Summary
كوجا et al. اكتشف أن الفسفرة-وضع أجسام مضادة محددة ضد جيردين بروتين الأكتين ملزمة فوسفوريلاتيد في تيروزين 1798 (pY1798) يمكن استخدامها لتسمية الخلايا خصل (TCs). يسمح هذا البروتوكول التصور قوية من اللجان الفنية باستخدام صبغة إيمونوفلوريسسينت من التعويم الحر صائم كريوسيكشنز مع الأجسام المضادة pY1798.
Abstract
جيردين بروتين الأكتين ملزم هو بروتين سيتوسوليك ما مطلوب الأكتين يعيد البناء لتحريك الهجرة الخلية في الأنسجة المختلفة. جيردين هو فوسفوريلاتيد كل من مستقبلات وغير مستقبلات تيروسين مؤنزم في تيروزين 1798. Omori et al. تطوير الموقع والفسفره الخاصة بوضع أجسام مضادة ضد جيردين البشرية في تيروزين-1798 (pY1798)، التي تلزم على وجه التحديد إلى 1798 تيروزين فوسفوريلاتيد ولكن ليس على أونفوسفوريلاتيد تيروزين-1798. pY1798 الأجسام المضادة قد استخدمت لتسمية على وجه التحديد خلايا خصل (TCs) الموجودة في أنسجة الثدييات في الجهاز الهضمي، ولكن وظيفة هذه الخلايا غير واضحة. ويسمح هذا البروتوكول التصور قوية من اللجان الفنية في صائم استخدام الأجسام المضادة pY1798 والفلورة. إلى ضمان التصور TC ناجحة وبسيطة، يشتمل هذا البروتوكول على تقنيات نسيجية هما: إنتاج كريوسيكشنز التعويم الحر من أنسجة مليئة بالجيلاتين صائم، واسترجاع مستضد درجات الحرارة المنخفضة عند 50 درجة مئوية حاء 3 ملء الصائم مع الجيلاتين يحافظ على شكل مقاطع التعويم الحر طوال فترة الإجراءات المصبوغة، بينما يضمن استرجاع مستضد درجات الحرارة المنخفضة إشارات قوية من نتائج الاستخدام الناجح لهذا البروتوكول في تلطيخ pY1798 من TCs الموزعة من الزوائد تلميح إلى اللجان الفنية. سرداب. TCs الملون من سوما على شكل التخزين المؤقت، وإشارات الفلورسنت تتكثف في تلميح لومينال، الذي يتوافق مع بارزة 'خصل'. تلوين فالويدين كولوكاليزيد مع TCs pY1798 إيجابية على الحدود فرشاة سميكة، ويتوافق مع كتلة روتليت تمتد من خصل TC. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة TCs في عينات خزعة البشرية مع المناظير الجهاز الهضمي. وعلاوة على ذلك، TCs مؤخرا أفيد أن تتراكم بعد الإصابة بالطفيليات في الفئران، مما يوحي بأن هذا البروتوكول قد يكون لها تطبيقات لتشخيص العدوى بالطفيليات في الأمعاء البشرية.
Introduction
الخلايا خصل (TCs) عناصر متفرقة طفيفة في ابيثيليا المعوية التي تتميز بها تافتس قمي واتفاقات على شكل التخزين المؤقت1. على الرغم من أن اللجان الفنية وصفت أولاً في عام 19562، يظل من غير الواضح، جزئيا بسبب الافتقار إلى موثوقية TC علامات الدالة TC.
انوموتو et al. أولاً يتميز البروتين ملزمة أكتين جيردين3، التي يعبر عنها في الجهاز العصبي، وكذلك في الأنسجة غير العصبية مثل الأوعية الدموية، صمامات القلب، والاوتار، والهيكل العظمى والعضلات4. عرض الفئران مع الاجتثاث الوراثية من جيردين تأخر النمو والدماغ متعددة الشذوذ4،،من56. وفي الوقت نفسه، طفرة الخسارة من الدالة في جيردين البشرية يرتبط مع الاكسجة التدريجي، والتخلف العقلي الشديد، وبداية ظهور نوبات الصرع7.
في عام 2011، حدد لين et al. الفسفرة دينامية من جيردين في تيروزين 1798 توسط تيروسين مؤنزم مثل EGFR و Src8. كما أظهرت أن جيردين فوسفوريلاتيد مطلوب لإعادة عرض أكتين لتحريك الخلية الهجرة8. Omori et al. تطوير الموقع--والفسفره الخاصة بمركز أضداد جيردين البشرية فوسفوريلاتيد في تيروزين 1798 (الأجسام المضادة pY1798) بعد البروتوكول للانتقال إلى، والتحقق من صحتها الأضداد استخدام الطفرات موقع الموجه من التعبير ناقلات تحمل كامل طول جيردين9،10. في عام 2017، كوجا et al. وذكرت أن pY1798 تسميات TCs مع خصوصية عالية وحساسية عالية1. وعرضت الأجسام المضادة pY1798 لتكون متفوقة على علامات TC السابق استناداً إلى خصائص المصبوغة الممتازة التي كشفت شكل خلية كاملة، بما في ذلك السمة 'خصل' في تلميح لومينال، بعد دور البيولوجية جيردين وجيردين والرمات في TC وظلت وظيفة غير واضحة1.
