通过质谱流式细胞术对全外周血进行免疫表型和细胞因子产生的单细胞分析

摘要

本文介绍一种单细胞蛋白质组学方法，通过质谱流式细胞术分析外周全血样本中免疫表型及功能（细胞内细胞因子诱导）的变化。

摘要

细胞因子在自身免疫性疾病发病机制中发挥关键作用。因此，为阐明导致自身耐受破坏并引发自身免疫的精确机制，众多研究聚焦于细胞因子水平的检测。迄今为止的研究方法主要集中于免疫系统某一特定方面（单一或少数几种细胞类型或细胞因子），无法对复杂的自身免疫性疾病进行全局性评估。尽管基于患者血清的研究为理解自身免疫提供了重要见解，但无法确定所检测到的失调细胞因子的具体细胞来源。一种全面的单细胞方法可在多种免疫细胞亚群背景下评估细胞因子的产生情况， "内在的" 患者特异性的血浆循环因子在此进行描述。该方法能够监测患者特异性的免疫表型（表面标志物）和功能（细胞因子），无论是在其天然状态下 "内在致病性" 疾病状态，或存在治疗剂时（体内 或 离体).

引言

自身免疫性疾病是导致发病率和死亡率升高的主要原因之一，影响着全球3%至8%的人口。在美国，自身免疫性疾病是年轻和中年女性（年龄<65岁）的主要死亡原因之一^1,2。自身免疫性疾病具有多样化的临床表现和复杂的免疫学基础机制。这种异质性在不同疾病中表现明显，例如类风湿关节炎（RA）中的关节受累和多发性硬化症（MS）中的神经系统病变。然而，这种异质性在同一疾病内部也同样显著，以系统性红斑狼疮（SLE）为例：部分患者表现为肾脏病理改变，而另一些患者则出现血液系统或关节受累³。

自身免疫性疾病的潜在免疫病理发生机制与临床异质性相似，涉及多种天然免疫和适应性免疫细胞亚群的自身活化与过度活化，以及同时发生的细胞因子产生失调。尽管细胞因子在自身免疫性疾病发病机制中起着关键作用，但明确其在疾病机制中的具体作用仍具挑战性。细胞因子具有多效性（一种细胞因子可对不同类型细胞产生多种效应）、冗余性（多种细胞因子可产生相同效应）、双向性（同一种细胞因子在不同条件下可发挥促炎或抗炎作用）以及可塑性（细胞因子的功能可根据环境被塑造为与其"原始"功能不同的作用）^4,5,

方案

本文所描述的所有方法均已获得科罗拉多大学科罗拉多多重机构审查委员会（COMIRB）的批准。除非另有说明，以下所有操作均应在无菌细胞培养操作台中进行，并使用滤芯吸头及经过过滤的所有试剂。

1. 外周全血处理试剂的制备

1. 根据制造商说明，将冻干试剂溶于DMSO中，配制10 mM的鲁索替尼（ruxolitinib）储备液，分装为每管10–15 μL（单次使用）；储存于-80 °C。所有实验（包括未刺激对照组）中的DMSO终浓度应低于0.2%（体积比）。
2. 根据制造商说明，将冻干试剂溶于无菌水中，配制1 μg/μL的R848（瑞西莫德，resiquimod）储备液，分装为每管10–15 μL（单次使用）；储存于-80 °C。
3. 根据制造商说明，将冻干试剂溶于无菌水中，配制1 μg/μL的脂多糖（LPS）储备液，每管分装5 μL（仅限一次性使用）；储存于-80 °C。
4. 使用PBS、0.5% BSA和0.02% NaN₃配制细胞染色缓冲液（CSM）。
5. 准备并备好蛋白转运抑制剂（PTI）混合液（材料表）。
6. 将鲁索替尼储备液（10 mM）在无菌PBS中1:10稀释（终浓度1 mM），于组织培养超净台中室温放置备用。
7. 将R848储备液（1 μg/µL）在无菌PBS中1:10稀释（终浓度0.1 μg/µL....

结果

图1 展示了外周血样本刺激与处理的工作流程，包括血液样本分装、刺激剂添加时间、蛋白转运抑制剂混合物的加入以及孵育时间，直至红细胞（RBC）裂解和固定。刺激剂的选择取决于所要评估的信号通路和细胞因子通路。例如，在本方案中，使用 Toll 样受体（TLR）激动剂来评估多种细胞类型的先天免疫感应机制。选取了代表性的细胞外激动剂（LPS，TLR4 激动剂）和内体激动剂（R848，TLR7/8 激动剂）。其他刺激剂包括佛波酯-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）和离子霉素（PMAIONO），二者可作为 T 细胞激活剂。此外，也可使用特定细胞因子以及其他特异性 B 细胞和 T 细胞抗原作为刺激剂。

为了展示本方案中所述的实验方法，图2、图3和.......

