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通过毛细管凝胶电泳和亲和毛细管电泳分析AtHIRD11蛋白的内在无序性及其对金属离子的结合能力

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DOI：

10.3791/57749

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2018年8月22日

 ,  ,  , 
1Institute of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, TU Braunschweig

本文内容

摘要

本方案结合了毛细管凝胶电泳对蛋白质样品的表征以及亲和毛细管电泳对带电配体的快速结合筛选。该方法适用于具有柔性结构的蛋白质（如内在无序蛋白质），可用于检测不同构象异构体在结合能力上的差异。

摘要

植物对其环境具有高度依赖性。为了适应各种胁迫性变化（例如，干旱和高盐环境），高等植物进化出一类内在无序蛋白（IDP），以减轻氧化应激和渗透胁迫。本文采用毛细管凝胶电泳（CGE）与迁移率偏移亲和电泳（ACE）相结合的方法，描述来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的IDP蛋白AtHIRD11不同构象体的结合行为。CGE用于确认AtHIRD11的纯度，并排除片段化产物、翻译后修饰及其他杂质作为复杂峰型的原因。在该实验部分，样品中不同组分依据其分子质量差异，在毛细管内的黏性凝胶中实现分离，并通过二极管阵列检测器进行检测。随后，利用ACE研究样品与多种金属离子之间的结合行为。在此情况下，将配体加入缓冲液中，通过测量迁移时间的变化，判断是否发生结合事件。采用CGE与ACE联用方法研究IDP结合行为的优势之一在于，可实现凝胶电泳和结合实验的自动化。此外，CGE的检测限低于传统凝胶电泳，而ACE能够快速确定配体结合的方式。另外，ACE也可应用于除金属离子外的其他带电物种。然而，该方法在结合实验中的应用受限于其无法准确确定结合位点的数量。尽管如此，CGE与ACE的联用方法仍可被调整，用于表征任何蛋白样品与多种带电配体之间的结合行为。

引言

植物比许多其他生命形式更依赖其生存环境。由于植物无法移动到其他地方，因此必须适应周围环境的变化（例如、干旱、低温和高盐浓度）。因此，高等植物进化出了一些特化的应激蛋白，如脱水素（dehydrins），这些蛋白具有多种功能，可减轻与高盐环境相关的细胞应激。这类蛋白能在细胞内结合水分子和离子，并通过结合Cu²⁺2+-离子相互作用，并与磷脂以及细胞骨架相互作用。此外，结合锌（Zn）2+-离子使这些蛋白质能够充当转录因子。它们结合Ca2+-离子在磷酸化后也已有报道1.

这些蛋白质的多功能性行为与其缺乏疏水性氨基酸残基有关。因此，它们在肽链内部不存在任何疏水相互作用，也不具有固定的结构。然而，由于这些蛋白质缺乏限制性结构，它们在相同条件下能够呈现出不同的构象体。因此，将其描述为一组结构集合，而非单一的构象，更为准确。具有这些特性的蛋白质被称为内在无序蛋白质（intrinsically disordered proteins, IDPs），是真核细胞中应激蛋白以及不同信号通路间串扰的广泛使用的概念2。

其中一种与胁迫相关的固有无序蛋白是AtHIRD11，它是拟南芥（Arabidopsis thaliana）中干旱条件下表达水平最高的固有无序蛋白之一。因此，可通过其有效半径与电荷比值分离不同的构象体，毛细管电泳（CE）已被用于进一步研究。此前的毛细管电泳亲和相互作用分析（ACE）实验表明，AtHIRD11可与过渡金属离子如Cu2+、Zn2+、Co2+和Ni2+发生相互作用。详细结果可参见Hara et al.3和Nachbar et al.4。

