Name: 基于聚丙烯酰胺的多井格式实验研究细胞外基质硬度对黏附细胞细菌感染的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: 学习基于聚丙烯酰胺水凝胶的多井格式实验方法，研究细胞外基质硬度对HMEC-1内皮细胞感染Listeria monocytogenes的影响。该方法结合流式细胞术和原子力显微镜，实现高通量筛选宿主-病原体生物力学相互作用。

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感谢 M. Footer、R. Lamason、M. Rengaranjan 以及 Theriot 实验室成员的讨论和实验支持。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）R01AI036929（J.A.T.）、霍华德·休斯医学研究所（HHMI）（J.A.T.）、HHMI 高级研究 Gilliam 奖学金（F.E.O.）、斯坦福研究生奖学金（F.E.O.）、&#160;美国心脏协会（E.E.B.）、NIH 1R01HL128630（R.S.）和 NIH 1R01HL130840（R.S.）资助。流式细胞术在斯坦福共享 FACS 设施完成。

作者无任何利益冲突需要披露。

细胞能够感知多种物理环境信号，这些信号不仅影响细胞的形态，还会影响其基因表达和蛋白质活性，从而影响细胞的关键功能和行为45,46。细胞外基质（ECM）的刚度 increasingly 被认为是调控细胞运动性、分化、增殖乃至细胞命运的重要调节因子47,48,49。尽管近年来在理解细胞与其ECM之间复杂的生物力学相互作用方面取得了诸多进展，但环境刚度如何影响细胞对细菌感染的易感性仍知之甚少。为了促进此类研究，我们开发了一种基于聚丙烯酰胺水凝胶制备的新型多孔检测方法，该水凝胶的刚度可调，并且适用于感染实验50。传统上，组织培养中细胞的细菌感染研究通常在玻璃或聚苯乙烯表面进行，而这些表面的刚度比大多数贴壁细胞的天然ECM高出约1至3个数量级8,51。本文所述的检测方法通过实现在生理相关环境刚度条件下研究细菌-宿主相互作用，开辟了新的研究途径。
为了验证本实验方法的概念，选用 HMEC-1 细胞作为模型贴壁宿主细胞，单核细胞增生李斯特菌（Lm）作为模型细菌病原体。然而，若经过适当修改，该方法可拓展用于进一步的研究。此类研究可涉及其他病原体（包括细菌和病毒）对不同类型哺乳动物贴壁宿主细胞的感染。在本实验中，凝胶使用 I 型胶原蛋白进行包被，但根据宿主细胞类型的不同，也可采用其他细胞外基质（ECM）蛋白包被，例如层粘连蛋白（laminin）或纤连蛋白（fibronectin），以促进目标宿主细胞在水凝胶上的贴附52。另一个与宿主细胞类型相关的考虑因素是所研究的水凝胶刚度范围。该刚度范围应依据特定宿主细胞类型的生理相关性，以及宿主细胞在特定刚度水凝胶上贴附并形成单层的能力而定。 同样，根据拟研究的病原体模型，可能需要对本文所述的感染实验方案进行适当调整。
与以往制备聚丙烯酰胺水凝胶的方法相比24,50,53，本检测方法的创新之处在于整合了若干独特特性。首先，水凝胶构建于多孔玻璃底板上，可实现多种实验条件的同时筛选以及部分操作的自动化。由于该方法的结果可能受到宿主细胞代次以及感染时加入细菌数量等实验间常存在差异的因素影响，因此同时监测多个条件或检测多个重复组至关重要。本检测方法的另一独特之处在于水凝胶厚度约为40 µm，足够薄，可使用常规显微镜成像。我们已证明，可成功进行活细胞显微观察以及细胞固定、免疫染色后成像，且不会引入高背景荧光。最后，水凝胶由两层构成，上层嵌有荧光微珠，并局限于单一焦平面内。该特性可确保成像过程中无离焦光干扰。微珠的存在不仅可用于检测凝胶表面形貌以确保其均匀性，还可提升TFM和MSM24,32,41的性能。利用TFM和MSM，可分别计算位于不同刚度基质上的细胞与细胞外基质（ECM）之间以及细胞与细胞之间的力学作用力。通过这一新型检测方法，可同时比较环境刚度和感染对物理力的贡献，从而进行相关测量。采用该方法，可确定感染在其整个过程中对宿主细胞力学特性的影响。此外，可利用MSM计算细胞内应力的演变过程，并将其作为单层屏障完整性的衡量指标。最后，鉴于该检测方法具有多孔特性，可在细菌感染的同时引入药理学或遗传学干扰，从而更深入地研究宿主细胞力学与感染之间的复杂相互作用。
该技术的一个内在局限性在于基底刚度可能对细胞增殖速率产生影响。通常在感染实验中，我们需要确保不同条件下宿主细胞的密度保持一致，因为细胞密度本身可能会影响宿主对感染的易感性。作为宿主细胞使用的HMEC-1细胞在水凝胶上接种24小时后，其数量未表现出显著差异。然而，不同类型的细胞可能会根据水凝胶的刚度表现出不同的增殖行为，从而对感染研究造成偏差。类似地，当细胞无法形成单层或在水凝胶上贴附不良时，也可能引起感染偏差，例如某些细胞类型接种于非常柔软的基质上时（例如，人脐静脉内皮细胞或马迪-达尔比犬肾上皮细胞接种于0.6 kPa水凝胶上54,55）。就病原体而言，某些细菌（例如，Borrelia burgdorferi）不仅能够黏附于宿主细胞并侵入其中，还可能穿过这些细胞56。我们尚未验证该实验方法是否适用于病原体跨细胞迁移研究，但已有研究表明中性粒细胞穿过接种于聚丙烯酰胺水凝胶上的内皮细胞进行跨内皮迁移的实验已成功实现57，因此该应用似乎是可行的。已有大量研究阐述了如何通过调节丙烯酰胺和双丙烯酰胺的适当浓度来制备具有特定杨氏模量的聚丙烯酰胺水凝胶24,25,26,27。然而，特别是在希望对生长于不同刚度水凝胶上的细胞进行牵引力显微镜（TFM）实验时，通过原子力显微镜（AFM）或其他压痕技术验证水凝胶的实际刚度至关重要58。由于使用了不同的溶剂、陈旧的丙烯酰胺储存液，或AFM测量方式的差异（例如，AFM探针的形状），可能导致实测值与预期值出现轻微偏差。最后，本文所述方法基于将宿主细胞接种于二维基质上，这与更接近生理状态且更具生理相关性的三维环境存在差异。然而，构建可调控刚度的三维凝胶、接种宿主细胞并进一步进行病原体感染，目前仍面临一定的技术挑战。尽管如此，我们预计在不久的将来能够将本实验方法拓展至三维环境下感染过程的研究。
综上所述，本研究所描述的实验方案及初步结果表明，这种新型检测方法有望成为一种极为有用的工具，可用于以定量方式研究病原菌对贴壁宿主细胞的感染过程，并且相较于以往研究条件，其可在更接近生理状态的环境中进行。本实验体系中制备聚丙烯酰胺水凝胶的优势在于，该检测方法可兼容多种技术手段，例如流式细胞术、免疫染色后结合光学显微镜观察，以及牵引力显微镜技术。该方法可应用于不同类型病原体对多种贴壁宿主细胞感染的研究，我们预期这将对揭示病原体感染宿主的策略以及促进抗感染治疗手段的开发产生重要影响。

