Name: 大鼠外周全血细胞免疫表型和因子生成的单细胞分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: 了解大鼠外周全血单细胞蛋白质组学分析方法，利用质谱流式细胞术评估免疫细胞表型与细胞因子生成功能。该技术适用于自身免疫疾病研究，可识别细胞频率异常及功能差异。

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我们感谢 Aimee Pugh-Bernard 提供的学术指导和有益建议。本研究由 Boettcher 基金会 Webb-Waring 生物医学研究奖以及美国国立卫生研究院（NIH）授予 Elena W.Y. Hsieh 的项目编号 K23-1K23AR070897 资助。她还获得了 NIH 项目编号 K12-HD000850 的资助。 尤妮斯·肯尼迪·施赖弗 美国国家儿童健康与人类发展研究所、卢西尔·帕卡德儿童健康基金会、斯坦福大学临床与转化科学奖 UL1 TR001085 以及斯坦福大学儿童健康研究所

本文所描述的所有方法均已获得科罗拉多大学科罗拉多多重机构审查委员会（COMIRB）的批准。除非另有说明，以下所有操作均应在无菌细胞培养操作台中进行，并使用滤芯吸头及经过过滤的所有试剂。
1. 外周全血处理试剂的制备
<ol>
	<li>根据制造商说明，将冻干试剂溶于DMSO中，配制10 mM的鲁索替尼（ruxolitinib）储备液，分装为每管10–15 μL（单次使用）；储存于-80 °C。所有实验（包括未刺激对照组）中的DMSO终浓度应低于0.2%（体积比）。</li>
	<li>根据制造商说明，将冻干试剂溶于无菌水中，配制1 μg/μL的R848（瑞西莫德，resiquimod）储备液，分装为每管10–15 μL（单次使用）；储存于-80 °C。</li>
	<li>根据制造商说明，将冻干试剂溶于无菌水中，配制1 μg/μL的脂多糖（LPS）储备液，每管分装5 μL（仅限一次性使用）；储存于-80 °C。</li>
	<li>使用PBS、0.5% BSA和0.02% NaN3配制细胞染色缓冲液（CSM）。</li>
	<li>准备并备好蛋白转运抑制剂（PTI）混合液（材料表）。</li>
	<li>将鲁索替尼储备液（10 mM）在无菌PBS中1:10稀释（终浓度1 mM），于组织培养超净台中室温放置备用。</li>
	<li>将R848储备液（1 μg/µL）在无菌PBS中1:10稀释（终浓度0.1 μg/µL），于组织培养超净台中室温放置备用。</li>
	<li>将LPS储备液（1 μg/μL）在无菌PBS中1:100稀释（终浓度0.01 μg/µL），于组织培养超净台中室温放置备用。</li>
	<li>将无L-谷氨酰胺的无菌RPMI培养基置于标准37 °C水浴中预热（至少10分钟）。</li>
	<li>在台面上用过滤的ddH2O将裂解/固定缓冲液按1:5稀释（工作浓度）（无需无菌）。 
	注意：每1 mL全血需要20 mL工作浓度的裂解/固定缓冲液。
	<ol>
		<li>为5种实验条件（每种使用1 mL全血）配制裂解/固定缓冲液（总量至少100 mL）。每毫升全血对应将20 mL工作浓度的裂解/固定缓冲液分装至50 mL锥形管中（使用前保持裂解/固定液于37 °C）。在含有裂解/固定缓冲液的锥形管上标注如下实验条件：T0（零时点）、T6 + 5R（6小时 + 5 μM鲁索替尼）、T6 + R848（6小时 + 1 μg/mL R848）、T6 + LPS（6小时 + 0.1 μg/mL LPS）、T6（6小时）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用与步骤1.10相同的命名方式，标记带盖的无菌圆底聚苯乙烯管和1 mL微量离心管。</li>
</ol>
2. 外周全血的刺激与处理（图1）
<ol>
	<li>将步骤 1.11 中标记的圆底聚苯乙烯管（T0、T6 + 5R、T6 + R848、T6 + LPS、T6）放置于试管架上。 
	注意：除非另有说明，以下所有步骤均在此类试管中进行。在组织培养罩与培养箱之间转移时需盖紧管盖，以维持无菌状态。</li>
	<li>向每支试管（T0、T6 + 5R、T6 + R848、T6 + LPS、T6）中加入 1 mL 37 °C 的 RPMI（不含 L-谷氨酰胺）。将采血管轻轻倒置数次，然后向每支试管中加入 1 mL 全血，并用移液器反复吹打数次，使其与 RPMI 充分混匀（用 RPMI 稀释可防止血液在 6 小时孵育期间发生凝集）。</li>
	<li>向 T6 + 5R 管中加入 10 μL 1:10 稀释的鲁索利替尼（ruxolitinib），用 P1000 移液器充分混匀。将装有试管的试管架放入 37 °C 培养箱中，并开始计时孵育（T = 0）。</li>
	<li>按以下步骤处理 T0 样本。
	<ol>
		<li>将 T0 管中的全部内容物用移液器转移至一个已标记的锥形管中，该锥形管内含 20 mL 37 °C 的工作浓度裂解/固定缓冲液。为优化细胞回收率，用工作浓度的裂解/固定缓冲液冲洗原试管。通过倒置锥形管混匀。</li>
		<li>在 37 °C 孵育 15 分钟，以完成裂解和固定。固定完成后，后续所有步骤均在台面上进行。在室温下以 500 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>倾去上清液。用 1 mL 冰冷 PBS 重悬细胞以打散沉淀，然后用 PBS 加至总体积 15 mL。</li>