الأسلوب الموصوفة في هذه الدراسة تشمل الفلورة تلطيخ، تقنية النسيجي بمناسبة بروتين محددة في الأنسجة استخدام جسم الأولية ضد بروتين المستهدف وجسم ثانوي مترافق fluorescence ضد المرحلة الابتدائية الأجسام المضادة. والغرض من هذا الأسلوب للسماح للباحثين بمحدودية الخبرة النسيجي للحصول على صور ذات جودة عالية TC. هذا البروتوكول يستخدم التعويم الحر كريوسيكشنز التي تجنب الحاجة إلى كريوسيكشنز محمولة على الشريحة، أو البارافين القسم. ولكن المقاطع التعويم الحر هشا بسبب غياب الدعم من شريحة زجاجية وسمك الفرع يمكن أن يقلل من نفاذية جسم. يتضمن هذا البروتوكول بين النهجين أن التغلب على هذه القضايا: 1) ملء التجويف صائم كامل مع الجيلاتين للحفاظ على مورفولوجية أقسام التعويم الحر طوال الإجراءات المصبوغة، و 2) استخدام استرجاع مستضد درجات الحرارة المنخفضة إلى تكثيف الإشارات pY1798.
Protocol
وقد أقر جميع الأساليب الموصوفة هنا بالعناية بالحيوان واستخدام اللجنة لمعهد "البحوث الإنمائية" ومركز ايتشى لخدمة الإنسان (رقم الطلب: M-03).
1-الأعمال التحضيرية
- إعداد 10 لتر من المحلول الملحي الفوسفات مخزنة (PBS): 32.27 ز غ2هبو4·12H2س، ز 4.5 من نة2بو4·2H2س، ز 80.0 من كلوريد الصوديوم تضاف إلى الماء عالي النقاوة إلى وحدة تخزين نهائي لحل "تخزين ل" 10 في درجة حرارة الغرفة (RT).
- إعداد 200 مل مل برنامج تلفزيوني-t: 200 من برنامج تلفزيوني من الخطوة 1، 1 مع 100 ميليلتر polyoxyethylene(10) أوكتيلفينيل خماسي البروم ثنائي الفينيل بتركيز 0.05% (vol:vol) نهائي. مخزن في الرايت
- أثناء ارتداء القفازات وحماية العين، إعداد 50 مل سكروز 15% في محلول فورمالين 10% مخزنة محايدة: مخزنة ز 7.5 السكروز إضافة إلى 10% فورمالين محايدة الحل (جدول المواد) لوحدة تخزين نهائي من 50 مل. مخزن في الرايت
تنبيه: الاستنشاق و/أو الجلد/العين الاتصال مع والفورمالديهايد في محلول فورمالين 10% مخزنة محايدة يمكن أن تكون خطرة. التعامل معها بحذر. - إعداد 1.5 مل من 200 وحدة/مل محلول المتقارنة صبغة الفلورسنت فالويدين الأسهم: صبغة الفلورسنت فالويدين المتقارن (300 وحدة في قنينة 1، والمواد الصلبة المجففة بالتبريد، وموجات الإثارة والانبعاثات: 581 نانومتر و 609 شمال البحر الأبيض المتوسط، على التوالي) علقت في 1.5 مل من والميثانول. حل مخزن في الظلام في-20 درجة مئوية.
- إعداد 5 ملغ/مل 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي، والأسهم هيدروكلوريد (DAPI) الحل: 10 ملغ DAPI في 2 مل N، N-dimethylformamide (DMF). حل مخزن في الظلام في-20 درجة مئوية.
- إعداد 5% البقري ألبومين المصل (BSA) في برنامج تلفزيوني: 0.5 غ من جيش صرب البوسنة، 10 مل من برنامج تلفزيوني. مخزن في 4 درجات مئوية.
- إزالة تلميح مشطوف إبرة مستقيمة 18-قياس استخدام القراص، وقرصة نهاية نبيد مع بينكهير في اتجاه الطول لتسمح للسائل بالتدفق من خلال التجويف إبرة (1A الشكل1).
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
2-تشريح الحيوانات وعزل صائم
- تثبيت التروية بالماوس
- ارتداء القفازات والعمل في منطقة جيدة التهوية.
- تحضير كوب زجاج 100 مل، 10% مخزنة الحل الفورمالين محايدة، الأدوات الجراحية (مقص، ملقط)، علبة معدنية، والنايلون 6-0 قطع خيوط، إبرة مستقيمة 18-قياس إعداد كما هو الحال في 1.7، 22-قياس إبرة مجنح، حقنه 20 مل.
- تحميل 20 مل من محلول فورمالين 10% مخزنة محايدة من الكأس الزجاج في محقنة 20 مل، وإرفاق الإبرة مجنحة عيار 22 إلى المنفذ.
- إعداد الجيلاتين السائل بإضافة 1 غ مسحوق الجيلاتين إلى 20 مل من برنامج تلفزيوني (الجيلاتين 5% النهائية) في أنبوب 50 مل أجهزة الطرد مركزي. بعد نقع في RT لمدة 15 دقيقة، احتضان عند 50 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 15 دقيقة دون أن تهتز.
- باختصار من دوامة، واحتضان عند 50 درجة مئوية لآخر 15 دقيقة لإذابة الجيلاتين تماما. اترك الأنبوب في الرايت حتى الاستخدام.
- Euthanize ماوس الكبار بخلع عنق الرحم.
- ضع الماوس من الخطوة 2.1.6 في علبة معدنية وجعل شق صغير في الجلد من خلال غضروف انسيفورم باستخدام الأدوات الجراحية.
- قم بتوسيع شق بكلتا يديه لفضح في منطقتي الصدر والبطن.