大多数动物组织中的细胞通常具有黏附性，能够与邻近细胞以及细胞外基质（ECM）相黏附。细胞与ECM的锚定对于多种细胞过程至关重要，包括细胞运动、增殖和存活。1,2细胞对细胞外基质（ECM）的锚定依赖于ECM的组成和刚度。细胞通过动态重排其细胞骨架、细胞-ECM黏附及细胞-细胞黏附来响应ECM刚度的变化，进而显著改变细胞的生物力学特性和功能。3,4,5,6。细胞外基质（ECM）的刚度在空间上可能有所不同（即，解剖位置），在时间上（即，衰老），以及在病理生理过程（例如动脉硬化，癌症，感染 等等。例如，普遍认为，位于较硬基质上的内皮细胞与位于较软基质上的相比，会对其细胞外基质（ECM）及彼此之间施加更大的作用力，并表现出更高的迁移性和增殖活性。7,8同样，位于较硬基质上的成纤维细胞对其细胞外基质施加较高的收缩力，并表现出增殖、迁移和细胞外基质生成增加9,10,11尽管不同细胞类型的细胞力学特性及其对细胞外基质（ECM）刚度的响应已被广泛研究，但黏附性宿主细胞、其细胞外基质的刚度与细菌感染之间的关系在很大程度上仍不清楚。
为了研究细胞外基质刚度在细菌-宿主细胞相互作用中的作用， L. monocytogenes 单核细胞增生李斯特菌（Lm）被选为模式病原体。Lm 是一种普遍存在的食源性细菌，可在多种哺乳动物宿主中引起全身性感染。这种兼性胞内病原体可通过穿越不同类型的血管内皮，从肠道上皮迁移至远端器官。若其突破血脑屏障，可导致脑膜炎；当其穿过胎盘屏障时，则可引发自然流产。12,13单核细胞增生李斯特菌（Lm）可感染多种宿主细胞类型，并可通过不同的致病策略实现感染。目前对Lm感染的研究主要集中于上皮细胞，而关于Lm如何感染并穿越血管腔内衬的内皮细胞，相关了解仍较为有限。14,15,16此外，细胞外基质（ECM）的刚度如何调控李斯特菌（Lm）侵入其宿主内皮细胞并进一步扩散的能力，在很大程度上仍不清楚。Lm 以及多种其他细菌物种（即, Rickettsia parkeri利用其感染的宿主细胞的肌动蛋白细胞骨架，以侵入细胞质并促进细胞间的扩散17,18,19它们通过表达特定蛋白质，干扰宿主细胞的肌动蛋白聚合通路，并产生肌动蛋白彗尾，从而实现向前推进。16,20由于感染，宿主细胞的肌动蛋白细胞骨架需要发生动态重排，这一过程目前尚未被完全阐明，可能会影响宿主细胞的生物力学特性，包括细胞对其细胞外基质（ECM）以及彼此之间施加的物理力。为了研究这些过程，选择人微血管内皮细胞（HMEC-1）作为模型宿主细胞，原因如下：1. 内皮细胞已知具有高度的机械敏感性，因其持续暴露于多种变化的物理刺激之下21；2. 单核细胞增生李斯特菌（Lm）感染内皮细胞的策略在很大程度上仍不清楚22；3. HMEC-1 是一种永生化细胞系，因此易于培养并可进行遗传操作。
宿主细胞的细菌感染研究主要在体外（in vitro）进行，通常将细胞接种于玻璃或聚苯乙烯基底上，而这些基底的刚度显著高于大多数细胞的生理细胞外基质（ECM）12,14,23。为了研究接种于具有生理相关刚度的基质上的细胞感染情况，并阐明ECM刚度对细菌病原体感染细胞的影响，我们采用了一种创新方法，即在多孔板上制备可调节刚度的、嵌有微珠的薄层聚丙烯酰胺水凝胶。该方法的新颖之处在于，其多孔板格式可实现多种条件的同时监测，且由于基底的特殊构建方式，可与多种技术兼容。将HMEC-1细胞接种于这些蛋白包被的水凝胶上，随后用不同单核细胞增生李斯特菌（Lm）菌株感染，这些菌株在被内化后可产生荧光，或本身具有组成性荧光。通过流式细胞术评估ECM刚度对宿主HMEC-1细胞感染易感性的影响。此外，采用免疫荧光染色和荧光显微镜技术区分黏附于细胞表面与已被内化的细菌。最后，成功实施牵引力显微镜（Traction Force Microscopy, TFM），以表征Lm感染对宿主内皮细胞在感染过程中施加于基质的牵引应力的影响。本研究所展示的检测方法可轻松改造，用于进一步研究ECM刚度对不同细胞系或病原体感染下贴壁细胞感染易感性的影响。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠颗粒</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷</td><td>Sigma</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>25% 戊二醛</td><td>Sigma</td><td>G6257-100ML</td><td></td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺</td><td>Sigma</td><td>A4058-100ML</td><td></td></tr><tr><td>双丙烯酰胺溶液 (2% w/v)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1404-250</td><td></td></tr><tr><td>羧基修饰的荧光微球，0.1 &amp;mu;m，黄绿色荧光 (505/515)</td><td>Invitrogen</td><td>F8803</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Fisher</td><td>BP17925</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Proteochem</td><td>c1111-100mg</td><td></td></tr><tr><td>大鼠I型胶原蛋白溶液</td><td>Sigma</td><td>C3867-1VL</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>J.T. Baker</td><td>9224-01</td><td></td></tr><tr><td>HEPES，游离酸</td><td>J.T. Baker</td><td>4018-04</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 培养基，无酚红</td><td>Thermofischer</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 培养基，无谷氨酰胺</td><td>Life technologies</td><td>10372019</td><td></td></tr><tr><td>基础胎牛血清，批号：A37C48A</td><td>Gemini Bio-Prod</td><td>900108 500ml</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子 (EGF)</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM</td><td>Fisher</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Fisher</td><td>SH30028FS</td><td></td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素</td><td>MP biomedicals</td><td>194530</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Sigma</td><td>C0378-5G</td><td></td></tr><tr><td>DifcoTM 琼脂，颗粒状</td><td>BD</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>BBL TM 脑心浸液</td><td>BD</td><td>211059</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342，三盐酸盐三水合物 — 水中 10 mg/μl 溶液</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>16% 电镜级甲醛</td><td>Electron microscopy</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>单核细胞增生李斯特菌抗体</td><td>Abcam</td><td>ab35132</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor&amp;reg; 546 