此处采用的ACE方法基于我们先前发表的研究工作6。然而，在蛋白质样品中添加EOF标记物乙酰苯胺并不合适。AtHIRD11表现出宽泛的峰形，若将EOF标记物加入样品中会掩盖两个峰。因此，该标记物在单独的一次运行中使用。在考察结合行为之前，需首先确认先前实验中观察到的峰来源于不同的构象异构体。因此，利用CGE根据蛋白质构象异构体、翻译后修饰的蛋白质以及杂质（如AtHIRD11的片段）之间的质量差异对其进行区分。随后，研究经表征的AtHIRD11样品对多种不同金属离子的结合行为。

本文的目的是描述一种实验装置，用于区分样品中的固有无序蛋白（IDP）与其他组分，以评估不同构象体在结合行为上的差异。

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方案

1. 毛细管电泳仪器的准备

  1. 准备毛细管
    1. 使用玻璃切割器在玻璃板上将带有聚酰亚胺外涂层、内径为50 µm的裸熔融石英毛细管切割成33 cm（用于CGE实验）和30 cm（用于ACE实验）的长度。
      注意：两种不同的实验装置分别针对两种不同的仪器开发。若要在其他仪器上使用，必须进行适当的方法转移，并将毛细管长度调整至仪器允许的长度。
    2. 用笔在毛细管一端起算24.5 cm处（CGE实验）和21.5 cm处（ACE实验）标记一个1 cm宽检测窗口的中心位置（有效长度）。
    3. 使用喷灯灼烧去除标记前后各0.5 cm范围内的聚酰亚胺外涂层。同样，用喷灯去除毛细管两端各1 cm长度的涂层。
      注意：有效长度可能略有差异，因其取决于所使用的毛细管电泳仪器。
    4. 用乙醇和柔软的纸巾清洁毛细管两端及检测窗口。
      注意：去涂层后的毛细管柔韧性降低，容易断裂。
  2. 安装毛细管
    1. 将毛细管安装到CE系统中，使检测窗口靠近出口端。
      注意：不同型号的CE仪器具有不同的毛细管固定系统。请参考所用仪器的操作手册以获取具体安装说明。