		<li>在室温下以 500 × g 离心 5 分钟。倾去上清液。若沉淀呈红色，则重复 PBS 洗涤步骤（步骤 2.4.3–2.4.4）。用 1 mL CSM 重悬细胞以打散沉淀，然后转移至已标记的微量离心管（步骤 1.11）中进行抗体染色。取 10 µL 样本，使用自动细胞计数仪或血球计数板进行细胞计数。 
		注意：由于此时所有细胞均已固定，无需加入活率染料。</li>
		<li>在室温下以 500 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，保留约 60 µL 残余液体中的沉淀。将此沉淀置于冰上，直至其他条件的样本完成处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 T = 30 分钟时，将试管架（步骤 2.3）移至组织培养罩中，并执行以下操作。
	<ol>
		<li>向 T6 + R848 管中加入 10 μL 0.1 μg/μL 的 R848，用 P1000 移液器充分混匀。</li>
		<li>向 T6 + LPS 管中加入 10 μL 0.01 μg/μL 的 LPS，用 P1000 移液器充分混匀。</li>
		<li>向 T6、T6 + 5R 和 T6 + LPS 管中各加入 4 μL 蛋白转运抑制剂（储存液为 500X），但不要加入 T6 + R848 管，然后将样本放回培养箱继续孵育至 T = 6 小时。每 2 小时用 P1000 移液器充分混匀一次。 
		注意：R848 是一种内质网 TLR 激动剂，因此需要延迟添加蛋白转运抑制剂，以确保其能够接触到靶受体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 T = 2 小时时，向 T6 + R848 管中加入 4 μL 蛋白转运抑制剂混合液（储存液为 500X）。用 P1000 移液器混匀所有样本，并将试管架放回培养箱继续孵育至 T = 6 小时。</li>
	<li>在 T = 4 小时时，再次用 P1000 移液器将所有样本混匀一次。</li>
	<li>在 T = 6 小时时，按照步骤 2.4 中对 T0 样本的描述，处理 T6、T6 + LPS、T6 + R848 和 T6 + 5R 的血液样本管。</li>
	<li>将细胞沉淀连同残余的 CSM 体积一起在 -80 °C 保存，以便日后处理。或者，也可不保存，直接进行条形码标记和抗体染色。</li>
</ol>
3. 裂解/固定血液细胞的条形码
<ol>
	<li>将裂解/固定的细胞样品从 -80 °C 缓慢冰上解冻；本系统最多可对 20 个样品进行唯一条形码标记并混合。用 PBS 将 10X 条形码通透缓冲液按 1:10 稀释；每份样品约需准备 3 mL 缓冲液。</li>
	<li>取一个无菌槽加入 CSM，另一个加入 1X 条形码通透缓冲液。向新解冻的样品中加入 1 mL 冰冷的 CSM，用移液器充分混匀，然后转移至相应预标记的聚丙烯簇管中。</li>
	<li>取 10 μL 样品，使用自动细胞计数仪或血细胞计数板进行细胞计数。将每个簇管中的细胞数标准化至 1.5–2 × 106 个细胞：移除并弃去超过 2 × 106 个细胞的多余体积。</li>
	<li>在室温下以 600 × g 离心 5 分钟。使用多通道移液器将细胞重悬于 1 mL 1X 条形码通透缓冲液中，再于室温下以 600 × g 离心 5 分钟。吸除上清液。</li>
	<li>将簇管按条形码编码表所示顺序排列在支架上，确保样品与对应条形码匹配。使用多通道移液器向所有簇管样品中加入 800 μL 1X 条形码通透缓冲液，注意移液枪头勿接触细胞沉淀（不 混匀），以减少细胞损失。将装有簇管的支架暂置一旁。</li>
	<li>从 -20 °C 取出 20-plex Pd 条形码试剂盒管条，在室温下解冻。加入 100 μL 1X 条形码通透缓冲液，充分混匀，然后将 120 μL 重悬的条形码混合液转移至对应簇管中的细胞样品。</li>
	<li>使用多通道移液器充分混匀，确保各单独条形码标记的样品之间无交叉污染。将簇管在室温下孵育 30 分钟，使条形码完成细胞标记。</li>
	<li>在室温下以 600 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，然后用 1 mL CSM 重悬细胞。</li>
	<li>重复步骤 3.8 的离心和 CSM 重悬操作。 
	注意：每个样品现已标记有唯一条形码，样品可准备混合。</li>
	<li>在室温下以 600 × g 离心 5 分钟，吸除上清液。使用单通道移液器并保持同一枪头，将所有细胞沉淀以约 70–80 μL 残余体积转移至一个聚苯乙烯管中。请勿弹出移液枪头；将此带枪头的移液器暂置一旁。</li>
	<li>使用多通道移液器和新的枪头，向每个原始簇管中加入约 100 μL CSM，以最大限度回收残留细胞。使用之前暂置的带枪头的单通道移液器，将所有细胞沉淀以约 100 μL 残余体积转移至同一聚苯乙烯管中。</li>
	<li>加入 CSM 至聚苯乙烯管满体积（约 3 mL）。计数并记录混合条形码样品的总细胞数。在室温下以 600 × g 离心 5 分钟，吸除上清液。应在同一天内继续进行条形码标记样品的染色操作。 
	注意：条形码标记过程中细胞损失约 20–30% 属正常现象。</li>