讨论

本文介绍一种新颖的单细胞蛋白质组学方法，可同时评估多种免疫细胞类型，并在患者特异性的"致病性"外周血浆循环因子环境中检测其多种细胞因子的改变。该方法以外周全血作为分析载体，采用质谱流式细胞术作为评估免疫细胞表型及功能异常的工具。该方法可广泛应用于人类和小鼠研究²¹，并可与其他免疫功能分析方法兼容，例如检测信号转导异常¹⁴。

用户应了解多个可能影响本实验成功与否的变量。根据我们的经验，血液样本应在采集后2 h内进行处理，以避免细胞内细胞因子的基础水平被诱导升高（数据未显示）。在等待处理期间，血液样本应保持在室温（25 °C）。血液样本可采集至肝素钠或EDTA管中，均不会干扰本实验所描述的检测。活细胞与死细胞的区分可通过质谱流式细胞术使用顺铂进行评估²²。然而，在上述方案中，假设血液样本在采集后立即（或2 h内）处理，因此省略了此项评估。此外，即使样本处理有所延迟，由于未进行冷冻保存，也可省略活/死细胞的区分步骤。然而，我们仍建.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
鲁索利替尼	圣克鲁斯	SC-364729A	储备浓度：10 mM；终浓度：5 μM
R848	Invivogen	tlrl-r848-5	储备浓度：1 μ克/μL；终浓度：1 μg/mL
LPS-EK	Invivogen	tlrl-eklps	储备浓度：1 μg/μL；终浓度：0.1 μg/mL
无菌 PBS	Lonza	17-516F
裂解/固定缓冲液	BD生物科学	558049	储存浓度：5X；终浓度：1X（用ddH2O稀释）
BD Phosflow 破膜/洗涤缓冲液 I	BD生物科学	557885	储存浓度：10X；终浓度：1:10（用ddH2O稀释）
RPMI	Gibco	21870-076
叠氮化钠（NaN3）	Sigma-Aldrich	S-8032	储备浓度： >99.9%；终浓度：0.0002
蛋白质转运抑制剂（PTI）	eBiosciences	00-4980-93	储备浓度：500倍；工作浓度：1倍
DNA嵌 intercalator	Fluidigm	201192B	储备浓度：500 μM；终浓度：0.1 μM
细胞染色液			PBS + 0.5% BSA，0.02% NaN₃
MaxPar 条形码通透缓冲液	Fluidigm	201057	储备浓度：10X；终浓度：1X
20-plex Pd 条形码试剂盒	Fluidigm	S0014	储备浓度：不适用；终浓度：不适用
EQ TM 四元素校准微球	Fluidigm	201078	储备浓度：10X；终浓度：1X
16% 无甲醇甲醛溶液	赛默飞世尔科技	28908	储备浓度：16%（w/v）；终浓度：1.6%（w/v）
无菌圆底聚苯乙烯管	VWR	60818-496	储存浓度：不适用；终浓度：不适用
聚丙烯簇状管	Light Labs	A-9001	储备浓度：不适用；终浓度：不适用
Helios CyTOF 仪器	Fluidigm	Helios	用于CyTOF分析的所有溶液必须无金属污染。配制任何溶液所用的ddH2O电阻率应至少达到18.0 MΩ·cm。Ω.cm. ddH2O 及任何自行配制的溶液应储存于未经高压灭菌的全新塑料瓶或玻璃瓶中。
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>用于质谱流式细胞术的抗体
<强>表面标志物
CD1c	Biolegend	L161	质量：161
CD3	BD	UCHT1	质量：144
CD4	Biolegend	SK3	质量：174
CD7	BD	M-T701	质量：149
CD8	Biolegend	SK1	质量：142
CD11b	Fluidigm	ICRF44	质量：209
CD11c	BD	B-ly6	质量：152
CD15	BD	HI98	质量：115
CD14	Biolegend	M5E2	质量：154
CD16	eBioscience/Thermo	B73.1	质量：165
CD19	圣塔克鲁兹	SJ25C1	质量：163
CD21	Biolegend	Bu32	质量：141
CD27	BD	L128	质量：155
CD38	Fluidigm	HIT2	质量：172
CD45 总量	Biolegend	HI30	质量：89
CD45RA	Biolegend	HI100	质量：153
CD56	Miltenyi	REA196	质量：168
CD66	BD	B1.1/CD66	质量：113
CD86	Fluidigm	IT2.2	质量：150
CD123	Fluidigm	6H6	质量：143
CD278/ICOS	Biolegend	C398.4A	质量：156
CD179/PD1	Biolegend	EH12.2H7	质量：162
IgD	Biolegend	IA6-2	质量：146
IgM	Biolegend	MHM-88	质量：151
CXCR5	BD	RF8B2	质量：173
HLADR	Biolegend	L243	质量：167
<强>细胞因子
IL-1α	Biolegend	364-3B3-14	质量：147
IL-1β	Biolegend	H1b-98	质量：169
IL-1RA	Santa Cruz	AS17	质量：157
IL-6	Biolegend	MQ2-13A5	质量：164
IL-8	BD	E8N1	质量：160
IL-12/IL-23p40	Biolegend	C8.6	质量：171
IL-17A	Biolegend	BL168	质量：148
IL23p19	eBioscience/Thermo	23dcdp	质量：176
MIP1β	BD	D21-1351	质量：158
MCP1	BD	5D3-F7	质量：170
IFNα	Miltenyi	LT27:295	质量：175
IFNγ	Biolegend	4S.B3	质量：165
PTEN	BD	A2B1	质量：159
TNFα	Biolegend	Mab11	质量：166
<强>注意：若制造商标注为 Fluidigm，则该抗体为从 Fluidigm 购买的预偶联金属抗体；若制造商标注为 Fluidigm 以外的其他公司，则该抗体使用 MaxPar 多金属标记试剂盒自行偶联。  试剂盒（Fluidigm 货号：201300），按照制造商说明书操作。