一种基于多孔板格式聚丙烯酰胺的检测方法，用于研究细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响

本方法的总体目标是以高度定量的方式，表征细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响。该技术有助于回答宿主-病原体生物力学这一新兴领域中的关键科学问题，例如机械力在调节宿主细胞对细菌感染的易感性中发挥何种作用。该技术能够在同时筛选多种实验条件并自动化部分操作流程的同时，生成高分辨率的时间序列动态影像。

为进行24孔板的玻璃活化，每个直径为13毫米的孔中加入500微升Tumalo氢氧化钠溶液，在室温下孵育1小时。弃去氢氧化钠溶液，用超纯水冲洗孔板一次。然后每孔加入500微升含2%三乙氧基硅烷的95%乙醇溶液，孵育5分钟。

用清水冲洗各孔一次。然后向每孔中加入500微升0.5%戊二醛，将酶标板置于30分钟。用清水冲洗一次后，将酶标板在60摄氏度下敞盖干燥。

为了制备可调节硬度的水凝胶，根据所需水凝胶的硬度，配制含有3%至10%的40%丙烯酰胺储备液以及0.6%至6%的2%双丙烯酰胺溶液的水溶液。随后加入水。对于每种硬度，溶液一不含微珠，而溶液二含有0.3%的0.1微米荧光微珠。

将溶液一和溶液二通过真空处理15分钟，以去除会抑制聚合反应的氧气。随后，迅速向溶液一中加入0.43%的TEMED和0.6%的每毫升含10克过硫酸铵（APS）的储备液。将3.6微升该混合液加入24孔板每个孔的中央。

立即使用12毫米圆形盖玻片覆盖各孔，并静置20分钟，使溶液充分聚合。轻轻将注射器针头在硬物表面敲击，使其尖端形成一个小钩，以方便移除盖玻片，然后用该针头挑起盖玻片。接着，向溶液二中加入0.43% TEMED和0.6%的10克/毫升过硫酸铵（APS）储备液。

然后将2.4微升混合物滴加到12毫米圆形盖玻片上。将带有Solution Two液滴的圆形盖玻片置于第一层聚丙烯酰胺上，并用镊子轻轻向下按压，以确保第二层厚度最小。随后静置20分钟，使Solution Two充分聚合。

向每个孔中加入 500 微升 50 毫摩尔 HEPES（pH 7.5），并使用注射器针头和镊子取出玻璃盖玻片。为对水凝胶进行灭菌，将其置于组织培养罩内，并暴露于紫外线下照射一小时。现在，配制含有 0.5%（质量/体积）Sulfo-SANPAH、1% DMSO 和 50 毫摩尔 HEPES（pH 7.5）的混合溶液。

向水凝胶的上表面加入 200 微升溶液。然后迅速操作，用 302 纳米紫外光照射 10 分钟以激活水凝胶。使用 1 毫升 50 毫摩尔 HEPES（pH 7.5）溶液洗涤水凝胶两次，必要时可重复洗涤，以去除多余的交联剂。

用200微升含0.25毫克/毫升大鼠尾胶原I和50毫摩尔HEPES的溶液对水凝胶进行蛋白包被。将水凝胶与胶原溶液在室温下孵育过夜。在将目标细胞接种到水凝胶上之前，加入1毫升培养基，并在37摄氏度下平衡1小时。

接种人微血管内皮细胞时，根据文本方案培养并制备细胞悬液后，移除水凝胶中的培养基，然后向每个孔中加入一毫升细胞悬液。根据文本方案制备单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）过夜培养物后，将一毫升培养物转移至微量离心管中，在室温下以2,000 × g离心四分钟。使用组织培养级PBS将菌体沉淀洗涤两次后，用一毫升PBS重悬沉淀。

通过将10或50微升细菌悬液与1毫升MCDB 131完全培养基混合，制备感染混合物，使感染复数（MOI）约为每个宿主细胞50个细菌或每个宿主细胞10个细菌。从24孔板的各孔中移除培养基，注意不要破坏水凝胶或细胞。用1毫升MCDB 131完全培养基洗涤细胞一次，然后向每孔加入1毫升细菌悬液。

