大鼠外周全血细胞免疫表型和因子生成的单细胞分析

这种方法可以帮助回答自身免疫领域的问题，例如识别细胞频率异常和功能差异，例如在自身免疫性疾病的情况下产生关键细胞因子。该方法的主要优点是它可以从容易获得的外周血样本中捕获广泛的库或不同的细胞类型和功能差异。一般来说，刚接触这一过程的人可能难以掌握正确的血液处理步骤的时间安排、抗体检测组合的设计、条形码过程本身以及高维单细胞数据的分析。

这种系统免疫学方法特别适用于自身免疫性疾病，如 SLE，其中免疫失调在外周血中普遍存在且明显。该方法的视觉演示对于阐明步骤的时间以及展示如何在质谱流式细胞术分析之前对多个样品进行条形码编码和合并非常重要。要开始此过程，请将五种不同条件的标记圆底聚苯乙烯管放在架子上进行全血处理。

接下来，向每根试管中加入 1 毫升 37 摄氏度的 RPMI。然后，向每管中加入 1 毫升全血，并上下移液数次，以与 RPMI 充分混合。随后，将 10 微升预先稀释的 ruxolitinib 添加到标记为 T six plus five R 的试管中并充分混合。

将试管架放入 37 摄氏度的培养箱中，然后开始计时孵育。要处理 T zero 样品，请将 T zero 管的全部内容物移液到含有 20 毫升工作浓度的 37 摄氏度裂解/固定缓冲液的标记锥形管中。为了优化细胞回收率，用裂解/固定缓冲液冲洗试管，并通过倒置锥形管进行混合。

将细胞在 37 摄氏度下孵育 15 分钟，以便进行裂解和固定。然后，在室温下以 500 倍 G 离心细胞 5 分钟。然后，倒出上清液并将细胞重新悬浮在一毫升冰冷的 PBS 中以打碎沉淀。

然后，用 PBS 填充锥形管至 15 mL 体积。随后，在室温下以 500 倍 G 离心细胞 5 分钟。将细胞重悬于一毫升 CSM 中以打碎沉淀。

然后，将样品转移到标记的微量离心管中进行抗体染色。使用自动细胞计数仪，用 10 μL 样品对细胞进行计数。接下来，在室温下以 500 倍 G 离心细胞 5 分钟。

然后，吸出上清液，将沉淀留在约 60 微升的残留物中。将此沉淀保存在冰上，直到来自其他条件的样品完成处理。在 T 等于 30 分钟时，将试管架转移到组织培养罩上。

以 0.1 克/微升的浓度将 10 微升 R848 加入 T six 加 R848 试管中，并充分混合。然后，以 0.01 μg/μL 的浓度向 T six plus LPS 管中加入 10 μL LPS 并充分混合。之后，向标记为 T six、T six 加 5 R 和 T six 加 LPS 的试管中加入 4 微升蛋白质转运抑制剂，并将样品放回培养箱中，直到 T 等于 6 小时。

每 2 小时用 P1000 移液器彻底混合样品。在 T 等于 2 小时时，向 T six 加 R848 试管中加入 4 μL 蛋白质转运抑制剂混合物。混合所有样品，并将样品架放回培养箱中，直到 T 等于 6 小时。

在 T 等于 4 小时时，用 P1000 移液器再混合样品一次。在 T 等于 6 小时时，按照 T 零样品的说明处理 T 6、T 6 加 LPS、T 6 加 R848 和 T 6 加 5 个 R 样品管。然后，将颗粒储存在零下 80 摄氏度的残留 CSM 体积中，以便稍后处理。

要对裂解的固定细胞进行条形码编码，请在冰上缓慢解冻来自零下 80 摄氏度储存的样品。用 PBS 将 10X 条形码烫发缓冲液稀释 1 至 10，并制备足够每个样品 3 mL 的缓冲液。用 CSM 填充一个非无菌槽，用 1 个 X 条形码烫发缓冲液填充一个槽。