</ol>
4. 条形码标记的裂解/固定血液细胞染色及质谱流式细胞仪分析前准备
注意：每1X染色抗体滴度（每100 μL染色反应含1 μL抗体）通常可染色3–4 × 106个细胞。因此，当所有条形码标记的样本合并至同一管中时，必须按比例增加抗体用量。若20个条形码样本总计为30 × 106个细胞，而每个1X滴度可染色3–4 × 106个细胞，则条形码样本仅需使用10X滴度的抗体，相比之下，若对每个样本单独染色，则需要20X量的抗体（每个单独管使用1X）。每种抗体混合物的抗体浓度与细胞数量之间的比例应进行仔细滴定（本文未讨论）。
<ol>
	<li>使用抗体（材料表）对细胞进行表面染色和细胞因子诱导。
	<ol>
		<li>通过计算所需添加量并考虑移液误差，配制表面染色混合液（例如，若对20个条形码样本进行染色，每个样本含2 × 106个细胞，则需要10倍浓度的染色液；在最终体积计算中，为补偿移液误差，应配制10.5倍浓度的最终染色溶液）。</li>
		<li>将相当于10倍体积的表面染色液加入条形码标记的细胞沉淀中。为减少细胞损失，使用同一枪头混合并量取表面染色液与细胞沉淀的总体积。</li>
		<li>根据细胞体积和染色混合液体积，加入CSM，使每个细胞样本的最终染色体积为50 μL（例如，若处理一组20个样本，则50 μL × 20 = 1 mL）。在4 °C孵育30分钟。每15分钟振荡样本一次，以促进染色均匀。</li>
		<li>在表面染色孵育期间，用过滤的ddH2O按1:10稀释配制Perm/Wash缓冲液（材料表）。准备2 mL用于透化，5 mL用于洗涤。置于4 °C或冰上保存。</li>
		<li>用CSM补满表面染色管，于4 °C以600 × g离心5分钟。吸除上清液。将条形码样本重悬于2 mL、4 °C、1:10稀释的Perm/Wash缓冲液中。在4 °C孵育20–30分钟，以充分透化细胞。</li>
		<li>于4 °C以600 × g离心5分钟，吸除上清液。</li>
		<li>进行胞内染色时，采用类似的染色步骤（与表面染色相同），但使用4 °C、1:10稀释的Perm/Wash缓冲液代替CSM来配制总染色体积，以确保细胞在整个胞内染色过程中始终处于透化环境中。</li>
		<li>将胞内抗体混合液加入已完成表面染色并透化的细胞沉淀中（步骤4.1.2–4.1.17）。将总染色体积调整为每个细胞样本50 μL。在4 °C孵育60分钟。每15分钟振荡样本一次，以确保染色均匀。</li>
		<li>在胞内染色期间，配制嵌入染料溶液：900 μL过滤PBS + 100 μL过滤的16% PFA（终浓度为1.6% PFA）+ 0.2 μL 500 uM嵌入染料（材料表）。</li>
		<li>用冷的1:10 Perm/Wash缓冲液补满细胞沉淀与胞内抗体混合液的管。</li>
		<li>于4 °C以600 × g离心5分钟，吸除上清液。用CSM补满染色管。计数并记录细胞数量。于4 °C以600 × g离心5分钟，吸除上清液。将细胞重悬于1 mL步骤4.9配制的嵌入染料溶液中。在室温孵育至少20分钟以完成嵌入，或在4 °C过夜（含嵌入染料溶液的样本可在4 °C保存最长1周后再上机进行质谱流式分析）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备细胞用于质谱流式仪分析。
	<ol>
		<li>向管中加入3 mL过滤的ddH2O，于4 °C以600 × g离心5分钟。将细胞重悬于3 mL过滤的ddH2O中。将此悬液通过100 μm滤膜，以去除可能堵塞质谱流式仪的碎片或聚集体。</li>
		<li>过滤后计数并记录细胞数量。于4 °C以600 × g离心5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用过滤的ddH2O将校准微球溶液（材料表）按1:10稀释，配制校准微球工作液。</li>
	<li>将染色后的细胞重悬于适量的1:10稀释校准微球溶液中，使细胞浓度达到约1 × 106 cells/mL。 
	注：对于CyTOF1（流速45 µL/min），推荐最佳浓度为5 × 105 cells/mL；对于Helios（流速30 µL/min），推荐最佳浓度为7.5 × 105 cells/mL。</li>
	<li>将样本上机进行质谱流式仪分析9。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍一种新颖的单细胞蛋白质组学方法，可同时评估多种免疫细胞类型，并在患者特异性的&#34;致病性&#34;外周血浆循环因子环境中检测其多种细胞因子的改变。该方法以外周全血作为分析载体，采用质谱流式细胞术作为评估免疫细胞表型及功能异常的工具。该方法可广泛应用于人类和小鼠研究21，并可与其他免疫功能分析方法兼容，例如检测信号转导异常14。
用户应了解多个可能影响本实验成功与否的变量。根据我们的经验，血液样本应在采集后2 h内进行处理，以避免细胞内细胞因子的基础水平被诱导升高（数据未显示）。在等待处理期间，血液样本应保持在室温（25 °C）。血液样本可采集至肝素钠或EDTA管中，均不会干扰本实验所描述的检测。活细胞与死细胞的区分可通过质谱流式细胞术使用顺铂进行评估22。然而，在上述方案中，假设血液样本在采集后立即（或2 h内）处理，因此省略了此项评估。此外，即使样本处理有所延迟，由于未进行冷冻保存，也可省略活/死细胞的区分步骤。然而，我们仍建...