将盖子盖在培养板上，并用聚乙烯食品保鲜膜包裹以防止泄漏。在2,000 × g条件下离心培养板10分钟以同步化侵袭过程，随后将培养物置于37°C培养箱中孵育30分钟。使用MCDB 131完全培养基洗涤样品四次，然后将其重新放回组织培养孵箱中。

再孵育30分钟后，将培养基更换为添加了20微克/毫升庆大霉素的MCDB 131完全培养基。为进行流式细胞术分析，在感染后8小时，移除24孔板各孔中的培养基，并使用组织培养用PBS洗涤孔板一次。移除PBS后，向每孔加入200微升胰蛋白酶-EDTA-胶原酶混合液。

将培养皿放入组织培养孵育箱中孵育10分钟，以确保细胞完全脱落。轻轻吹打每孔八次后，加入200微升完全培养基以中和胰蛋白酶。将每孔400微升的细胞悬液转移至带有35微米细胞筛网帽的5毫升聚苯乙烯管中。

通过流式细胞术分析样品。根据正文方案，将HMEC-1细胞接种于Pa水凝胶上并用庆大霉素处理后，将培养板孵育5小时，以使ActA启动子激活并驱动mTagRFP开放阅读框的表达。感染后4小时，将1微升浓度为1毫克/毫升的Hoechst染料与1毫升L-15完全培养基混合，加入每孔中以染色细胞核。

细胞孵育10分钟后，将培养基更换为1毫升添加了20微克/毫升庆大霉素的L-15完全培养基。使用自动对焦功能，每隔5分钟对多个位置进行成像，以监测单核细胞增生李斯特菌（LM）在接种于不同硬度水凝胶上的HMEC-1单层细胞中的扩散情况。如本图所示，采用原子力显微镜（AFM）测量，以确认按照本视频中所述方案制备的Pa水凝胶的确切硬度。

在此实验中，将表达荧光标记的单核细胞增生性李斯特菌（LM）菌株感染至不同硬度基质上的HMEC-1细胞，该荧光标记仅在细菌内化后表达，因而可特异性检测细胞内细菌。首先根据前向散射与侧向散射图对细胞进行设门，随后通过第二步设门排除具有自发荧光的细胞。流式细胞术分析结果显示，在70千帕的较硬水凝胶上，LM感染水平约为0.6千帕软凝胶上的两倍。

为了检测单核细胞增生李斯特菌（LM）在HMEC-1细胞上黏附能力的增强是否导致其对HMEC-1细胞的侵袭增加，或两者兼有，从而解释感染后短时间内感染易感性升高的原因，在用组成型表达GFP的LM感染后，对HMEC-1细胞进行固定，并使用抗体对黏附的细菌进行染色。如图所示，当宿主细胞生长于较硬的凝胶上时，黏附于HMEC-1细胞的细菌数量显著多于生长于较软凝胶上的情况。与流式细胞术数据一致，当宿主细胞位于较硬凝胶上时，HMEC-1细胞内化的细菌数量也显著多于位于较软凝胶上的情况。

一旦掌握，该检测方法可在约三天内完成，因为步骤之间需要较长的孵育时间。在进行此操作时，必须尽可能保持无菌，以确保水凝胶和宿主细胞不被污染。在完成该操作后，还可结合其他方法（如原子力显微镜）来回答一些问题，例如感染后宿主细胞的刚度如何变化，以及这种效应是否依赖于基质的刚度。

该技术问世后，为机械生物学领域的研究人员探索宿主细胞与病原体之间生物力学相互作用提供了途径，可采用不同的宿主细胞（如上皮细胞）和不同的细菌病原体（如立克次体 Rickettsia parkeri）进行研究。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在多孔板上制备刚度可调的水凝胶，以及如何开展感染实验。请务必注意，操作病原性细菌可能存在生物安全风险。

因此，在进行此操作时，应始终采取预防措施，例如在入口处与病原体之间设置屏障，并防止气溶胶的产生。