然后，向新鲜解冻的样品中加入 1 毫升冰冷的 CSM，充分混合，并转移到相应的预标记聚丙烯簇管中。现在，取 10 μL 样品并使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。通过去除多余细胞的体积，使每个簇管中的细胞计数标准化。

然后，在室温下以 600 倍 G 离心细胞 5 分钟。用多通道移液器将细胞重悬于 1 毫升 1 X 条形码烫发缓冲液中，并在室温下以 600 倍 G 离心 5 分钟。然后，吸出上清液。

按照条形码键上指示的顺序将簇管在架子上对齐，以便样品与其条形码匹配。通过多通道移液器向簇管中的所有样品中加入 800 微升 1 X 条形码烫发缓冲液，不要接触细胞沉淀，以减少细胞损失。然后，将装有簇管的架子放在一边。

从零下 20 摄氏度中取出 20 重钯条形码试剂盒试管条，并在室温下解冻。加入 100 μL 的 1 X 条形码烫发缓冲液，充分混合，然后将 120 μL 重悬的条形码混合物转移到簇管中的相应细胞样品中。通过多通道移液器充分混合，使单独条形码的样品之间没有交叉污染。

在室温下孵育簇状试管 30 分钟，让条形码标记细胞。30 分钟后，在室温下以 600 倍 G 离心样品 5 分钟。吸出上清液，然后将它们重新悬浮在 1 毫升 CSM 中。

随后，离心并再次重悬于 CSM 中。然后，在室温下以 600 倍 G 离心 5 分钟，并吸出上清液。使用单个移液器和相同的吸头，将残留体积约为 70 至 80 微升的所有细胞沉淀转移到一个聚苯乙烯管中。

请勿弹出移液器吸头。将此吸头放在一边。使用多通道移液器和新吸头，向每个原始簇状管中加入 100 μL CSM，以最大限度地提高细胞回收率。

使用单移液管和搁置的吸头，将 100 μL 残留体积的所有细胞沉淀转移到同一聚苯乙烯管中。加入 CSM 以将聚苯乙烯管加满约 3 毫升。计数并记录混合条形码集的细胞数。

然后，在室温下以 600 倍 G 离心 5 分钟并吸出上清液。在同一天继续对带条形码的样品进行染色。该示意图演示了刺激和处理外周血样本的工作流程，包括血样等分试样的分配、刺激剂添加的时间、蛋白质转运抑制剂混合物以及红细胞裂解和固定前的孵育时间。

刺激剂的选择将取决于评估目标的信号转导和细胞因子通路。固定和 RBC 裂解后，对来自健康供体的个体裂解固定细胞样品进行条形码标记，用 26 种抗表面标志物抗体标记，透化，并用 14 种抗细胞因子抗体染色。此处显示了代表 CD14 高单核细胞鉴定的有限门控策略。

从左到右，表示的每个 2D 图都是来自父种群的种群子集，该种群从紧靠左侧的 2D 图门控。使用 CD14 高单核细胞作为 8 个免疫细胞亚群的代表，在未刺激的时间零以及用 TLR 激动剂 LPS 和 R848 以及 T 细胞激活剂 PMA 离子霉素刺激后，对来自健康供体的外周血样本进行质谱流式细胞术分析。显示了 CD14 高单核细胞中细胞因子诱导的一个例子，并描述了对所用刺激剂具有特异性的选定细胞因子。

R848 选择性诱导 CD14 高单核细胞中的 IL-12p40 亚基和 MCP1，而 LPS 则不。相比之下，PMA 离子霉素不会在 CD14 高单核细胞中诱导细胞因子。一旦掌握，血液刺激可以在大约 7 小时内完成，条形码步骤可以在大约一个小时内完成。

尝试此程序时，请务必注意步骤的时间安排并相应地提前计划。完成此程序后，您可以考虑更改质谱流式细胞术面板中的血液刺激条件，以评估特定于您自己的研究目标的免疫细胞反应。观看此视频后，您应该对如何从全血样品中引发细胞因子反应以及如何将多个样品合并成一个条形码组进行质谱流式细胞术分析有很好的了解。