基于聚丙烯酰胺的多井格式实验研究细胞外基质硬度对黏附细胞细菌感染的影响

该方法的总体目标是能够以高度定量的方式表征细胞外基质刚度对贴壁细胞细菌感染的影响。这种方法可以帮助回答宿主病原体生物力学新兴领域的关键问题，例如机械力在调节宿主细胞的细菌感染易感性中的作用是什么。该技术有助于创建高分辨率的延时视频序列，同时筛选多种情况并自动执行某些程序。

要对 24 孔培养皿进行玻璃活化，每 13 毫米直径的孔添加 500 微升 tumalo 氢氧化钠，并在室温下孵育板 1 小时。丢弃氢氧化钠，用超纯水冲洗孔一次。然后向每个孔中加入 500 微升 2% 的 2% 三乙氧基硅烷的 95% 乙醇溶液，并孵育 5 分钟。

用水冲洗井一次。然后向每个孔中加入 500 微升 0.5% 戊二醛，并将板孵育 30 分钟。用水冲洗一次后，盖上盖子，在 60 摄氏度下擦干板子。

要制造可调刚度的水凝胶，请制备含有 3% 至 10% 的 40% 原液和 06% 至 6% 的双丙烯酰胺溶液的水溶液，具体取决于水凝胶的所需刚度。在此之后，加入水。对于每种刚度，溶液 1 不含微珠，而溶液 2 包含 03% 0.1 微米荧光微珠。

将溶液 1 和 2 真空脱气 15 分钟，以去除会抑制聚合的氧气。然后，在快速作用的同时，将 0.43%TEMED 和 0.6% 的 10 克/毫升 APS 储备液添加到溶液一中。向 24 孔培养皿的每个孔的中心添加 3.6 微升溶液。

立即使用 12 毫米圆形盖玻片盖住孔，让溶液静置 20 分钟，使其完全聚合。轻轻敲击注射器针头在坚硬的表面上，在其尖端形成一个小钩子，以方便取下盖玻片，然后用针头提起盖玻片。接下来，将 0.43% TEMED 和 0.6% 的 10 克/毫升 APS 储备液添加到溶液二中。

然后将 2.4 微升混合物浇注在 12 毫米圆形盖玻片上。将装有一滴溶液 2 的圆形盖玻片放在第一层聚丙烯酰胺层的顶部，并使用镊子轻轻向下按压，以确保第二层的厚度最小。然后让 Solution Two 聚合 20 分钟。

向每个孔中加入 500 微升 50 毫摩尔 HEPES pH 7.5，并使用注射器针头和镊子取下玻璃盖玻片。要对水凝胶进行消毒，请将它们放入组织培养罩中，并在紫外线下暴露 1 小时。现在，制备每体积重量为 0.5% 的 Sulfo-SANPAH 和 1% DMSO 以及 50 毫摩尔 HEPES pH 7.5 的混合物。

将 200 微升溶液添加到水凝胶的上表面。然后快速工作，将它们暴露在 302 纳米紫外线下 10 分钟以激活它们。使用一毫升 50 毫摩尔 HEPES pH 7.5 洗涤水凝胶两次，必要时重复以去除任何多余的交联剂。

用 200 微升 0.25 毫克/毫升的大鼠尾部胶原蛋白 I 和 50 毫摩尔 HEPES 包被水凝胶。将水凝胶与胶原蛋白在室温下孵育过夜。在将目标细胞接种到水凝胶上之前，加入 1 毫升培养基并在 37 摄氏度下平衡 1 小时。

为了接种人微血管内皮细胞，在根据文本方案培养和制备细胞悬液后，从水凝胶中去除培养基，然后向每个孔中加入 1 毫升细胞悬液。根据文本方案制备单核细胞增生李斯特菌过夜培养物后，将 1 毫升培养物转移到微量离心管中，并在室温下以 2， 000 次 g 的速度离心 4 分钟。使用组织培养级 PBS 洗涤沉淀两次后，使用 1 毫升 PBS 重新悬浮沉淀。