标记</td><td>Thermofischer</td><td>A-11035</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA，含酚红</td><td>Thermofischer</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>梭菌胶原酶</td><td>Sigma</td><td>C8051</td><td></td></tr><tr><td>硫酸链霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>3810-74-0</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Calbiochem</td><td>8510</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Thermofischer</td><td>28364</td><td></td></tr><tr><td>MES 粉末</td><td>Sigma</td><td>M3885</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3040-05</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td>2444-1</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros</td><td>40991</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;一次性实验器材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 mm 圆形玻璃盖玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-81</td><td>No. 1.5 盖玻片 | 10 mm 玻璃直径 | 未包被</td></tr><tr><td>玻璃底 24 孔板</td><td>Mattek</td><td>P24G-1.5-13-F</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 聚苯乙烯管，带 35 &amp;mu;m 细胞筛帽&amp;nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>T-25 培养瓶</td><td>Falcon</td><td>353118</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形管</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>一次性移液管 (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德玻璃移液管</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 (1-200 &amp;mu;l, 101-1000 &amp;mu;l)</td><td>Denville</td><td>P1122, P1126</td><td></td></tr><tr><td>无粉检查手套</td><td>Microflex</td><td>XC-310</td><td></td></tr><tr><td>细菌比色皿</td><td>Sarstedt</td><td>67.746</td><td></td></tr><tr><td>剃刀</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>注射器针头</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>0.2 μm 灭菌瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>566-0020</td><td></td></tr><tr><td>20 ml 注射器</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>0.2 μm 滤器</td><td>Thermo Scientific</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>木棒</td><td>Grainger</td><td>42181501</td><td></td></tr><tr><td>保鲜膜</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-3687</td><td></td></tr><tr><td>细菌培养皿</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;大型/非一次性实验设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织培养罩</td><td>Baker</td><td>SG504</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>细菌培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>IGS180</td><td></td></tr><tr><td>组织培养箱</td><td>NuAire</td><td>NU-8700</td><td></td></tr><tr><td>尼康 Diaphot 200 倒置落射荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>NIKON-DIAPHOT-200</td><td></td></tr><tr><td>培养笼</td><td>Haison</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Scanford FACScan 分析仪&amp;nbsp;</td><td>Stanford 和 Cytek 升级的 FACScan</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>移液器辅助器</td><td>Drummond</td><td>4-000-110</td><td></td></tr><tr><td>移液器 (10 &amp;mu;l, 200 &amp;mu;l, 1000 μl)</td><td>Gilson</td><td>F144802, F123601, F123602</td><td></td></tr><tr><td>pH 计</td><td>Mettler Toledo</td><td>30019028</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>1 L 烧瓶</td><td>Fisherbrand</td><td>FB5011000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>Amsco</td><td>3021</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>Bellco</td><td>7760-06000</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌子</td><td>Bellco</td><td>1975-00100</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Beckman</td><td>DU 640</td><td></td></tr><tr><td>Scanford FACScan 分析仪</td><td>Cytek Biosciences</td><td>Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜软件 (&amp;mu;Manager)</td><td>Open Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Matlab Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowjo</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>自动化图像分析软件 CellC</td><td>https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td><td></td><td>该软件可免费获取。可执行文件和 MATLAB 源代码可在 https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ 下载</td></tr></tbody></table>