自身免疫性疾病是导致发病率和死亡率升高的主要原因之一，影响着全球3%至8%的人口。在美国，自身免疫性疾病是年轻和中年女性（年龄&#60;65岁）的主要死亡原因之一1,2。自身免疫性疾病具有多样化的临床表现和复杂的免疫学基础机制。这种异质性在不同疾病中表现明显，例如类风湿关节炎（RA）中的关节受累和多发性硬化症（MS）中的神经系统病变。然而，这种异质性在同一疾病内部也同样显著，以系统性红斑狼疮（SLE）为例：部分患者表现为肾脏病理改变，而另一些患者则出现血液系统或关节受累3。
自身免疫性疾病的潜在免疫病理发生机制与临床异质性相似，涉及多种天然免疫和适应性免疫细胞亚群的自身活化与过度活化，以及同时发生的细胞因子产生失调。尽管细胞因子在自身免疫性疾病发病机制中起着关键作用，但明确其在疾病机制中的具体作用仍具挑战性。细胞因子具有多效性（一种细胞因子可对不同类型细胞产生多种效应）、冗余性（多种细胞因子可产生相同效应）、双向性（同一种细胞因子在不同条件下可发挥促炎或抗炎作用）以及可塑性（细胞因子的功能可根据环境被塑造为与其&#34;原始&#34;功能不同的作用）4,5,6。因此，基于群体水平的研究方法无法区分相同&#34;细胞因子环境&#34;下不同细胞的异质性反应。同样，仅关注免疫系统某一特定方面（单一细胞类型或细胞因子）的研究设计，也无法全面评估复杂自身免疫性疾病中所有相关组分的整体情况。尽管基于患者血清的研究为理解自身免疫提供了重要见解，但其无法确定所检测到的失调细胞因子的具体细胞来源。
最近，我们开发了一种单细胞蛋白质组学方法，可同时评估多种免疫细胞类型，并检测其在患者特异性微环境中的多种细胞因子变化 &#34;致病的&#34; 外周全血中循环的血浆因子。此处描述的工作流程采用完整的外周全血样本，而非分离的外周血单个核细胞（PBMCs）。外周全血是研究全身性免疫介导疾病最具生理相关性的样本类型，包括1）常参与自身免疫性疾病的非单个核血细胞即、中性粒细胞、血小板）以及2）血浆中的循环因子，如核酸、免疫复合物和具有免疫激活作用的细胞因子。为了捕获 &#34;内在致病性&#34; 细胞因子产生失调，血液样本在采集后立即处理（T0，零时），并在37 °C（生理体温）孵育6小时后处理（T6，6小时时），孵育过程中加入蛋白质转运抑制剂，且不添加任何外源性刺激条件，以检测细胞因子的产生（累积量，T6-T0），该结果可反映 &#34;内在的&#34; 疾病状态（图1）。为了研究反映与疾病相关的免疫应答信号通路过度或不足激活的失调过程，外周血样本在体外施加可模拟疾病发病机制的刺激条件（如系统性红斑狼疮（SLE）情况下的Toll样受体（TLR）激动剂T6 + R848，即在37 °C孵育6小时，并加入1 µg/mL R848的蛋白转运抑制剂），以检测可反映对核酸应答的细胞因子产生情况（比较T0、T6与T6 + R848组） 图1）。为了研究现有治疗药物的免疫调节作用 离体，针对特定患者的精确免疫失调过程，外周血样本在相应的治疗浓度下用JAK抑制剂处理（此处为5 uM芦可替尼；T6 + 5R，即6小时加5 uM芦可替尼），以检测其变化 &#34;内在的&#34; 药物处理下的疾病状态（T0 对比 T6 对比 T6 + 5R） 图1选择JAK抑制剂用于本研究，是因为JAK抑制剂在治疗类风湿关节炎（RA）等自身免疫性疾病方面已显示出良好的疗效。
为了同时评估上述在多种免疫细胞亚群中失调的过程，按照前述方法处理系统性红斑狼疮（SLE）患者和健康对照者的外周血样本，并通过质谱流式细胞术进行分析。质谱流式细胞术（又称飞行时间质谱流式术）可实现超过40个参数的单细胞分析，且无需担心光谱重叠问题。7,8,9该技术利用可溶性金属离子形式的稀土金属同位素作为标签与抗体结合，取代荧光染料。10. 有关质谱流式细胞技术平台的更多细节（即， 调谐与校准、样品采集）可在 Leipold 中找到 等 和 McCarthy 等11,12 质谱流式技术的高维度特性能够以单细胞分辨率同时检测天然免疫和适应性免疫细胞亚群中的多种细胞因子材料表).
目前常规的临床和实验室指标在检测持续存在的疾病活动或对特定免疫调节剂的反应时，往往缺乏足够的敏感性或特异性13，反映出有必要更清晰地界定导致病情 flare-up 的潜在免疫变化。鉴于细胞因子失调在自身免疫性疾病中的普遍存在，近年来涌现出大量治疗方法，这些方法采用抗体或小分子抑制剂靶向作用于细胞因子或参与细胞因子生成调控的信号蛋白。本研究所描述的外周血分析方法基本形式为识别自身免疫性疾病患者特异性的失调细胞亚群及其异常细胞因子产生提供了一个平台，尤其适用于具有全身表现的疾病。该方法可实现治疗方案的个体化，因为能够识别出特定的失调细胞因子，并可对相应的治疗方案进行测试 离体 以评估其调节患者特异性疾病进程的免疫调节能力。