通过将 10 或 50 微升细菌悬浮液与 1 毫升 MCDB 131 完全培养基混合来制备感染混合物，以获得每个宿主细胞约 50 个细菌或每个宿主细胞 10 个细菌的感染复数或 MOI。从 24 孔板的孔中取出培养基，注意不要破坏水凝胶或细胞。使用 1 毫升 MCDB 131 完全培养基洗涤细胞一次，然后向每个孔中加入 1 毫升细菌。

将盖子盖在盘子上，并用聚乙烯食品包装膜包裹，以免泄漏。将板以 2， 000 倍 g 离心 10 分钟以同步侵袭，然后将培养物在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。使用 MCDB 131 全培养基，将样品洗涤 4 次，然后将其放回组织培养箱中。

再过 30 分钟后，用补充有 20 μg/mL 庆大霉素的 MCDB 131 完全培养基替换培养基。要进行流式细胞术，感染后 8 小时，从 24 孔板的孔中取出培养基，并使用组织培养 PBS 洗涤孔一次。去除 PBS 后，向每个孔中加入 200 微升胰蛋白酶 EDTA 胶原酶混合物。

将培养皿放入组织培养箱中 10 分钟，以使细胞完全分离。轻轻移液每个孔 8 次后，加入 200 μL 全培养基以中和胰蛋白酶。将每个孔中的 400 μL 细胞溶液转移到带有 35 μm 细胞过滤器盖的 5 mL聚苯乙烯管中。

通过流式细胞术分析样品。将 HMEC-1 细胞接种在 Pa 水凝胶上并根据文本方案用庆大霉素处理后，将板孵育 5 小时，以使 ActA 启动子打开并驱动 mTagRFP 开放阅读框的表达。感染后 4 小时，将 1 微升每毫升 1 毫克的 Hoechst 染料与 1 毫升 L-15 完全培养基混合，并将其添加到每个孔中以对细胞核进行染色。

细胞孵育 10 分钟后，用 1 毫升 L-15 完全培养基替换培养基，每毫升添加 20 μg 庆大霉素。使用自动对焦功能每 5 分钟对多个位置进行成像，以监测 LM 细菌如何通过接种在不同刚度水凝胶上的 HMEC-1 单层传播。如该图所示，进行了 AFM 测量以确认使用本视频中的方案制备的 Pa 水凝胶的确切刚度。

在这里，不同刚度的母体上的 HMEC-1 细胞被 LM 菌株感染，该菌株在内化后表达荧光标志物，仅允许检测细胞内细菌。使用前向与侧向散点图对细胞进行设门，第二个设门步骤排除了表现出自发荧光的细胞。流式细胞术分析显示，硬质 70 千帕水凝胶的 LM 感染大约是 0.6 千帕水凝胶的两倍。

为了测试 LM 对 HMEC-1 的粘附增加是否增加了 LM 对 HMEC-1 的侵袭，或两者兼而有之，是导致感染易感性增加的原因 感染组成型表达 GFP 的 LM 感染后不久，HMEC-1 细胞被固定并粘附细菌用抗体染色。如图所示，与软凝胶相比，当宿主细胞驻留在硬质上时，粘附在 HMEC-1 上的细菌明显更多。与流式细胞术数据一致，与软胶囊相比，当宿主细胞驻留在硬质细胞上时，HMEC-1 内化的细菌明显更多。

一旦掌握，该检测可以在大约三天内完成，因为中间需要很长的孵育步骤。在尝试此程序时，请务必记住尽可能无菌，以确保水凝胶和宿主细胞无污染。在此程序之后，还可以结合其他方法（例如原子力显微镜）来回答诸如宿主细胞的刚度在感染后如何变化以及这种影响是否取决于基质刚度等问题。

开发后，该技术为机械生物学领域的研究人员铺平了道路，他们通过使用不同的宿主细胞（如上皮细胞）和不同的细菌病原体（如帕克次体）来探索宿主细胞病原体生物力学相互作用的作用。观看此视频后，您应该对如何在多孔板上制造具有可调刚度的水凝胶以及如何进行感染测定有很好的了解。不要忘记，与病原菌一起工作可能是危险的。

因此，在执行此程序时，应始终采取预防措施，例如在进入部位和病原体之间插入屏障，以及防止气溶胶的产生。