格 (见图 6C), 其对焦速度明显减慢 (前200分钟) 和稍慢 (200 至600分钟)。事实上, 对进一步数据的分析证实, 在70帕的矩阵中, 感染焦点平均增加了两倍, 特别是在前200分钟 (见图 6D)。

图 3: 应用流式细胞仪测量 HMEC-1 细胞对 Lm 入侵的依赖敏感性. HMEC-1 细胞感染 Lm (JAT985), 通过流式细胞仪对感染进行分析。这个面板显示了一个来自一个井的代表性 HMEC-1 细胞的侧向散射图。通过门控选择细胞的体积分布, 排除碎片 (左) 和细胞双峰或三胞胎 (右)。这张图显示了每个细胞的 Lm 荧光强度对数的直方图, 用于在软0.6 帕上镀 HMEC-1。这张图显示了 HMEC-1 在70帕水凝胶上镀的每细胞的 Lm 荧光强度的对数直方图。N = 4-6 复制的直方图以不同的颜色显示。控制未感染细胞的直方图是紫色的。用来定义被感染的门是用红色显示的。该语言为 100, 感染评估8小时后感染。D. 数据显示受感染的 HMEC-1 细胞与水凝胶硬度的百分比 (N = 5)。水平条形图描述数据的平均值。用非参数魏氏秩和检验计算P值。请单击此处查看此图的较大版本.

视频图 1:通过在3帕基板上播种的 HMEC-1 细胞单层 (相位) 传播胞内 Lm (红色通道). 细胞在莱博维茨的 L-15 媒介 (10% 个血清, 20 µg/毫升庆大霉素) 被成像在一个环境房间平衡到37˚C。这些图像每5分钟收集一次。电影速度是15帧/秒.请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.

视频图 2: 通过在70帕基板上播种的 HMEC-1 细胞单层 (相位) 传播胞内 Lm (红色通道). 细胞在莱博维茨的 L-15 媒介 (10% 个血清, 20 µg/毫升庆大霉素) 被成像在一个环境房间里平衡到37°c。这些图像每5分钟收集一次。电影速度是15帧/秒.请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.

表1。变刚度聚丙烯酰胺 (PA) 水凝胶的组成.在这个表中, 40% 的丙烯酰胺溶液的百分比和2% 双丙烯酰胺溶液的百分比达到给定的刚度 (杨氏模量, E) 在不同的列表示。

补充材料1。计算牵引应力计算胞内张力.请单击此处下载此文件.

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