- فتح الصفاق لفضح الحجاب الحاجز ومن ثم فتح الحجاب الحاجز في كلا الجانبين.
- قص القفص الصدري على طول خطوط الابطي الأمامي على كلا الجانبين، ثم إزالة الجدار الصدري بالقطع في اتجاه عرضية في الموضع للغدة الصعترية لفضح القلب.
- إجراء شق صغير في صوان الاذين الأيمن نزيف الدم وإدراج إبرة مجنحة 22-قياس في قمة البطين الأيسر. دفع المكبس نتخلل الأنسجة بمحلول فورمالين 10% مخزنة محايدة.
- بعد الكشف عن الأجهزة في الحوض، قطع نهاية المستقيم من الشرج، وفصل الأمعاء من الجسم بقطع في مساريق.
- لعزل الصائم، قطع الأمعاء في 4 سم من جانب الشرج التجويف المعدي. تجاهل في النصف الشرج من الأمعاء المتبقية.
- مقطع صائم نصفين لتسهيل عملية التنظيف. تحميل 20 مل 10% مخزنة الحل الفورمالين محايدة في محقن 20 مل، وإرفاق إبرة مستقيمة 18-قياس إعدادها في الخطوة 1، 7 إلى المنفذ.
- حقن 10% مخزنة محلول الفورمالين محايدة واحدة من نهاية صائم المقطوعة لطرد محتويات الأمعاء وإصلاح سطح التجويف القناة الهضمية (1A الشكل2).
- يغسل تجويف القناة الهضمية ببث برنامج تلفزيوني كما هو موضح في الخطوة 2.1.15.
- مسح الجيلاتين السائل في التجويف القناة الهضمية كما هو موضح في الخطوة 2.1.15 ليحل محل برنامج تلفزيوني مع الجيلاتين السائل.
- إغلاق واحدة من نهاية صائم المقطوعة بخياطة عملية ربط استخدام نايلون 6-0 قص خياطة وملء الصائم مع الجيلاتين السائل وإغلاق الطرف الآخر بربط خياطة (الشكل 1A3).
- إضافة عقده خياطة الأربعة لتناسب مقطع على شكل نقانق صائم للاكتئاب جزء كريومولد (1A الشكل4).
ملاحظة: كريومولدس مع 20 مم × 25 مم × 5 مم الاكتئاب القسم، مقطع مثل السجق صائم ~ 20 مم الأفضل. - نقع في الأنسجة في 50 مل من محلول السكروز 15% في محلول فورمالين 10% مخزنة محايدة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: هذه الخطوات التي تكفل كريوبروتيكشن قبل التثبيت السكروز والبروتين من الفورمالين من الجيلاتين والأنسجة. لا تذوب الجيلاتين مهيلم الفورمالين في الرايت، حين يذوب الجيلاتين مهيلم غير ثابت عند 4 درجة مئوية في الرايت
3-انجذاب تجميد أنسجة مليئة بالجيلاتين صائم
- بالقطع الصائم في عقده خياطة، يتم الحصول على ثلاث قطع صائم مثل السجق مع طرفي متصلة (1A الشكل4). قم بمحاذاة القطع مثل السجق في كريومولد لإضافة تضمين المجمع للتحضير لعينات الأنسجة المجمدة.
- تجميد الأداة كريومولد في إيسوبينتاني التبريد بالنتروجين السائل. تخزين كريومولدس في-80 درجة مئوية
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
4-الفلورة خصل الخلايا استخدام التعويم الحر كريوسيكشنز
- كريوسيكتيونينج
- تعيين كلا من درجة حرارة غرفة كريوستات (CT) وحرارة الكائن (OT)-22 درجة مئوية. كتلة مكان الأنسجة المجمدة في كريومولد في قاعة كريوستات لمدة 15 دقيقة على الأقل.
- أضف 3 مل من برنامج تلفزيوني إلى طبق ثقافة 35 ملم.
- إزالة كتلة الأنسجة المجمدة من كريومولد وخفض إلى النصف مع شفرة حلاقة لفضح المقطع العرضي من صائم الكتلة. جبل أحد نصف كتلة على تشاك (محول كريوستات) على الفرع أن الطائرة قطع بشفرة حلاقة.
- قسم صائم مملوءة بالجيلاتين إلى 30 ميكرومتر سميكة أقسام. استخدام المجمدة الملقط بلطف نقل المقاطع إلى الطبق الثقافة 35 ملم إعدادها في الخطوة 4.1.2 (الشكل 2B، أليس).
- تطبيق الأجسام الأولية
- تغسل الأجزاء التعويم الحر في الطبق الثقافة 35 ملم 3 مرات لمدة كل 5 دقائق مع 3 مل برنامج تلفزيوني-T مع الهز الخفيف على شاكر المعاملة بالمثل (ما يقرب من 36 مرة/دقيقة).
- إعداد حل استرجاع مستضد: 0.3 مل من مستضد استرجاع الحل التركيز (جدول المواد) في 2.7 مل من الماء عالي النقاوة. أضف 3 مل من محلول استرجاع مستضد للطبق الثقافة 35 ملم تحتوي على مقاطع التعويم الحر.
- إغلاق الغطاء وإغلاق الفجوة بين الطبق والغطاء بشريط من الأشرطة الفينيل، واحتضان عند 50 درجة مئوية في حاضنة تهجين أجل ح 3 دون المصافحة.