一种基于多孔板格式聚丙烯酰胺的检测方法，用于研究细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

细胞外基质刚度是多种已知可影响细胞行为、功能及命运的微环境力学刺激之一。尽管越来越多的贴壁细胞类型对基质刚度的响应已被表征，但贴壁细胞对细菌感染的易感性如何依赖于基质刚度仍 largely 未知，细菌感染对宿主细胞生物力学特性的影响也同样不清楚。我们假设，宿主内皮细胞对细菌感染的易感性取决于其所在基质的刚度，且细菌感染宿主细胞后会改变其生物力学特性。为验证这两个假设，本研究采用内皮细胞作为宿主模型，单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）作为病原体模型。通过建立一种新型的多孔板检测方法，我们证明可通过流式细胞术结合免疫染色和显微镜观察，定量评估基质刚度对L. monocytogenes感染内皮细胞的影响。此外，利用牵引力显微镜技术，可研究L. monocytogenes感染对宿主内皮细胞生物力学的影响。该方法可用于分析组织相关力学特性对贴壁细胞细菌感染的影响，这是理解细胞、其细胞外基质与致病菌之间生物力学相互作用的关键步骤。该方法还可广泛适用于其他多种涉及细胞生物力学及对基底刚度响应的研究，尤其适用于需要在单次实验中并行完成大量重复样本的研究场景。