2. 准备溶液

  1. 准备CGE分析用溶液
    1. 制备pH 8.0的三(羟甲基)氨基甲烷（Tris）-SDS缓冲液（100 mM/1% w/v）。
      1. 称量1.00 g十二烷基硫酸钠（SDS）时，使用防毒面具并在通风柜中操作，将样品置于100 mL烧杯中。
      2. 向100 mL烧杯中加入1.21 g Tris，并加入50 mL去离子水，使用磁力搅拌器上的磁力搅拌子将其溶解。
      3. 将pH电极插入溶液中，用1.0 M HCl调节pH至8.0。
      4. 将溶液转移至100 mL容量瓶中，加去离子水至刻度线，轻轻摇匀以避免产生泡沫。
    2. 制备0.1 M NaOH溶液。
      1. 在100 mL容量瓶中称取4.0 g NaOH，加去离子水至刻度线，配制成1 M储备液。
      2. 使用10 mL刻度吸管将10 mL该溶液转移至另一个100 mL容量瓶中，再加去离子水至刻度线。
    3. 制备0.1 M HCl溶液。
      1. 使用10 mL移液管将10 mL 10 M HCl加入100 mL容量瓶中，再加去离子水至刻度线。重复此步骤以获得0.1 M HCl溶液。
    4. 制备样品溶液。
      1. 称取0.5 mg蛋白至1 mL离心管中，使用微量移液器加入0.5 mL步骤2.1.1制备的Tris-SDS凝胶缓冲液。
      2. 轻轻振荡以溶解蛋白，避免产生泡沫及蛋白降解。
        注：若按上述方法无法溶解蛋白，可使用超声处理；避免溶液加热。
    5. 将溶液分装至样品瓶中。
      1. 使用合适的注射器将每种溶液经0.22 µm聚偏氟乙烯（PVDF）滤膜直接过滤至样品瓶中。
        注：含凝胶的溶液因黏度较高，过滤时可能产生较大背压。
      2. 共准备15个样品瓶，并做好标记以避免混淆。
        1. 将3个样品瓶中装入市售的pH 8.0十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶缓冲液。
          注：使用市售SDS凝胶缓冲液可获得更精确的结果。
        2. 将1个样品瓶装入0.1 M NaOH，另1个装入0.1 M HCl，用于冲洗。
        3. 将1个样品瓶装入样品溶液。
        4. 将5个样品瓶装满去离子水，另4个样品瓶各装入0.1 mL去离子水（浸入式样品瓶）。
          注：浸入式样品瓶在每次运行前冲洗毛细管时用作废液瓶，毛细管末端浸入水中以冲洗残留凝胶。
  2. 准备ACE分析用溶液
    1. 制备1 M NaOH溶液。
      1. 在100 mL容量瓶中称取4.0 g NaOH。
      2. 加去离子水至刻度线，配制成1 M储备液。
    2. 在0.1 M NaOH溶液中制备0.1 M乙二胺四乙酸（EDTA）溶液。
      1. 使用10 mL刻度吸管将10 mL 0.1 M NaOH转移至100 mL容量瓶中，再加去离子水至刻度线。
      2. 在称量纸上称取2.42 g EDTA，将固体化合物溶解于100 mL 0.1 M NaOH溶液中。
    3. 制备Tris缓冲液（30 mM）溶液。
      1. 在500 mL烧杯中加入3.63 g Tris、200 mL去离子水和一个搅拌子，将烧杯置于搅拌器上并开启搅拌。
      2. 将pH计电极插入烧杯中，用0.1 M HCl调节pH至7.4。
      3. 将溶液转移至1 L容量瓶中，加去离子水至刻度线。
        注：由于整个分析过程所需体积超过1 L，需重复此步骤或使用更大容量的容量瓶。
    4. 制备乙酰苯胺电渗流（EOF）标记物（60 µM）溶液。
      1. 在100 mL容量瓶中加入6 mg乙酰苯胺和100 mL Tris缓冲液。
      2. 将容量瓶置于超声水浴中，开启超声30分钟。
    5. 制备样品（1 mg/mL）溶液。
      1. 将0.5 mL微量离心管置于精密天平上，加入0.3 mg冻干的AtHIRD11粉末。
      2. 使用微量移液器向管中加入0.3 mL 30 mM Tris缓冲液（pH 7.4），轻轻振荡以溶解蛋白。
    6. 制备配体溶液。
      1. 制备CaCl2（5 mM）储备溶液。
        1. 取一称量纸置于分析天平上，称取36.76 mg CaCl2*H2O。
        2. 使用微量移液器将称量纸上的CaCl2*H2O用先前配制的Tris缓冲液冲洗至50 mL容量瓶中。
        3. 用Tris缓冲液将容量瓶加至刻度线。
      2. 制备其余金属盐的储备溶液（5 mM）。
        1. 使用其他金属盐替代CaCl2*H2O，重复步骤2.2.6.1 [MgCl2：23.80 mg，BaCl2：26.02 mg，Sr(NO3)2：52.91 mg，MnCl2：31.46 mg，SeCl4：52.91 mg，CoCl2*2H2O：41.47 mg，CuCl2*2H2O：42.62 mg，ZnCl2：3.41 mg，NiCl2*6H2O：59.43 mg]。
          注：ZnCl2溶液浓度为0.5 mM。由于观察到离子与毛细管内壁之间存在强相互作用，其浓度降低了104倍。
      3. 制备500 µM CaCl2溶液。
        1. 取10 mL CaCl2储备溶液，转移至100 mL容量瓶中。
        2. 用Tris缓冲液加至刻度线，摇匀。
      4. 制备250 µM CaCl2溶液。
        1. 取5 mL CaCl2储备溶液，转移至100 mL容量瓶中。
        2. 用Tris缓冲液加至刻度线，摇匀。
      5. 对其他储备溶液重复步骤2.2.6.3和2.2.6.4。
    7. 将溶液分装至样品瓶中。
      注：每次重复运行均需一组进样端和出样端样品瓶。在进样端和出样端使用新鲜配体溶液可减少每次运行后迁移时间的偏移。
      1. 将250 µM CaCl2溶液装入10 mL注射器中。
      2. 在注射器上安装0.22 µm PVDF滤膜，推动注射器使2 mL溶液通过滤膜，弃去该部分滤液。
      3. 将注射器中剩余的250 µM CaCl2溶液分装至10个样品瓶中，至最大允许体积，每瓶标记为250 µM CaCl2溶液进样端样品瓶。
      4. 将10个样品瓶各装入半满的250 µM CaCl2溶液，每瓶标记为250 µM CaCl2溶液出样端样品瓶。
      5. 对其他含金属盐的溶液重复步骤2.2.7.1至2.2.7.4。
      6. 使用30 mM Tris缓冲液（pH 7.4）溶液替代上述溶液，重复上述步骤，为每一对进样端和出样端样品瓶分装。
        注：在各次运行之间使用30 mmol/L Tris缓冲液（pH 7.4）可获得无金属离子存在时蛋白的迁移时间数据，这对于排除电渗流变化的影响是必要的。
      7. 使用乙酰苯胺EOF标记物（60 µM）溶液替代上述溶液，重复上述步骤；再使用样品（1 mg/mL）溶液重复上述步骤。