- إزالة الطبق من الحاضنة وباردة على RT لمدة 20 دقيقة. بعد إزالة الشريط الفينيل، تغسل الأجزاء 3 مرات لمدة 5 دقائق كل مع 3 مل برنامج تلفزيوني-T والهز الخفيف.
- نضح PBS-T وإضافة 5 قطرات محلول حظر (جدول المواد) على الأقسام. تبني على RT لمدة 5 دقائق مع الهز الخفيف.
- إعداد الحل جسم الأولية: 495 ميليلتر من جيش صرب البوسنة 5% في برنامج تلفزيوني مع 5 ميليلتر Y1798 والرمات جيردين (pY1798) الأجسام المضادة (جدول المواد). إضافة 500 ميليلتر من محلول جسم الأولية على المقاطع (حل حظر لا تحتاج لإزالتها).
- ضع الطبق في غرفة حضانة هوميديفيد واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الهز الخفيف.
ملاحظة: يمكن تمديدها لمدة ثلاث ليال الحضانة بين عشية وضحاها.
- تطبيق للأجسام المضادة الثانوية
- تغسل الأجزاء 3 مرات لمدة 5 دقائق كل مل 3 من برنامج تلفزيوني-T مع الهز الخفيف.
- إعداد المخفف DAPI الأسهم الحل: 2 ميليلتر DAPI الأسهم الحل (الخطوة 1.5)، 998 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
- جعل الحل جسم الثانوي: 476 ميليلتر من جيش صرب البوسنة 5% في برنامج تلفزيوني، ميليلتر 10.5 المخفف DAPI الحل، ميليلتر 12.5 صبغة الفلورسنت فالويدين حل الأسهم المتقارنة، 1 ميليلتر من الماعز الأرنب المضادة مفتش-نيون صبغ المتقارن (الطول الموجي: الإثارة 496 شمال البحر الأبيض المتوسط، وانبعاث 520 nm).
- بعد يسفط في برنامج تلفزيوني-T، تطبيق الحل جسم الثانوية، واحتضان في غرفة حضانة محمية من الضوء على RT لمدة 30 دقيقة مع الهز الخفيف.
- تغسل الأجزاء 3 مرات لمدة 5 دقائق كل مع 3 مل برنامج تلفزيوني-T والهز الخفيف.
- بعد الغسيل النهائي، إزالة برنامج تلفزيوني-T واستبدال مع 3 مل من برنامج تلفزيوني تفتقر إلى polyoxyethylene(10) أوكتيلفينيل خماسي البروم ثنائي الفينيل. نقل الطبق إلى مجهر مجسم.
- مكان 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني في معالجة تجميعية في وسط الزجاج الأبيض المغلفة بماس الشريحة ونقل مقطع واحد صائم من الطبق إلى الحبرية استخدام تلميح بيبيت P200.
- بعد ضبط محاذاة قسم تحت المجهر مجسمة، نضح كل برنامج تلفزيوني المتبقية المحيطة بالقسم.
- إضافة 20 ميليلتر لوسائل الإعلام تصاعد مائي ومكان ساترة 20 x 20 مم فوق وسائط الإعلام.
- فورا ختم حواف ساترة مع الوسائط المستندة إلى زيلين نفط المتصاعدة. ضع الشريحة على كيفية خشبية والسماح لوسائل الإعلام المتزايدة على أساس زيلين نفط على ترسيخ على RT ح 2-3.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. بعد يتصلب الوسائط المستندة إلى زيلين نفط متزايدة، يمكن تخزين الشرائح لمدة 2-3 أسابيع في مربع شريحة محمية من الضوء في الرايت
5-[كنفوكل] مجهرية
- وضع النفط الغمر على الهدف X 63 مجهر [كنفوكل]. رفض ساترة--الشريحة ومكان الشريحة على المسرح.
- رقمنة الصور TC المكتسبة في الليزر أطوال موجية 405 و 488 و 555 نانومتر، وحفظ الصور في تنسيق tiff (.tiff).
ملاحظة: اختر مجموعة تصفية كشف المناسب للأصباغ الفلورية (أي، الإثارة/الانبعاثات ماكسيما: 358/461 شمال البحر الأبيض المتوسط، 490/525، و 590/617).
Representative Results
جيلاتين-شغل صائم
ويرد إجراء نموذجي لملء صائم الماوس مع الجيلاتين (الشكل 1A)، كما فوائد الجيلاتين-ملء (الشكل 1B). بإيجاز، تمت إزالة تلميح مشطوف إبرة عيار 18 على التوالي للحماية من اختراق جدار الأمعاء (1A الشكل1). ملء الجيلاتين تم تحقيقه باستخدام 10% مخزنة الحل الفورمالين محايدة حقنه واحدة من نهاية لمقطع صائم المقطوعة لمسح الأمعاء وإصلاح سطح التجويف القناة الهضمية (الشكل 1 ألف2) قبل الملء مع الجيلاتين السائل ( الشكل 1A3). القطع مثل السجق الناتج عن ذلك (الشكل 1A4) المضمنة، والمجمدة، والعرض مقطوع إلى شرائح سميكة ميكرومتر 30 في كريوستات. نظراً لغياب الجيلاتين ملء، أقسام jejunal تميل إلى شبك، يسمح الزوائد سوينغ إلى الخلف (الشكل 1B، الأيسر). ملء الجيلاتين يحافظ على القرص جولة-شكل المقاطع ويحافظ تستقيم لتحديد المواقع من الزوائد (الشكل 1B، أليس). الصور تبين بوضوح فائدة يتيحها الجيلاتين ملء في الحفاظ على مورفولوجية أقسام التعويم الحر صائم.