<table><tbody><tr><td>鲁索利替尼</td><td>圣克鲁斯</td><td>SC-364729A</td><td>储备浓度：10 mM；终浓度：5 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>R848</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-r848-5</td><td>储备浓度：1 &amp;mu;克/&amp;mu;L；终浓度：1 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>LPS-EK</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-eklps</td><td>储备浓度：1 &amp;mu;g/&amp;mu;L；终浓度：0.1 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>无菌 PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>裂解/固定缓冲液</td><td>BD生物科学</td><td>558049</td><td>储存浓度：5X；终浓度：1X（用ddH2O稀释）</td></tr><tr><td>BD Phosflow 破膜/洗涤缓冲液 I</td><td>BD生物科学</td><td>557885</td><td>储存浓度：10X；终浓度：1:10（用ddH2O稀释）</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>21870-076</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠（NaN3）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8032</td><td>储备浓度： &gt;99.9%；终浓度：0.0002</td></tr><tr><td>蛋白质转运抑制剂（PTI）</td><td>eBiosciences</td><td>00-4980-93</td><td>储备浓度：500倍；工作浓度：1倍</td></tr><tr><td>DNA嵌 intercalator</td><td>Fluidigm</td><td>201192B</td><td>储备浓度：500 &amp;mu;M；终浓度：0.1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>细胞染色液</td><td></td><td></td><td>PBS + 0.5% BSA，0.02% NaN₃</td></tr><tr><td>MaxPar 条形码通透缓冲液</td><td>Fluidigm</td><td>201057</td><td>储备浓度：10X；终浓度：1X</td></tr><tr><td>20-plex Pd 条形码试剂盒</td><td>Fluidigm</td><td>S0014</td><td>储备浓度：不适用；终浓度：不适用</td></tr><tr><td>EQ &lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 四元素校准微球</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td>储备浓度：10X；终浓度：1X</td></tr><tr><td>16% 无甲醇甲醛溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>28908</td><td>储备浓度：16%（w/v）；终浓度：1.6%（w/v）</td></tr><tr><td>无菌圆底聚苯乙烯管</td><td>VWR</td><td>60818-496</td><td>储存浓度：不适用；终浓度：不适用</td></tr><tr><td>聚丙烯簇状管</td><td>Light Labs</td><td>A-9001</td><td>储备浓度：不适用；终浓度：不适用</td></tr><tr><td>Helios CyTOF 仪器</td><td>Fluidigm</td><td>Helios</td><td>用于CyTOF分析的所有溶液必须无金属污染。配制任何溶液所用的ddH2O电阻率应至少达到18.0 MΩ·cm。&amp;Omega;.cm. ddH2O 及任何自行配制的溶液应储存于未经高压灭菌的全新塑料瓶或玻璃瓶中。</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;用于质谱流式细胞术的抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;表面标志物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD1c</td><td>Biolegend</td><td>L161</td><td>质量：161</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD</td><td>UCHT1</td><td>质量：144</td></tr><tr><td>CD4</td><td>Biolegend</td><td>SK3</td><td>质量：174</td></tr><tr><td>CD7</td><td>BD</td><td>M-T701</td><td>质量：149</td></tr><tr><td>CD8</td><td>Biolegend</td><td>SK1</td><td>质量：142</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Fluidigm</td><td>ICRF44</td><td>质量：209</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>BD</td><td>B-ly6</td><td>质量：152</td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD</td><td>HI98</td><td>质量：115</td></tr><tr><td>CD14</td><td>Biolegend</td><td>M5E2</td><td>质量：154</td></tr><tr><td>CD16</td><td>eBioscience/Thermo</td><td>B73.1</td><td>质量：165</td></tr><tr><td>CD19</td><td>圣塔克鲁兹</td><td>SJ25C1</td><td>质量：163</td></tr><tr><td>CD21</td><td>Biolegend</td><td>Bu32</td><td>质量：141</td></tr><tr><td>CD27</td><td>BD</td><td>L128</td><td>质量：155</td></tr><tr><td>CD38</td><td>Fluidigm</td><td>HIT2</td><td>质量：172</td></tr><tr><td>CD45 总量</td><td>Biolegend</td><td>HI30</td><td>质量：89</td></tr><tr><td>CD45RA</td><td>Biolegend</td><td>HI100</td><td>质量：153</td></tr><tr><td>CD56</td><td>Miltenyi</td><td>REA196</td><td>质量：168</td></tr><tr><td>CD66</td><td>BD</td><td>B1.1/CD66</td><td>质量：113</td></tr><tr><td>CD86</td><td>Fluidigm</td><td>IT2.2</td><td>质量：150</td></tr><tr><td>CD123</td><td>Fluidigm</td><td>6H6</td><td>质量：143</td></tr><tr><td>CD278/ICOS</td><td>Biolegend</td><td>C398.4A</td><td>质量：156</td></tr><tr><td>CD179/PD1</td><td>Biolegend</td><td>EH12.2H7</td><td>质量：162</td></tr><tr><td>IgD</td><td>Biolegend</td><td>IA6-2</td><td>质量：146</td></tr><tr><td>IgM</td><td>Biolegend</td><td>MHM-88</td><td>质量：151</td></tr><tr><td>CXCR5</td><td>BD</td><td>RF8B2</td><td>质量：173</td></tr><tr><td>HLADR</td><td>Biolegend</td><td>L243</td><td>质量：167</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;细胞因子&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-1&amp;alpha;</td><td>Biolegend</td><td>364-3B3-14</td><td>质量：147</td></tr><tr><td>IL-1&amp;beta;</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>H1b-98</td><td>质量：169</td></tr><tr><td>IL-1RA</td><td>Santa Cruz&amp;nbsp;</td><td>AS17</td><td>质量：157</td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Biolegend</td><td>MQ2-13A5</td><td>质量：164</td></tr><tr><td>IL-8</td><td>BD</td><td>E8N1</td><td>质量：160</td></tr><tr><td>IL-12/IL-23p40</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>C8.6</td><td>质量：171</td></tr><tr><td>IL-17A</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>BL168</td><td>质量：148</td></tr><tr><td>IL23p19</td><td>eBioscience/Thermo</td><td>23dcdp</td><td>质量：176</td></tr><tr><td>MIP1&amp;beta;</td><td>BD</td><td>D21-1351</td><td>质量：158</td></tr><tr><td>MCP1</td><td>BD</td><td>5D3-F7</td><td>质量：170</td></tr><tr><td>IFN&amp;alpha;</td><td>Miltenyi&amp;nbsp;</td><td>LT27:295</td><td>质量：175</td></tr><tr><td>IFN&amp;gamma;</td><td>Biolegend</td><td>4S.B3</td><td>质量：165</td></tr><tr><td>PTEN</td><td>BD</td><td>A2B1</td><td>质量：159</td></tr><tr><td>TNF&amp;alpha;</td><td>Biolegend</td><td>Mab11</td><td>质量：166</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;注意&lt;/strong&gt;：若制造商标注为 Fluidigm，则该抗体为从 Fluidigm 购买的预偶联金属抗体；若制造商标注为 Fluidigm 以外的其他公司，则该抗体使用 MaxPar 多金属标记试剂盒自行偶联。&amp;nbsp; 试剂盒（Fluidigm 货号：201300），按照制造商说明书操作。&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过质谱流式细胞术对全外周血进行免疫表型和细胞因子产生的单细胞分析

