本方案结合了毛细管凝胶电泳对蛋白质样品的表征以及亲和毛细管电泳对带电配体的快速结合筛选。该方法适用于具有柔性结构的蛋白质（如内在无序蛋白质），可用于检测不同构象异构体在结合能力上的差异。
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摘要
摘要
植物对其环境具有高度依赖性。为了适应各种胁迫性变化（例如，干旱和高盐环境），高等植物进化出一类内在无序蛋白（IDP），以减轻氧化应激和渗透胁迫。本文采用毛细管凝胶电泳（CGE）与迁移率偏移亲和电泳（ACE）相结合的方法，描述来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的IDP蛋白AtHIRD11不同构象体的结合行为。CGE用于确认AtHIRD11的纯度，并排除片段化产物、翻译后修饰及其他杂质作为复杂峰型的原因。在该实验部分，样品中不同组分依据其分子质量差异，在毛细管内的黏性凝胶中实现分离，并通过二极管阵列检测器进行检测。随后，利用ACE研究样品与多种金属离子之间的结合行为。在此情况下，将配体加入缓冲液中，通过测量迁移时间的变化，判断是否发生结合事件。采用CGE与ACE联用方法研究IDP结合行为的优势之一在于，可实现凝胶电泳和结合实验的自动化。此外，CGE的检测限低于传统凝胶电泳，而ACE能够快速确定配体结合的方式。另外，ACE也可应用于除金属离子外的其他带电物种。然而，该方法在结合实验中的应用受限于其无法准确确定结合位点的数量。尽管如此，CGE与ACE的联用方法仍可被调整，用于表征任何蛋白样品与多种带电配体之间的结合行为。
引言
植物比许多其他生命形式更依赖其生存环境。由于植物无法移动到其他地方，因此必须适应周围环境的变化（例如、干旱、低温和高盐浓度）。因此，高等植物进化出了一些特化的应激蛋白，如脱水素（dehydrins），这些蛋白具有多种功能，可减轻与高盐环境相关的细胞应激。这类蛋白能在细胞内结合水分子和离子，并通过结合Cu²⁺2+-离子相互作用，并与磷脂以及细胞骨架相互作用。此外，结合锌（Zn）2+-离子使这些蛋白质能够充当转录因子。它们结合Ca2+-离子在磷酸化后也已有报道1.
这些蛋白质的多功能性行为与其缺乏疏水性氨基酸残基有关。因此，它们在肽链内部不存在任何疏水相互作用，也不具有固定的结构。然而，由于这些蛋白质缺乏限制性结构，它们在相同条件下能够呈现出不同的构象体。因此，将其描述为一组结构集合，而非单一的构象，更为准确。具有这些特性的蛋白质被称为内在无序蛋白质（intrinsically disordered proteins, IDPs），是真核细胞中应激蛋白以及不同信号通路间串扰的广泛使用的概念2。
其中一种与胁迫相关的固有无序蛋白是AtHIRD11，它是拟南芥（Arabidopsis thaliana）中干旱条件下表达水平最高的固有无....
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方案
1. 毛细管电泳仪器的准备
- 准备毛细管
- 使用玻璃切割器在玻璃板上将带有聚酰亚胺外涂层、内径为50 µm的裸熔融石英毛细管切割成33 cm（用于CGE实验）和30 cm（用于ACE实验）的长度。
注意：两种不同的实验装置分别针对两种不同的仪器开发。若要在其他仪器上使用，必须进行适当的方法转移，并将毛细管长度调整至仪器允许的长度。 - 用笔在毛细管一端起算24.5 cm处（CGE实验）和21.5 cm处（ACE实验）标记一个1 cm宽检测窗口的中心位置（有效长度）。
- 使用喷灯灼烧去除标记前后各0.5 cm范围内的聚酰亚胺外涂层。同样，用喷灯去除毛细管两端各1 cm长度的涂层。
注意：有效长度可能略有差异，因其取决于所使用的毛细管电泳仪器。 - 用乙醇和柔软的纸巾清洁毛细管两端及检测窗口。
注意：去涂层后的毛细管柔韧性降低，容易断裂。
- 使用玻璃切割器在玻璃板上将带有聚酰亚胺外涂层、内径为50 µm的裸熔融石英毛细管切割成33 cm（用于CGE实验）和30 cm（用于ACE实验）的长度。
- 安装毛细管
- 将毛细管安装到CE系统中，使检测窗口靠近出口端。
注意：不同型号的CE仪器具有不同的毛细管固定系统。请参考所用仪器的操作手册以获取具体安装说明。
- 将毛细管安装到CE系统中，使检测窗口靠近出口端。
2. 准备溶液
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结果
图1 显示了CGE实验中获得的AtHIRD11样品的电泳图谱。肽段大小从左到右依次增加。4号峰的分子量最大，代表完整的蛋白质。较小的2号和3号峰代表较小的杂质（例如，降解产物）。第一个峰以及此前基线的不规则性在未加蛋白样品的情况下也可重现，因此与SDS凝胶本身有关，并不代表任何与样品相关的杂质。
图2 显示了ACE实验中乙酰苯胺的电泳图谱。乙酰苯胺溶液仅显示一个高峰，因其不应含有杂质。峰最大值的检测时间代表电渗流的迁移时间（tEOF），并用于相互作用的计算。
图3 是在无SDS和金属离子条件下，AtHIRD11样品在.......