3. 毛细管凝胶电泳分离

注意：按照 Nachbar 之前研究中描述的方法进行分离。 等4.

  1. 准备分析
    1. 活化毛细管
      1. 将恒温器设置为 23 °C。
      2. 用 0.1 M NaOH 在 2.5 bar 压力下冲洗毛细管 10 分钟。
      3. 用 0.1 M HCl 在 2.0 bar 压力下冲洗毛细管 5 分钟。
      4. 用去离子水在 2.0 bar 压力下冲洗毛细管 2 分钟。
    2. 填充 SDS 凝胶缓冲液
      1. 用市售的 pH 8.0 SDS 凝胶缓冲液在 2.0 bar 压力下填充毛细管 10 分钟。
    3. 每次分离运行前冲洗毛细管
      1. 用 0.1 M NaOH 在 4.0 bar 压力下冲洗毛细管 3 分钟。
      2. 用 0.1 M HCl 在 4.0 bar 压力下冲洗毛细管 1 分钟。
      3. 用去离子水在 4.0 bar 压力下冲洗毛细管 1 分钟。
      4. 用 SDS 凝胶缓冲液在 4.0 bar 压力下冲洗毛细管 10 分钟。
  2. 运行分离
    1. 在进样端施加 0.1 bar 压力，持续 4 分钟，通过流体动力学方式注入 CGE 实验的样品溶液（步骤 2.1.4）。
    2. 在毛细管两端施加 -16.5 kV 电压和 2.0 bar 压力，持续 25 分钟。