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

细胞因子在自身免疫性疾病发病机制中发挥关键作用。因此，为阐明导致自身耐受破坏并引发自身免疫的精确机制，众多研究聚焦于细胞因子水平的检测。迄今为止的研究方法主要集中于免疫系统某一特定方面（单一或少数几种细胞类型或细胞因子），无法对复杂的自身免疫性疾病进行全局性评估。尽管基于患者血清的研究为理解自身免疫提供了重要见解，但无法确定所检测到的失调细胞因子的具体细胞来源。一种全面的单细胞方法可在多种免疫细胞亚群背景下评估细胞因子的产生情况， &#34;内在的&#34; 患者特异性的血浆循环因子在此进行描述。该方法能够监测患者特异性的免疫表型（表面标志物）和功能（细胞因子），无论是在其天然状态下 &#34;内在致病性&#34; 疾病状态，或存在治疗剂时（体内 或 离体).

图1 展示了外周血样本刺激与处理的工作流程，包括血液样本分装、刺激剂添加时间、蛋白转运抑制剂混合物的加入以及孵育时间，直至红细胞（RBC）裂解和固定。刺激剂的选择取决于所要评估的信号通路和细胞因子通路。例如，在本方案中，使用 Toll 样受体（TLR）激动剂来评估多种细胞类型的先天免疫感应机制。选取了代表性的细胞外激动剂（LPS，TLR4 激动剂）和内体激动剂（R848，TLR7/8 激动剂）。其他刺激剂包括佛波酯-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）和离子霉素（PMAIONO），二者可作为 T 细胞激活剂。此外，也可使用特定细胞因子以及其他特异性 B 细胞和 T 细胞抗原作为刺激剂。
为了展示本方案中所述的实验方法，图2、图3和...