تصوير ناجحة من الخلايا المعوية خصل
يمكن تطبيق pY1798 الأجسام المضادة لتقنيات إيمونوستينينج المتغيرة، بما في ذلك النشاف دوت النشاف الغربية، وتلطيخ الباب البارافين، كريوسيكشن محمولة على ذوبان الجليد تلطيخ أو التعويم الحر كريوسيكشن تلطيخ1،9. في هذا البروتوكول، ركزنا على كريوسيكشنز التعويم الحر لتلطيخ الأسفار من اللجان الفنية في صائم الماوس باستخدام الأجسام المضادة pY1798، وفالويدين، و DAPI تلطيخ لإظهار الخصائص الهيكلية للجان الفنية1. وبصفة عامة، TCs تنتشر بمعدل حوالي واحد TC/100 الخلايا الظهارية من الزوائد تلميح إلى سرداب1. وتظهر النتائج الممثلة أن pY1798 يحدد تكاثر TCs كاملة، بما في ذلك الغشاء، السيتوبلازم سوما على شكل التخزين المؤقت، ونصيحة لومينال ملطخة بشدة، حيث يناظر التكثيف إشارة قوية بروز 'خصل' من TC1 (2A الرقم-2B). وفي الوقت نفسه، فالويدين فالوتوكسين، عائلة من هيبتابيبتيديس تربين سامة من فطر الامانيت phalloides، وقد ألفه عالية أكتين الخيطية (F-أكتين)، التي موجودة في زغيبات التي تشكل الحدود فرشاة المعوية 11-فالويدين تكاثر ومكانه علامات الحدود فرشاة سميكة يتوافق مع كتلة من rootlets تمتد من خصل1. وهكذا، التعريب المشارك متسقة من إشارات pY1798 (على شكل التخزين المؤقت سوما، إشارة التكثيف في تلميح لومينال) مع الحدود سميكة بارزة إيجابية فالويدين الفرشاة يوضح أن هذا البروتوكول يحدد بنجاح اللجان الفنية بغض النظر عن إذا فتقع على زغابة (الشكل 2A) أو في سرداب (الشكل 2B).
استرجاع مستضد درجات الحرارة المنخفضة فعالة لتلطيخ أبواب التعويم الحر
استرجاع مستضد المستندة إلى الحرارة في 95-99 درجة مئوية يستخدم على نطاق واسع لتحليل مقاطع البارافين وكريوسيكشنز محمولة على الشريحة. ومع ذلك، تطبيق هذا النهج على أبواب التعويم الحر دون التسبب في أضرار صعب لأن هذه الأقسام عموما أكثر هشاشة من أقسام محمولة على الشريحة التي يدعمها الشريحة12. منذ استرجاع مستضد درجة حرارة منخفضة (50 درجة مئوية، ح 3) استخدام حمام مائي لم يؤثر على مورفولوجية الأقسام التعويم الحر صائم في التجارب الأولية، نحن قيمت فعالية استرجاع مستضد في أعمى موضوعية الاختبار، الذي وأكد إحصائيا فعالية استرجاع درجات الحرارة المنخفضة مستضد (الرقم 3).
الشكل 1: الجيلاتين بملء الأقسام صائم للحفاظ على الخصائص المورفولوجية كريوسيكشنز
(أ) الصور فوتوغرافية إجراءات إينترالومينال بملء صائم الماوس مع الجيلاتين. (A1) تمت إزالة تلميح مشطوف إبرة عيار 18 على التوالي لتجنب ثقب في جدار الأمعاء. (A2) كان حقن محلول الفورمالين محايدة مخزنة (10 ٪) في واحدة من نهاية صائم المقطوعة لمسح محتويات الأمعاء وإصلاح سطح التجويف القناة الهضمية. (A3) صائم المقطوعة مليئة بسائل الجيلاتين وكلا طرفي متصلة خياطة نايلون 6-0 (الأسهم السوداء)باستخدام. (A4) أربعة أكثر خياطة عقده (الأسهم البيضاء) توضع بين عقده خياطة الموجودة من قبل (الأسهم السوداء) أسفرت عن ثلاث قطع أقصر. ثم سيتم فصل الأنسجة إلى ثلاث قطع السجق الشبيهة في هذين الموقفين المشار إليه (رؤوس بيضاء). (ب) الآثار المفيدة لملء الجيلاتين على مورفولوجيا التعويم الحر كريوسيكشن. دون شغل الجيلاتين، الأقسام تميل إلى شبك، السماح بالزوائد على الأرجوحة بسهولة إلى الخلف (يسار)؛ مع ملء الجيلاتين، قسم ميكرومتر سميكة 30 يحافظ على شكل قرص ووضع مستقيم من الزوائد المحفوظة (يمين). تم تصوير الصور باستخدام التباين التدخل التفاضلية نومارسكي. تغيير حجم أشرطة، 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: fluorescence الممثل الصور من الخلايا المعوية خصل الماوس
صور الأسفار [كنفوكل] من اللجان الفنية زغابة (A) أو في سرداب، (ب)في أقسام الماوس التعويم الحر صائم ملطخة بمواقع محددة وأضداد الفسفرة حدة حالة جيردين فوسفوريلاتيد في التيروزين 1798 ( نانومتر أطوال موجية 490/525 pY1798، الأخضر، الأمثل الإثارة/الانبعاث)، فالويدين (590/617 الحمراء، شمال البحر الأبيض المتوسط)، 4,6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI، الزرقاء، 358/461 شمال البحر الأبيض المتوسط). منطقة محاطة بمربعات بيضاء في الصور التكبير المنخفض (مقياس الحانات، 50 ميكرومتر) هو التوسع في الحق (مقياس الحانات، 10 ميكرومتر). تكاثر الأجسام المضادة pY1798 وصمة عار TCs، بغض النظر عن الموقع (على من الزوائد (أ)، أو في سرداب (ب))، تلطيخ هذا تلميح لومينال (الأسهم) والغشاء، والسيتوبلازم سوما TC على شكل التخزين المؤقت. حد فرشاة سميكة مكاناً بارزا في فالويدين تلطيخ (رؤوس) علامة مميزة أخرى TCs. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: استرجاع مستضد درجات الحرارة المنخفضة يعزز الفلورة pY1798