4. 亲和毛细管电泳分析

注意：按照 Nachbar 等4 和 Alhazmi 等5 之前研究中所述的方法进行分离制备。

  1. 毛细管预处理
    1. 将恒温器设置为 23 °C。
      注：该温度依据已发表的实验方案设定，可根据需要调整为其他温度4,5。然而，分子间相互作用依赖于温度，因此会随温度变化而改变。
    2. 使用 0.1 M NaOH 溶液在 2.5 bar 压力下冲洗毛细管 40 分钟。
    3. 使用去离子水在 1.0 bar 压力下冲洗毛细管 10 分钟。
    4. 使用 30 mM Tris 缓冲液（pH 7.4）在 1.0 bar 压力下冲洗毛细管 30 分钟。
  2. ACE 方法的准备工作
    1. 准备不含配体的测量方法。
      注：样品溶液中未添加乙酰苯胺，因其会掩盖两个蛋白质峰。
      1. 使用 0.1 M EDTA 溶液在 2.5 bar 压力下冲洗毛细管 1 分钟。
      2. 使用去离子水在 2.5 bar 压力下冲洗毛细管 1 分钟。
      3. 使用 Tris 缓冲液在 2.5 bar 压力下冲洗毛细管 1.5 分钟以达到平衡。
      4. 在 0.05 bar 压力下注入乙酰苯胺溶液 6 秒，然后将进样端和出样端的小瓶更换为 Tris 缓冲液小瓶。
      5. 施加 0.05 bar 压力 2.4 秒，以将乙酰苯胺溶液从毛细管尖端进一步推入内部。
      6. 施加 10.0 kV 电压 6 分钟，并在 200 nm 波长处检测乙酰苯胺峰。
      7. 使用蛋白质样品代替乙酰苯胺溶液，重复步骤 4.2.1.1 至 4.2.1.6，并检测所有蛋白质峰。
    2. 准备含配体的测量方法。
      1. 使用 0.1 M EDTA 溶液在 2.5 bar 压力下冲洗毛细管 1 分钟。
      2. 使用去离子水在 2.5 bar 压力下冲洗毛细管 1 分钟。
      3. 使用配体溶液在 2.5 bar 压力下冲洗毛细管 1.5 分钟以达到平衡。
      4. 在 0.05 bar 压力下注入乙酰苯胺溶液 6 秒，然后将进样端和出样端的小瓶更换为含配体的缓冲液小瓶。
      5. 施加 0.05 bar 压力 2.4 秒，以将乙酰苯胺溶液从毛细管尖端进一步推入内部。
      6. 施加 10.0 kV 电压 6 分钟，并在 200 nm 波长处检测乙酰苯胺峰。
      7. 使用蛋白质样品代替乙酰苯胺溶液，重复步骤 4.2.2.1 至 4.2.2.6，并检测所有蛋白质峰。
    3. 交替重复步骤 4.2.1 和 4.2.2，以计算不同蛋白质-金属离子相互作用下的电荷-尺寸比变化（见代表性结果部分）。
      1. 每运行 60 小时后更换一次蛋白质溶液为新鲜溶液。
        注：此时可暂停实验。由于每次运行的峰型存在轻微差异，因此每种配体浓度至少需重复 10 次。若溶液使用时间超过 60 小时，峰型变异将过大。
    4. 运行方法
      1. 使用步骤 4.2.2 中所述方法，依次运行碱土金属配体溶液（CaCl2、MgCl2、BaCl2 和 SrCl2 溶液）。
      2. 继续使用步骤 4.2.2 中所述方法，改用 MnCl2、SeCl4、CoCl2、CuCl2、ZnCl2 和 NiCl2 溶液代替碱土金属配体溶液。
        注：这些过渡金属氯化物与毛细管的相互作用更强，无法完全去除，导致每次运行的迁移时间发生偏移。因此，它们在其他金属离子之后进行检测。

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结果

图1 显示了CGE实验中获得的AtHIRD11样品的电泳图谱。肽段大小从左到右依次增加。4号峰分子量最大，代表完整蛋白。较小的2号峰和3号峰代表较小的杂质（例如，降解产物）。第一个峰以及此前基线的不规则性在未加蛋白样品的情况下也可重现，因此与SDS凝胶本身有关，并不代表任何与样品相关的杂质。

图2 显示了ACE实验中乙酰苯胺的电泳图谱。乙酰苯胺溶液仅显示一个高峰，因其不应含有杂质。峰最大值的检测时间代表电渗流的迁移时间（tEOF），并用于相互作用的计算。

图3 是在无SDS和金属离子条件下，AtHIRD11样品在AC...