本文介绍一种单细胞蛋白质组学方法，通过质谱流式细胞术分析外周全血样本中免疫表型及功能（细胞内细胞因子诱导）的变化。

细胞因子在自身免疫性疾病的发病机制中发挥着关键作用。因此，细胞因子水平的检测已成为多项研究的重点……

该方法有助于回答自身免疫研究领域中的问题，例如识别自身免疫性疾病背景下细胞频率的异常以及功能差异（如关键细胞因子的产生）。该方法的主要优势在于，能够从易于获取的外周血样本中，同时捕获广泛的细胞谱系或不同细胞类型及其功能差异。通常，初次接触该技术的研究人员可能在血液处理步骤的时间控制、抗体组合设计、条形码标记过程以及高维单细胞数据的分析方面遇到困难。这种系统免疫学方法特别适用于系统性红斑狼疮（SLE）等自身免疫性疾病，因为在这些疾病中，免疫失调广泛存在，并在外周血中表现明显。对该方法进行可视化演示，有助于明确各步骤的时间节点，同时展示在进行质谱流式细胞术分析之前，如何对多个样本进行条形码标记并混合。开始此操作时，将用于全血处理的五种不同条件的已标记圆底聚苯乙烯管放置在试管架上。接下来，向每根试管中加入 1 毫升 37 摄氏度的 RPMI 培养基。然后，向每根试管中加入 1 毫升全血，并上下吹打数次，以与 RPMI 充分混匀。随后，向标记为 T6+5R 的试管中加入 10 微升预稀释的芦可替尼，并充分混匀。将试管架放入37摄氏度的培养箱中，并开始计时孵育。处理T零样本时，用移液器将T零管中的全部内容物转移至含有20毫升工作浓度37摄氏度裂解/固定缓冲液的已标记锥形管中。为优化细胞回收率，用裂解/固定缓冲液冲洗试管，并通过倒置锥形管混合。将细胞在37摄氏度下孵育15分钟，以实现裂解和固定。随后，在室温下以500 × g离心5分钟。之后，倾去上清液，并将细胞重悬于1毫升预冷的PBS中，以充分分散细胞沉淀。然后，用 PBS 将锥形管补至 15 毫升体积。随后，在室温下以 500 × g 离心 5 分钟。用 1 毫升 CSM 重悬细胞，以充分分散沉淀。然后，将样品转移至已标记的微量离心管中，用于抗体染色。使用自动细胞计数器，取10 µL样品对细胞进行计数。接着，在室温下以500 ×g离心5分钟。随后，吸走上清液，使沉淀物中残留约 60 微升液体。将该沉淀物置于冰上，直至其他条件的样品完成处理。在 T 等于 30 分钟时，将试管架转移至组织培养操作台。向 T6 加 R848 管中加入 10 微升浓度为 0.1 克/微升的 R848，并充分混匀。然后，向 T6 加 LPS 管中加入 10 微升浓度为 0.01 微克/微升的 LPS，并充分混匀。随后，向标记为 T6、T6 加 5R 以及 T6 加 LPS 的管中各加入 4 微升蛋白转运抑制剂，并将样品放回培养箱，直至反应时间达到 6 小时。每两小时使用 P1000 移液器将样品充分混匀。在 T 等于 2 小时时，向 T6+R848 管中加入 4 微升蛋白质转运抑制剂混合液。混匀所有样品，并将试管架放回培养箱中，直至 T 等于 6 小时。在 T 等于 4 小时时，使用 P1000 移液器将样品再混匀一次。在 T 等于 6 小时时，按照 T 零样品的处理方法，处理 T6、T6 加 LPS、T6 加 R848 以及 T6 加五聚体 R 血样管。然后，将沉淀物保存在残留的 CSM 体积中，并于 -80 °C 下储存以备后续处理。为了对裂解并固定的细胞进行条形码标记，将样品从零下80摄氏度的储存条件下缓慢地在冰上解冻。用PBS将10倍浓度的条形码透化缓冲液按1:10稀释，并配制足够每份样品3毫升的缓冲液。取一个非无菌槽加入CSM，另一个加入1倍浓度的条形码透化缓冲液。然后，向 freshly thawed 样品中加入一毫升冰冻的 CSM，充分混匀，并转移至相应预标记的聚丙烯簇管中。取十微升样品，使用自动细胞计数仪进行细胞计数。通过去除多余细胞的体积，对每个簇管中的细胞数量进行归一化处理。然后，在室温下以600 × g离心细胞5分钟。使用多通道移液器将细胞重悬于1毫升1×条形码通透缓冲液中，并在室温下以600 × g再次离心5分钟。随后，吸除上清液。将簇管按照条形码对照表上所示的相同顺序排列在试管架上，以确保样本与其条形码相对应。使用多通道移液器向所有簇管中的样本加入800微升的一种X条形码通透缓冲液，注意不要触碰细胞沉淀，以减少细胞损失。然后将装有簇管的试管架置于一旁备用。从负20摄氏度取出20重钯条形码试剂盒的管条，在室温下解冻。加入100微升的一种X条形码通透缓冲液，充分混匀，然后将120微升重悬的条形码混合液转移至簇管中对应的细胞样品中。使用多通道移液器充分混匀，确保各单独条形码样品之间无交叉污染。将分选管在室温下孵育30分钟，使条形码标记细胞。30分钟后，在室温下以600 × g离心5分钟。吸除上清液，然后将沉淀重悬于1 mL CSM中。随后，离心并再次用CSM重悬。然后在室温下以600 × g离心5分钟，吸除上清液。使用同一枪头，通过单通道移液器将所有细胞沉淀连同约70至80微升的残留液体转移至一个聚苯乙烯管中。不要弹出移液器吸头。将带有此吸头的单通道移液器放置一旁。使用多通道移液器及新的吸头，向每个原始细胞簇管中加入 100 µL CSM，以最大化细胞回收率。使用之前预留的带吸头的单通道移液器，将所有细胞沉淀连同100微升残留液体转移至同一个聚苯乙烯管中。加入CSM培养基，使聚苯乙烯管中的总体积补至约3毫升。计数并记录混合条形码细胞组的细胞数量。然后，在室温下以600 × g离心5分钟，并吸除上清液。在同一天内继续对带有条形码的样本进行染色。该示意图展示了外周血样本的刺激与处理流程，包括血液样本分装、刺激剂、蛋白质转运抑制剂混合物的添加时间点，以及直至红细胞裂解和固定前的孵育时间。刺激剂的选择取决于所要评估的信号通路和细胞因子通路。固定并裂解红细胞后，来自健康供体的各个裂解并固定的细胞样本进行条形码标记，用26种针对表面标志物的抗体标记，透化后用14种针对细胞因子的抗体进行染色。此处展示的是用于鉴定CD14高表达单核细胞的简化设门策略。从左到右，每个二维图代表来自父代群体的一个子集，该子集是通过左侧相邻二维图的设门分析得到的。以CD14高表达单核细胞为例，在八个免疫细胞亚群中，对健康供者在零时间点未刺激以及经TLR激动剂LPS和R848及T细胞激活剂PMA-离子霉素刺激后的外周血样本进行了质谱流式细胞术分析。图中展示了CD14高表达单核细胞中细胞因子诱导表达的一个示例，并显示了针对所用刺激剂具有特异性的部分细胞因子。R848 可选择性地在 CD14 高表达的单核细胞中诱导 IL-12p40 亚基和 MCP1 的产生，而 LPS 则不能。相反，PMA 离子霉素不能在 CD14 高表达的单核细胞中诱导细胞因子的产生。一旦掌握，血液刺激实验约需七小时完成，条形码标记步骤则仅需约一小时即可完成。在进行该实验操作时，需特别注意各步骤的时间安排，并提前做好相应规划。一旦掌握了该操作流程，便可考虑调整质谱流式面板中的血液刺激条件，以评估与您自身研究目标相关的特异性免疫细胞反应。观看本视频后，您应能够充分理解如何从全血样本中诱导细胞因子反应，以及如何将多个样本合并为一组带有条形码的样本集，用于质谱流式分析。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