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讨论
对于所有毛细管电泳实验，毛细管的制备是一个关键步骤。由于毛细管是一种直径较小的玻璃管，在操作过程中，当涂层被去除的部位容易发生断裂。将毛细管安装到仪器中时应格外小心。
采用ACE方法的关键步骤主要涉及实验装置的设置。另一个关键步骤是确定合适的样品进样参数。样品的进样量必须足够以获得较高的峰信号，但若进样过量，则会导致峰形分辨不良，出现峰重叠现象。在减少进样体积时，建议降低进样压力而非进样时间，因为仪器需要一定时间才能达到设定的进样压力。
不同蛋白质样品可能会出现异常宽的峰。该现象可受到电压升高的影响，随着电压增加，峰变窄且分离时间缩短。然而，较短的分离时间可能导致峰未能完全分离，同时较高的电压会增加焦耳热，从而因电泳扩散而限制峰变窄的效果7,8。因此，对于每一种新检测的蛋白质，都需要确定合适的实验条件。
将毛细管凝胶电泳（CGE）与亲和毛细管电泳（ACE）.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们衷心感谢日本静冈大学绿色科学技术研究所的 Masakuza Hara 提供 AtHIRD11 蛋白样品。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AtHIRD11 样品 | 静冈大学（M. Hara 教授课题组） | — | 在 Arabidopsis thaliana 中表达并纯化的脱水素蛋白，表达宿主为 Escherichia coli |
| 裸熔融石英毛细管 | Polymicro Technologies（美国凤凰城） | 106815-0017 | TSP050375，内径 50 μm，外径 363 μm，聚酰亚胺涂层 |
| Agilent 1600A | Agilent Technologies（德国瓦尔德布隆） | 已不再 commercially available | 毛细管电泳仪；可使用 Agilent 7100 CE 替代 |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies（德国瓦尔德布隆） | G7100A | 毛细管电泳仪 |
| Injekt 2 mL | B. Braun（德国梅尔松根） | 4606051V | 用于溶液过滤的注射器 |
| Rotilabo 注射器滤器 | Carl Roth GmbH + Co. KG（德国卡尔斯鲁厄） | KY62.1 | PVDF 膜滤器，用于溶液过滤 |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf（德国韦塞林-贝尔措夫） | 3121 000.023 | 用于样品操作的微量移液器 |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf（德国韦塞林-贝尔措夫） | 3121 000.120 | 用于配制配体溶液的微量移液器 |
| 10 mL 洗耳球移液管 | Duran Group GmbH（德国美因茨） | 24 338 08 | 用于配制 NaOH 溶液 |
| 25 mL 洗耳球移液管 | Duran Group GmbH（德国美因茨） | 24 338 14 | 用于配制配体溶液 |
| Duran 玻璃容量瓶 25 mL | Duran Group GmbH（德国美因茨） | 24 671 1457 | 用于配制配体储备液 |
| Duran 玻璃容量瓶 10 mL | Duran Group GmbH（德国美因茨） | 24 671 1054 | 用于配制配体储备液 |
| Proteome Lab SDS MW Gel Buffer | Beckman Coulter（美国布雷亚） | 已不再 commercially available | 用于毛细管凝胶电泳中的分离；替代 SDS 缓冲液：Bio-Rad Laboratories（德国ünchen）的 CE-SDS 运行缓冲液，货号：1485032 |
| 乙酰苯胺 | Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆） | 397229-5G | 电渗流标记物 |
| 氯化锰(II) | Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆） | 13217 | 配体 |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆） | 431788-100G | 冲洗液成分 |
| 氯化钡 | Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆） | 202738-5G | 配体 |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆） | 71729-100G | 用于毛细管凝胶电泳中蛋白质的溶解 |
| 六水合氯化镍(II) | Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆） | 654507-5G | 配体 |
| 四氯化硒(IV) | Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆） | 323527-10G | 配体 |
| 2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇（Tris） | Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆） | 252859-100G | 缓冲液成分 |
| 氯化锌(II) | Merck Millipore（德国达姆施塔特） | 1088160250 | 配体 |
| 硝酸锶 | Merck Millipore（德国达姆施塔特） | 1078720250 | 配体 |
| 二水合氯化钙 | Merck Millipore（德国达姆施塔特） | 1371015000 | 配体 |
| 37% 盐酸 | Merck Millipore（德国达姆施塔特） | 1003171000 | 用于调节 pH |
| 二水合氯化铜(II) | Riedel-de Haën（德国塞勒策） | 31286 | 配体 |
| Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L | Allpax（德国帕彭堡） | 10000084;0 | 超声波清洗仪 |
| Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 | Agilent Technologies（德国瓦尔德布隆） | G2070-91126 | 用于操作 CE 仪器、采集数据及数据分析的软件包 |
参考文献
- Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
- Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins.
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