人微血管内皮细胞 HMEC-1 对单核增生李斯特菌（Lm）感染的 ECM 刚度依赖性敏感性： 
按照方案中步骤 1所述方法，在多孔玻璃底板上构建了不同刚度且表面均包被 I 型胶原的 PA 水凝胶（见图 1）。如前所述26,27，通过原子力显微镜（AFM）测量确认水凝胶的实际刚度（见图 2）。以往研究表明，内皮细胞基底膜的局部顺应性可在 1 kPa（例如，脑组织）至 70 kPa（例如，主动脉）之间变化36,37,38,39,40。因此，我们选择检测 HMEC-1 细胞在以下刚度基质上的感染情况：0.6 kPa、3 kPa、20 kPa 和 70 kPa。针对每种水凝胶刚度，制备六个重复样本以评估结果的可重复性。
采用流式细胞术评估细胞外基质（ECM）刚度依赖性对HMEC-1细胞感染单核细胞增生李斯特菌（Lm）易感性的影响（见图3）。HMEC-1细胞感染了一种在内化后表达荧光标记的Lm菌株（JAT985）（actAp::mTagRFP），从而仅能检测到细胞内细菌（见图1L–1N）。JAT985菌株还缺失ActA蛋白，导致细菌无法在细胞间传播，因为ActA是形成肌动蛋白彗星尾并实现细菌扩散所必需的。感染后7–8小时，通过流式细胞术评估HMEC-1细胞的感染情况。为确保对单个细胞进行分析，首先利用前向散射与侧向散射图对细胞计数分布的主要部分设门，随后进行第二步设门以排除具有自发荧光的细胞（见图3A–3C）。如图3所示的初步结果表明，生长在较硬的70 kPa水凝胶上的HMEC-1细胞感染Lm的程度约为生长在较软的0.6 kPa水凝胶上细胞的两倍（见图3B–3D）。与生长在软基质上的细胞相比，生长在硬基质上的HMEC-1细胞对Lm感染的易感性增加可能归因于以下原因：1. Lm与HMEC-1细胞的黏附增强；2. Lm侵入HMEC-1细胞的能力增强；或3. 上述两种情况同时发生。为验证哪一假设成立，将HMEC-1细胞接种于软（3 kPa）和硬（70 kPa）水凝胶上，并用持续表达GFP的Lm进行感染（见图4A–4C）。感染后不久即固定样品，并使用抗体对胞外（黏附）细菌进行染色。通过定量显微镜分析发现，当宿主细胞生长在硬凝胶上时，黏附于HMEC-1细胞的细菌数量显著多于生长在软凝胶上的情况（见图4D）。与流式细胞术结果一致，当宿主细胞生长在硬凝胶上时，HMEC-1细胞内化的细菌数量也显著更多（见图4E）。然而，无论基底刚度如何，Lm侵入HMEC-1细胞的侵袭效率（内化细菌数/总细菌数）均相似（见图4F）。
单核增生李斯特菌感染的 HMEC-1 细胞的牵引力显微镜分析： 
单核增生李斯特菌（Lm）对 HMEC-1 细胞的感染可能改变感染宿主细胞的生物力学特性，包括细胞与细胞外基质（ECM）或彼此之间的黏附强度，从而影响其屏障完整性。我们试图通过牵引力显微镜技术32计算细胞-ECM 间的牵引力，并结合单层细胞应力显微镜技术41计算细胞内张力，以评估上述变化是否发生。图5展示了感染后不同时间点，生长在 20-kPa 水凝胶上的 HMEC-1 细胞的形变场、牵引应力场和细胞内张力场的分布图。图5A–5D为未感染的对照组 HMEC-1 细胞，而图5E–5H为以感染复数（MOI）300 细菌/细胞的剂量感染单核增生李斯特菌（Lm）的 HMEC-1 细胞。该初步研究表明，在 Lm 感染过程中，感染的 HMEC-1 细胞的细胞-ECM 牵引力及细胞内应力强度有所降低，而未感染的对照组细胞则未观察到此类变化。
基质刚度依赖性Lm在HMEC-1单层细胞上的播散： 
采用延时显微镜研究基质刚度对单核增生李斯特菌（Lm）通过HMEC-1单层细胞扩散的影响。随着Lm在单层细胞中扩散，细菌形成感染灶，其大小随时间呈函数关系增长（见 图6A 和 视频图 1 和 2）。通过在细菌周围绘制凸包（即包含该点集的最小凸多边形）来测量感染灶的面积42. 该领域尚无标准指标用于衡量效率 L. monocytogenes 通过宿主细胞单层进行的细胞间传播。为评估传播效率，一些研究者已对感染灶内的宿主细胞数量进行计数41，以及其他研究者已手动勾画出感染宿主细胞群体的边界43我们选择在细菌周围绘制一个凸多边形，因为这是一种自动化、一致性高且计算成本较低的方法，用于测量效率 L. monocytogenes 扩散。通过这种方式，我们发现接种于70 kPa水凝胶上的HMEC-1细胞感染灶面积较接种于3 kPa基质上的细胞略有减小（见 图6B 和 视频图 1 和 2）。为了确定感染灶的生长速率，通过取感染灶面积的平方根并除以π，将径向距离对时间作图。该数学变换假设感染灶的形状大致为圆形。44. 为测量焦点生长速度，需计算变化速率（即，测量了3 kPa和70 kPa基质上径向距离的斜率。该方法揭示出，接种于3 kPa基质上的HMEC-1细胞中感染灶的生长速度更快且呈单调增长。然而，在接种于70 kPa基质上的细胞中，感染灶在前200分钟内显著减慢，而在200至600分钟期间则略微减慢（见 图6C）。事实上，对更多数据的分析证实，在70 kPa基质中，感染灶的生长速度平均减慢了两倍，尤其是在前200分钟内（见 图6D).