وقورنت مجموعتان من الإجراءات التجريبية التأكد من فعالية استرجاع مستضد درجات الحرارة المنخفضة. أقسام التعويم الحر صائم (30 ميكرومتر سميكة، n = 13) من كتلة واحدة مجمدة وقسمت إلى مجموعتين، وأقسام من كل مجموعة كانت ملطخة بعد البروتوكول بكامله أو نفس البروتوكول تفتقر إلى استرجاع مستضد درجات الحرارة المنخفضة (الخطوة 4-2-2). بعد تلطيخ، المقاطع قد شنت على المسمى مع مجموعة أرقام الشرائح الفردية، ووضع العلامات على كل شريحة كانت مغطاة بإخفاء الشريط. كافة الشرائح وتعديلا، المسمى مع أرقام جديدة على الشريط، ولاحظ تحت مجهر الأسفار من خلال عامل تصفية فيتك. مجموع تهم TCs pY1798 إيجابية مرئية كانت في المتوسط في كل مجموعة، وتم عرضها في رسم بياني شريطي (يعني ± الانحراف المعياري). وأجرى اختبار t ثنائي الطرف لمقارنة حساب متوسط بين الفريقين. واعتبرت فقيم أقل من 0.05 يعتد به إحصائيا. استرجاع مستضد درجات الحرارة المنخفضة تحسن كبير في فعالية pY1798-الفلورة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
تم تصميم هذا البروتوكول للسماح للباحثين دون تجربة علم الأنسجة الحصول على صور موثوقة للخلايا خصل (TCs). هذا البروتوكول له ثلاث نقاط حرجة: 1) استخدام الموقع-والفسفره الأرانب الخاصة بمركز [بولكلونل] أجسام ضد البشرية جيردين فوسفوريلاتيد في تيروزين 1798 (الأجسام المضادة pY1798) التي تم الحصول عليها من (شركة محددة مختبرات إيمونوبيولوجيكال = الشركة X)؛ 2) الجيلاتين بملء الصائم؛ و 3) استرجاع مستضد درجات الحرارة المنخفضة. في أوسع معانيه، يمكن تصنيف الأجسام المضادة الخاصة بمركز الفسفرة كالأجسام المضادة الخاصة بالتعديل أن يتعرف على نوع معين من تعديل بوستترانسلاشونال (مثل أسيتيليشن أو مثلايشن الفسفرة) من البروتين في رواسب معينة من الأحماض الأمينية. Omori et al. وولدت الشركة س معا pY1798 الأجسام المضادة بتحصين الأرانب مع الببتيد فوسفوريلاتيد، وتنقية الأجسام المضادة الناتجة عن استخدام كروماتوغرافيا المرحلة الصلبة مع ببتيد أونفوسفوريلاتيد بعد للانتقال إلى أسلوب9، 10-pY1798 الأجسام المضادة تم التحقق من صحة مكثف مع فحوصات الفسفرة في المختبر باستخدام ناقلات التعبير جيردين البشرية كاملة الطول مع/بدون طفرة نقطة في تيروزين 17989. وفي وقت لاحق، وجد كوجا et al. أن الأجسام المضادة pY1798 من الشركة س علامة معينة وحساسة من الأمعاء TCs1. وهكذا، إدراج الأجسام المضادة pY1798 من الشركة س نقطة حرجة في هذا البروتوكول.
الجيلاتين يحتوي على الكولاجين المستخرجة من الأنسجة الحيوانية، ومنذ فترة طويلة تستخدم لتضمين عينات الأنسجة للدراسات histochemical باستخدام كريوسيكشنز13. نقطة انصهار منخفضة الجيلاتين، الذي هو مهيلم عند 4 درجة مئوية ولكن يذوب في درجة حرارة الغرفة، بدأ تطبيقها لتجنب الآثار الضارة للحرارة اللازمة للحفاظ على الجيلاتين في حالة سائلة أثناء تضمين14. في هذا البروتوكول، استخدمت الجيلاتين نقطة انصهار منخفضة مصنوعة من مسحوق الجيلاتين التي جيلاتينيزيس عند 4 درجة مئوية ويذوب في RT للحفاظ على مورفولوجية كريوسيكشنز عرضية من صائم الماوس. عندما تستخدم هذا الجيلاتين لملء تماما الصائم، عينات ثم الفورمالين-ثابتة لتحقيق جيلاتينيزيشن لا رجعة فيه. استرجاع الحرارة المستحثة مستضد هو طريقة فعالة للكشف عن المستضدات التي يتم حجب المصفف المحتوية على ألدهيد12. ومع ذلك، يمكن أن تلحق الضرر درجات حرارة عالية (95-99 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة) استخداماً لتحليل مقاطع البارافين مورفولوجية معقدة الأنسجة/الجيلاتين. هنا استخدمنا استرجاع مستضد درجة حرارة منخفضة (50 درجة مئوية، ح 3) الذي يسمح باسترجاع مستضد والحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة.