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讨论

对于所有毛细管电泳实验，毛细管的制备是一个关键步骤。由于毛细管是一种直径较小的玻璃管，在操作过程中，当涂层被去除的部位容易发生断裂。将毛细管安装到仪器中时应格外小心。

采用ACE方法的关键步骤主要涉及实验装置的设置。另一个关键步骤是确定合适的样品进样参数。样品的进样量必须足够以获得较高的峰信号，但若进样过量，则会导致峰形分辨不良，出现峰重叠现象。在减少进样体积时，建议降低进样压力而非进样时间，因为仪器需要一定时间才能达到设定的进样压力。

不同蛋白质样品可能会出现异常宽的峰。该现象可受到电压升高的影响，随着电压增加，峰变窄且分离时间缩短。然而，较短的分离时间可能导致峰未能完全分离，同时较高的电压会增加焦耳热，从而因电泳扩散而限制峰变窄的效果7,8。因此，对于每一种新检测的蛋白质，都需要确定合适的实验条件。

将毛细管凝胶电泳（CGE）与亲和毛细管电泳（ACE）...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们衷心感谢日本静冈大学绿色科学技术研究所的 Masakuza Hara 提供 AtHIRD11 蛋白样品。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AtHIRD11 样品静冈大学（M. Hara 教授课题组）—在 Arabidopsis thaliana 中表达并纯化的脱水素蛋白，表达宿主为 Escherichia coli
裸熔融石英毛细管Polymicro Technologies（美国凤凰城）106815-0017TSP050375，内径 50 μm，外径 363 μm，聚酰亚胺涂层
Agilent 1600AAgilent Technologies（德国瓦尔德布隆）已不再 commercially available毛细管电泳仪；可使用 Agilent 7100 CE 替代
Agilent 7100 CEAgilent Technologies（德国瓦尔德布隆）G7100A毛细管电泳仪
Injekt 2 mLB. Braun（德国梅尔松根）4606051V用于溶液过滤的注射器
Rotilabo 注射器滤器Carl Roth GmbH + Co. KG（德国卡尔斯鲁厄）KY62.1PVDF 膜滤器，用于溶液过滤
Eppendorf Research plus 10 μLEppendorf（德国韦塞林-贝尔措夫）3121 000.023用于样品操作的微量移液器
Eppendorf Research plus 10 μLEppendorf（德国韦塞林-贝尔措夫）3121 000.120用于配制配体溶液的微量移液器
10 mL 洗耳球移液管Duran Group GmbH（德国美因茨）24 338 08用于配制 NaOH 溶液
25 mL 洗耳球移液管Duran Group GmbH（德国美因茨）24 338 14用于配制配体溶液
Duran 玻璃容量瓶 25 mLDuran Group GmbH（德国美因茨）24 671 1457用于配制配体储备液
Duran 玻璃容量瓶 10 mLDuran Group GmbH（德国美因茨）24 671 1054用于配制配体储备液
Proteome Lab SDS MW Gel BufferBeckman Coulter（美国布雷亚）已不再 commercially available用于毛细管凝胶电泳中的分离；替代 SDS 缓冲液：Bio-Rad Laboratories（德国ünchen）的 CE-SDS 运行缓冲液，货号：1485032 
乙酰苯胺Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆）397229-5G电渗流标记物
氯化锰(II)Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆）13217配体
乙二胺四乙酸（EDTA）Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆）431788-100G冲洗液成分
氯化钡Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆）202738-5G配体
十二烷基硫酸钠Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆）71729-100G用于毛细管凝胶电泳中蛋白质的溶解
六水合氯化镍(II)Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆）654507-5G配体
四氯化硒(IV)Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆）323527-10G配体
2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇（Tris）Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆）252859-100G缓冲液成分
氯化锌(II)Merck Millipore（德国达姆施塔特）1088160250配体
硝酸锶Merck Millipore（德国达姆施塔特）1078720250配体
二水合氯化钙Merck Millipore（德国达姆施塔特）1371015000配体
37% 盐酸Merck Millipore（德国达姆施塔特）1003171000用于调节 pH
二水合氯化铜(II)Riedel-de Haën（德国塞勒策）31286配体
Sonorex Longlife RK 1028 CH 45LAllpax（德国帕彭堡）10000084;0超声波清洗仪
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1Agilent Technologies（德国瓦尔德布隆）G2070-91126用于操作 CE 仪器、采集数据及数据分析的软件包

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