<img alt="流式细胞术图谱、细胞分布分析；散点图显示荧光信号及基质刚度影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57361/57361fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：利用流式细胞术检测细胞外基质刚度依赖性对 HMEC-1 细胞受单核增生李斯特菌侵染易感性的影响。 HMEC-1 细胞被单核增生李斯特菌（JAT985 株）感染，并通过流式细胞术分析感染情况。A．该图显示来自单个孔的代表性 HMEC-1 细胞的侧向散射与前向散射散点图。通过设门排除碎片（左侧）以及细胞双联体或三联体（右侧），选择主要细胞群分布。B．该图显示接种于柔软（0.6 kPa）水凝胶上的 HMEC-1 细胞单个细胞的单核增生李斯特菌荧光强度对数分布直方图。C．该图显示接种于坚硬（70 kPa）水凝胶上的 HMEC-1 细胞单个细胞的单核增生李斯特菌荧光强度对数分布直方图。N = 4 - 6 次重复实验的直方图以不同颜色表示。未感染对照组细胞的直方图为紫色，用于定义感染状态的设门范围以红色标示。感染复数（MOI）为 100，感染后 8 小时进行检测。D．数据表示感染的 HMEC-1 细胞百分比随水凝胶刚度的变化（N = 5）。水平条形表示数据均值。P 值采用非参数 Wilcoxon 秩和检验计算。<a href="/files/ftp_upload/57361/57361fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="突出显示细胞结构的细胞培养显微图像；细胞生长动态研究。" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Video Figure 1"> 
视频 图1：在3-kPa基质上接种的HMEC-1细胞单层（相差图像）中细胞内单核细胞增生性李斯特菌（Lm，红色通道）的扩散过程。 细胞在含10%胎牛血清（FBS）和20 µg/mL庆大霉素的Leibovitz L-15培养基中培养，并置于37 ˚C恒温环境培养箱内进行成像。图像每5分钟采集一次。视频播放速度为15帧/秒。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_1.mov" target="_blank">请点击此处观看该视频。（右键可下载。）</a>
<img alt="细胞培养显微镜图像；荧光显微镜以粉红色突出显示细胞结构。" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="视频图 2"> 
视频 图2在70 kPa基质上接种的HMEC-1细胞单层（相差图像）中，单核细胞增生性李斯特菌（Lm，红色通道）在细胞内的扩散情况。 细胞在 Leibovitz's L-15 培养基（10% FBS， 20 µg/mL （庆大霉素）置于已平衡至环境室内的培养箱中 37 °C图像每5分钟采集一次。视频播放速度为每秒15帧。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_2.mov" target="_blank">请点击此处观看视频。（右键单击可下载。）</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>杨氏模量 (E, kPa)</td>
			<td>丙烯酰胺 % (来自 40% 储液)</td>
			<td>双丙烯酰胺 % (来自 2% 储液)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6</td>
			<td>3</td>
			<td>0.045</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>0.075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>0.075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>8</td>
			<td>0.195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70</td>
			<td>10</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 不同硬度的聚丙烯酰胺（PA）水凝胶的组成 在此表中，不同列分别列出了为达到特定刚度（杨氏模量，E）所需的40%丙烯酰胺贮存液和2%双丙烯酰胺贮存液的百分比。
<img alt="生物力学中的静力学平衡方程；应力张量与力平衡；研究示意图。" src="/files/ftp_upload/57361/57361supfig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="补充材料"> 
补充材料 1. 由计算得到的牵引应力计算细胞内张力。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Supplemental_Material_1.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