大鼠外周全血细胞免疫表型和因子生成的单细胞分析

在本报告中，我们展示了在新鲜全血上进行表型分析实验的染色与分析步骤，以计数主要的天然免疫和适应性白细胞群体。我们重点强调了在多中心临床试验背景下开展这些操作时的注意事项。...

使用全血表型分析法对多中心临床试验中主要外周血白细胞群体进行计数

本文描述了对CyTOF质谱流式细胞仪进行日常校准和性能优化所必需的步骤，并讨论了样品制备和流速优化的相关建议。...

质谱流式细胞术：在CyTOF质谱流式细胞仪上进行日常校准与细胞样本检测的操作方案

本视频展示了一种基于流式细胞术的技术，使用两种荧光染料对人类外周血单个核细胞（PBMCs）中的 CD4+ 和 CD8+ T 细胞、γδ T 细胞、B...

一种用于鉴定外周血单个核细胞中免疫细胞亚群的流式细胞术检测方法

本视频介绍了一种单细胞蛋白质组学方法，该方法采用与重金属偶联的抗体对不同细胞进行独特的条形码标记。随后，通过免疫染色和质谱流式细胞术，评估人全血来源免疫细胞的免疫表型及功能变化。...

一种用于免疫细胞表型与功能特征分析的条形码检测方法

全血免疫表型分析对于监测人体免疫系统至关重要。然而，所需试剂种类繁多，且预混染色抗体组合中某些荧光染料稳定性较差，因此需要每日重新配制试剂。本文表明，采用半自动化方式配制染色抗体混合液可减少试剂分配过程中的变异，从而建立更为可靠的免疫表型分析方法。...

一种半自动化制备抗体混合物用于人外周血免疫表型分析的方法

本文介绍了用于质谱流式细胞术分析的样本采集与处理方法。...

质谱流式细胞术分析的样本制备

批量基因表达检测会掩盖异质性细胞群体中单个细胞的差异。本文介绍了一种将单细胞基因表达分析与基于荧光激活细胞分选（FACS）的索引分选相结合的实验方案，可用于解析细胞异质性，并在分子水平上对免疫表型不同的细胞亚群进行特征鉴定。...

一种用于表征人类干细胞与祖细胞群体分子及免疫表型异质性的组合式单细胞方法

本文介绍了一种通过全血流式细胞术对单核细胞亚群进行表征的实验方案。内容包括如何设门圈定各亚群、检测其表面标志物的表达水平，并以检测M1型（促炎）和M2型（抗炎）标志物的表达为例进行说明。...

通过全血流式细胞术分析表征人单核细胞亚群

本文介绍了一种处理从小鼠或人新鲜骨髓（BM）中分离的中性粒细胞谱系细胞的实验方案，用于高维质谱流式细胞术（飞行时间质谱流式细胞术，CyTOF）分析。...

中性粒细胞谱系细胞的全骨髓样本制备用于质谱流式分析

本方案概述了一种全面的质谱流式细胞术（飞行时间质谱流式细胞术...

肝细胞癌中系统性与局部免疫应答的质量细胞术分析

本方案描述了从新生儿和儿科患者中采集和保存血液样本的方法，并应用单细胞RNA测序（scRNA-seq）、蛋白质组学和光谱流式细胞术对这些样本中的免疫细胞群体进行表征。...

以最少样本量绘制婴儿免疫图谱：整合性单细胞与多组学分析

了解大鼠外周全血单细胞蛋白质组学分析方法，利用质谱流式细胞术评估免疫细胞表型与细胞因子生成功能。该技术适用于自身免疫疾病研究，可识别细胞频率异常及功能差异。

通过质谱流式细胞术对全外周血进行免疫表型和细胞因子产生的单细胞分析

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