يمكن تسمية الأجسام المضادة pY1798 TCs في الماوس صائم، بل أيضا في الأجهزة متعددة (المعدة واللفائفي والقولون والمرارة) من الفئران والبشر1. ومع ذلك، نظراً لسرعة سوف تتحلل إشارات pY1798 في أنسجة غير المثبتة من أي أنسجة، يتضمن هذا البروتوكول حقن الفورمالين في التجويف صائم (الخطوة 2.1.15.، 1A الشكل2).
وهناك القيود المرتبطة بسمك كريوسيكشنز التعويم الحر. على الرغم من أن كريوسيكشنز رقيقة يمكن أن يكون مفيداً من حيث الشفافية للفحص المجهري، ركاكة يجعل هذه الأقسام الضعيفة ماديا. وفي المقابل، كريوسيكشنز سميكة قوي جسديا، لكن يكون أقل جسم النفاذية في القسم. واستخدمت في هذا البروتوكول، 30 ميكرون سميكة المقاطع التي كانت مستقرة ماديا وإنفاذاً للأجسام المضادة. على الرغم من أن هذا الأسلوب قد صمم للباحثين دون خبرة واسعة في علم الأنسجة، إذا كان البروتوكول يجب أن تفشل، pY1798/بيلين/DAPI تلطيخ ثلاثية من البارافين أقسام مماثلة لتلك المستخدمة من قبل كوجا et al. يمكن أن يؤديها1. مقاطع البارافين لم تستخدم هنا لتجنب الصعوبات المرتبطة تلطيخ فالويدين من أكتين و في مقاطع البارافين.
بسبب المحافظة على سلاسل الأحماض الأمينية المتاخمة جيردين تيروزين-1798، pY1798 الأجسام المضادة يمكن تطبيقها على وصمة عار TCs في الأنواع عدا الماوس، بما في ذلك الفئران والإنسان. يمكن أيضا تطبيق شغل الجيلاتين المستخدمة في هذا البروتوكول للأجهزة الأخرى جوفاء. وفي الواقع، وبصرف النظر عن pY1798 أو TC، مزيج الجيلاتين ملء مع درجة حرارة منخفضة مستضد استرجاع قد تكون مفيدة للكشف عن المعروف "صعب" [ابيتوبس] في القناة الهضمية الماوس، ونتيجة لذلك، قد تكون ذات أهمية بالنسبة لكثير من الباحثين.
من غير الواضح دور البيولوجية جيردين وأهمية عن الفسفرة في اللجان الفنية. ومع ذلك، دراسة أجراها لين et al. واقترح أن التيروزين الفسفرة من جيردين يرتبط بدرجة بلمرة الأكتين و8. وفي الوقت نفسه، وجد كوجا et al. أن قاتلة جرعات من مستحثات المبرمج (مثلاً.، سيسبلاتين، إشعاع الأشعة السينية) أدى إلى زيادة كبيرة في التواتر النسبي للجان الفنية في الأمعاء الماوس التي افترض أنها قد تكون مرتبطة ممكن التحويل من انتيروسيتيس إلى اللجان الفنية، بالتزامن مع الفسفرة من جيردين في زغيبات1. وسيتطلب هذا الإمكانية التحقيق إضافية في المستقبل. ثلاث مجموعات لاحظ مؤخرا السريع زيادة في تواتر TC عقب الطفيلي العدوى15،،من1617. وهكذا، هذا تلطيخ التعويم الحر يمكن استخدامها ليس فقط لتحليل الأنسجة التي تم جمعها اندوسكوبيكالي في القناة الهضمية البشرية، ولكن تراكم TC يمكن أن تساعد أيضا في تشخيص الإصابة بالطفيليات في الأمعاء البشرية.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر أساي ناويا في جامعة ناغويا لتقديم اقتراحات مفيدة لتطوير استرجاع مستضد درجات الحرارة المنخفضة للتعويم الحر صائم المقاطع. تم دعم هذا العمل من معونة ل Scientific Research (KAKENHI) (C) في 2012 (JP25460493) و (ب) في عام 2017 (JP17H04065) من "الجمعية اليابانية" لتعزيز العلوم (JSPS)، يمنح A-خطوة في عام 2014 (AS251Z02522Q) وفي عام 2015 (AS262Z00715Q) من اليابانية للعلوم والتكنولوجيا وكالة (JST)، والبصيرة وتاكيدا البحوث 2014 منحة من مؤسسة العلوم تأكيدا (للماجستير).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slc:DDY 6-week-old female mice | Chubu Kagaku Shizai | Not applicable | |
| Disodium hydrogenphosphate 12-water (Na2HPO412H2O) | Wako | 196-02835 | |
| Sodium dihydroenphosphate Dihydrate (NaH2PO42H2O | Wako | 199-02825 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Wako | 199-10665 | |
| Triton X-100, Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether | Katayama Chemical | Not applicable | |
| Sucrose | Wako | 190-00013 | |
| 10% buffered neutral formalin solution | Muto Chemical | 20215 | Step 1.3. |
| Phalloidin-fluorescent dye conjugate, Alexa Fluor 594 phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12381 | |
| Methanol | Nacalai Tesque | 21915-35 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| N.N-dimethylformamide (DMF) | Nacalai Tesque | 13015-75 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647-10G | |
| 18-gauge stainless steel straight needle | Terumo | NN-1838R | |
| U.S.P. 6-0, 60 cm nylon cut suture, Crownjun | Kono Seisakusho | Not applicable | |
| 22-gauge winged needle | Terumo | SV-22DLK | |
| 20 mL TERUMO syringe | Terumo | SS-20ES | |
| 50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
| 15 mL Iwaki centrifuge tubes | Iwaki | 2325-015 | |
| 1.5 mL micro test tube | Star | RSV-MTT1.5 | |
| Gelatin powder, Gelare-blanc | Nitta Biolab | 2809 | |
| Embedding compound for frozen tissue specimen, O.C.T. Compound 118 mL 12 piece | Sakura FineTech | 4583 | |
| Cryomold, CRYO DISH No. 3, 125 piece, well size 20 x 25 x 5 (mm) | Shoei Work's | 1101-3 | |