我们开发了一种基于多孔板格式的聚丙烯酰胺检测方法，用于研究细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响。该检测方法可与流式细胞术、免疫染色以及牵引力显微镜兼容，能够对细胞、其细胞外基质与致病菌之间的生物力学相互作用进行定量测量。

细胞外基质刚度是多种已知可影响细胞行为的环境力学刺激之一，……

本方法的总体目标是以高度定量的方式，表征细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响。该技术有助于回答宿主-病原体生物力学这一新兴领域中的关键科学问题，例如机械力在调节宿主细胞对细菌感染的易感性中发挥何种作用。该技术能够在同时筛选多种实验条件并自动化部分操作流程的同时，生成高分辨率的时间序列动态影像。为进行24孔板的玻璃活化，每个直径为13毫米的孔中加入500微升Tumalo氢氧化钠溶液，在室温下孵育1小时。弃去氢氧化钠溶液，用超纯水冲洗孔板一次。然后每孔加入500微升含2%三乙氧基硅烷的95%乙醇溶液，孵育5分钟。用清水冲洗各孔一次。然后向每孔中加入500微升0.5%戊二醛，将酶标板置于30分钟。用清水冲洗一次后，将酶标板在60摄氏度下敞盖干燥。为了制备可调节硬度的水凝胶，根据所需水凝胶的硬度，配制含有3%至10%的40%丙烯酰胺储备液以及0.6%至6%的2%双丙烯酰胺溶液的水溶液。随后加入水。对于每种硬度，溶液一不含微珠，而溶液二含有0.3%的0.1微米荧光微珠。将溶液一和溶液二通过真空处理15分钟，以去除会抑制聚合反应的氧气。随后，迅速向溶液一中加入0.43%的TEMED和0.6%的每毫升含10克过硫酸铵（APS）的储备液。将3.6微升该混合液加入24孔板每个孔的中央。立即使用12毫米圆形盖玻片覆盖各孔，并静置20分钟，使溶液充分聚合。轻轻将注射器针头在硬物表面敲击，使其尖端形成一个小钩，以方便移除盖玻片，然后用该针头挑起盖玻片。接着，向溶液二中加入0.43% TEMED和0.6%的10克/毫升过硫酸铵（APS）储备液。然后将2.4微升混合物滴加到12毫米圆形盖玻片上。将带有Solution Two液滴的圆形盖玻片置于第一层聚丙烯酰胺上，并用镊子轻轻向下按压，以确保第二层厚度最小。随后静置20分钟，使Solution Two充分聚合。向每个孔中加入 500 微升 50 毫摩尔 HEPES（pH 7.5），并使用注射器针头和镊子取出玻璃盖玻片。为对水凝胶进行灭菌，将其置于组织培养罩内，并暴露于紫外线下照射一小时。现在，配制含有 0.5%（质量/体积）Sulfo-SANPAH、1% DMSO 和 50 毫摩尔 HEPES（pH 7.5）的混合溶液。向水凝胶的上表面加入 200 微升溶液。然后迅速操作，用 302 纳米紫外光照射 10 分钟以激活水凝胶。使用 1 毫升 50 毫摩尔 HEPES（pH 7.5）溶液洗涤水凝胶两次，必要时可重复洗涤，以去除多余的交联剂。用200微升含0.25毫克/毫升大鼠尾胶原I和50毫摩尔HEPES的溶液对水凝胶进行蛋白包被。将水凝胶与胶原溶液在室温下孵育过夜。在将目标细胞接种到水凝胶上之前，加入1毫升培养基，并在37摄氏度下平衡1小时。接种人微血管内皮细胞时，根据文本方案培养并制备细胞悬液后，移除水凝胶中的培养基，然后向每个孔中加入一毫升细胞悬液。根据文本方案制备单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）过夜培养物后，将一毫升培养物转移至微量离心管中，在室温下以2,000 × g离心四分钟。使用组织培养级PBS将菌体沉淀洗涤两次后，用一毫升PBS重悬沉淀。通过将10或50微升细菌悬液与1毫升MCDB 131完全培养基混合，制备感染混合物，使感染复数（MOI）约为每个宿主细胞50个细菌或每个宿主细胞10个细菌。从24孔板的各孔中移除培养基，注意不要破坏水凝胶或细胞。用1毫升MCDB 131完全培养基洗涤细胞一次，然后向每孔加入1毫升细菌悬液。将盖子盖在培养板上，并用聚乙烯食品保鲜膜包裹以防止泄漏。在2,000 × g条件下离心培养板10分钟以同步化侵袭过程，随后将培养物置于37°C培养箱中孵育30分钟。使用MCDB 131完全培养基洗涤样品四次，然后将其重新放回组织培养孵箱中。再孵育30分钟后，将培养基更换为添加了20微克/毫升庆大霉素的MCDB 131完全培养基。为进行流式细胞术分析，在感染后8小时，移除24孔板各孔中的培养基，并使用组织培养用PBS洗涤孔板一次。移除PBS后，向每孔加入200微升胰蛋白酶-EDTA-胶原酶混合液。将培养皿放入组织培养孵育箱中孵育10分钟，以确保细胞完全脱落。轻轻吹打每孔八次后，加入200微升完全培养基以中和胰蛋白酶。将每孔400微升的细胞悬液转移至带有35微米细胞筛网帽的5毫升聚苯乙烯管中。通过流式细胞术分析样品。根据正文方案，将HMEC-1细胞接种于Pa水凝胶上并用庆大霉素处理后，将培养板孵育5小时，以使ActA启动子激活并驱动mTagRFP开放阅读框的表达。感染后4小时，将1微升浓度为1毫克/毫升的Hoechst染料与1毫升L-15完全培养基混合，加入每孔中以染色细胞核。细胞孵育10分钟后，将培养基更换为1毫升添加了20微克/毫升庆大霉素的L-15完全培养基。使用自动对焦功能，每隔5分钟对多个位置进行成像，以监测单核细胞增生李斯特菌（LM）在接种于不同硬度水凝胶上的HMEC-1单层细胞中的扩散情况。如本图所示，采用原子力显微镜（AFM）测量，以确认按照本视频中所述方案制备的Pa水凝胶的确切硬度。在此实验中，将表达荧光标记的单核细胞增生性李斯特菌（LM）菌株感染至不同硬度基质上的HMEC-1细胞，该荧光标记仅在细菌内化后表达，因而可特异性检测细胞内细菌。首先根据前向散射与侧向散射图对细胞进行设门，随后通过第二步设门排除具有自发荧光的细胞。流式细胞术分析结果显示，在70千帕的较硬水凝胶上，LM感染水平约为0.6千帕软凝胶上的两倍。为了检测单核细胞增生李斯特菌（LM）在HMEC-1细胞上黏附能力的增强是否导致其对HMEC-1细胞的侵袭增加，或两者兼有，从而解释感染后短时间内感染易感性升高的原因，在用组成型表达GFP的LM感染后，对HMEC-1细胞进行固定，并使用抗体对黏附的细菌进行染色。如图所示，当宿主细胞生长于较硬的凝胶上时，黏附于HMEC-1细胞的细菌数量显著多于生长于较软凝胶上的情况。与流式细胞术数据一致，当宿主细胞位于较硬凝胶上时，HMEC-1细胞内化的细菌数量也显著多于位于较软凝胶上的情况。一旦掌握，该检测方法可在约三天内完成，因为步骤之间需要较长的孵育时间。在进行此操作时，必须尽可能保持无菌，以确保水凝胶和宿主细胞不被污染。在完成该操作后，还可结合其他方法（如原子力显微镜）来回答一些问题，例如感染后宿主细胞的刚度如何变化，以及这种效应是否依赖于基质的刚度。该技术问世后，为机械生物学领域的研究人员探索宿主细胞与病原体之间生物力学相互作用提供了途径，可采用不同的宿主细胞（如上皮细胞）和不同的细菌病原体（如立克次体 Rickettsia parkeri）进行研究。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在多孔板上制备刚度可调的水凝胶，以及如何开展感染实验。请务必注意，操作病原性细菌可能存在生物安全风险。因此，在进行此操作时，应始终采取预防措施，例如在入口处与病原体之间设置屏障，并防止气溶胶的产生。

a-multi-well-format-polyacrylamide-based-assay-for-studying-effect

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

基于聚丙烯酰胺的多井格式实验研究细胞外基质硬度对黏附细胞细菌感染的影响

基底硬度对细胞功能的影响可被模拟 体外...

利用基于丙烯酰胺的水凝胶研究基质刚度对细胞功能的影响

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一种研究细胞外基质刚度对细菌感染影响的检测方法

本视频展示了用于评估细胞外基质刚度依赖性的定量延时显微镜技术 单核细胞增生李斯特菌...

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在感染过程中，一个关键步骤是病原体与宿主细胞之间的黏附。大多数情况下，这种黏附过程发生在流动液体所产生的机械应力环境中。本文介绍一种将剪切应力作为重要参数用于研究细菌黏附的技术。...

在细菌黏附研究中引入剪切应力

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一种用于监测T6SS介导的细菌竞争的可视化检测方法

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一种基于多孔板格式聚丙烯酰胺的检测方法，用于研究细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响

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