| Isopentane | Nacalai Tesque | 26404-75 | |
| Falcon cell culture dish 35 x 10mm Easy-Grip | Corning | 353001 | |
| Antigen retrieval solution concentrate, Target Retrieval Solution pH 9 10x | Dako | S2367 | Antigen retrieval solution concentrate in step 4.2.2. |
| Protein Block | Dako | X0909 | Blocking solution in 4.2.5. |
| Phospho-Y1798 girdin (pY1798) antibodies | Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Company X | 28143 | Phospho-Y1798 girdin antibodies in step 4.2.6. |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A11034 | |
| Aquous mounting media, Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Coverslips, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 pcs Thickness No.1 | Matsunami Glass | C022221 | |
| Entellan New, xylene-based mounting media for microscopy | Merck Millipore | 107961 | |
| MAS-coated slide glass white | Matsunami Glass | MI-MAS-01 | |
| Wooden Mappe KO-type | Shoei Work's | 99-40007 | |
| Immersion Oil 518 F Fluorescence Free 20 ml | Zeiss | 444960 | |
| Pipettes, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000) | Gilson | F144801, F123600, F123601, F123602 | |
| Ultrapure water production system | Advantec | GS-590 | |
| Plastic glove, Star Nitrile Glove | Star | RSU-NGVM | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1950 | |
| Deep freezer, SANYO Ultra Low | Sanyo | MDF-382 | |
| Showcase refrigerator | Nihon Freezer | NC-ME50EC | |
| Water bath, Thermominder SDminiN (to dissolve gelatin at 50 C) | Taitec | 0068750-000 | |
| Hybridization incubator (for antigen retrieval at 50 C) | Taitec | HB-100 | |
| Incubation chamber for immunostaining | Cosmo Bio | 10DO | |
| Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for room temperature) | Taitec | NR-1 | |
| Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for 4 C) | Tokyo Rika Kikai | MMS-3010 | |
| Stereoscopic microscope (for tissue handling) | Olympus | SZ61 | |
| Stereoscopic microscope (for Figure 1B) | Leica Microsystems | M165FC | |
| Fluorescence microscope (for Figure 3) | Nikon | E800 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Zeiss | LSM700 |
References
- Kuga, D., et al. Tyrosine phosphorylation of an actin-binding protein Girdin specifically marks tuft cells in human and mouse gut. J Histochem Cytochem. 65 (6), 347-366 (2017).
- Jarvi, O., Keyrilainen, O. On the cellular structures of the epithelial invasions in the glandular stomach of mice caused by intramural application of 20-methylcholantren. Acta Pathol Microbiol Scand Suppl. 39 (Suppl 111), 72-73 (1956).
- Enomoto, A., et al. Akt/PKB regulates actin organization and cell motility via Girdin/APE. Dev Cell. 9 (3), 389-402 (2005).
- Asai, M., et al. Similar phenotypes of Girdin germ-line and conditional knockout mice indicate a crucial role for Girdin in the nestin lineage. Biochem Biophys Res Commun. 426 (4), 533-538 (2012).
- Kitamura, T., et al. Regulation of VEGF-mediated angiogenesis by the Akt/PKB substrate Girdin. Nat Cell Biol. 10 (3), 329-337 (2008).
- Wang, Y., et al. Girdin is an intrinsic regulator of neuroblast chain migration in the rostral migratory stream of the postnatal brain. J Neurosci. 31 (22), 8109-8122 (2011).
- Nahorski, M. S., et al. CCDC88A mutations cause PEHO-like syndrome in humans and mouse. Brain. 139 (Pt 4), 1036-1044 (2016).
- Lin, C., et al. Tyrosine Phosphorylation of the G alpha-Interacting Protein GIV Promotes Activation of Phosphoinositide 3-Kinase During Cell Migration. Science signaling. 4 (192), ra64 (2011).
- Omori, K., et al. Girdin is phosphorylated on tyrosine 1798 when associated with structures required for migration. Biochem Biophys Res Commun. 458 (4), 934-940 (2015).
- Goto, H., Inagaki, M. Production of a site- and phosphorylation state-specific antibody. Nat Protoc. 2 (10), 2574-2581 (2007).
- Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4498-4502 (1979).
- Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
- Feltkamp-Vroom, T. M., Boode, J. H. An embedding and sectioning technique for immunohistochemical studies of minute specimens of tissue. J Clin Pathol. 23 (2), 188-189 (1970).
- Ushida, K. Pre-embedding technique with low melting temperature gelatin for preparation of histological sections. Proceeding of the Annual Meeting on Technologies in Biological Research. 36, 66-69 (2014).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
