心脏外免疫细胞的分离与鉴定

不同形式的心肌应激或损伤, 包括缺血性 (缺血再灌注或心肌梗死) 和非缺血性 (高血压或心肌炎), 促进炎症细胞的招募与修复和保护, 但也致病性。早在 1891, 龙贝格首先描述了感染斑疹伤寒和猩红热¹患者心肌细胞浸润的存在。然而, 对心脏免疫细胞的详细研究需要发展更先进的免疫分型技术。因此, 直到最近我们才开始了解到, 在稳定状态下, 具有重要维护作用的免疫细胞的不同种群驻留在心肌内。

组织学一直是, 而且仍然是最常用的方法来表征心脏免疫细胞在炎症。然而, 虽然组织学是一个有价值的诊断工具, 它在心脏免疫细胞研究中的应用有重要的局限性。驻留在心肌中的免疫细胞占总细胞的很小比例, 或多或少分布在一个比例巨大的空间中。同样, 几种形式的心脏炎症, 如病毒性心肌炎, 显示炎症的焦点模式。这意味着对心脏的免疫系统的准确分析往往需要更高的组织学取样, 增加成本, 以减少偏见。此外, 组织学在细胞识别中提供了非常有限的可用信息 (如参数数目)。随着越来越多的细胞子集需要使用多个表达标记 (包括表面标记, 转录因子或分泌分子), 流式细胞术已经建立了自己作为最强大的工具, 免疫分型,由于低成本和高吞吐量。

免疫分型技术的使用是密切依赖于开发高效的消化协议, 允许对大量细胞的单细胞分析。细胞提取的穷尽性协议的发展为心脏免疫学研究开辟了新的机遇之窗。通过消化、流式细胞术和转录组学的结合, 在心脏中的巨噬细胞和树突状体细胞的主要种群特征为^2、3。最丰富的心脏免疫细胞在稳定状态是 CD64⁺MerTK⁺巨噬细胞, 可进一步分裂的基础上, 其表达 CCR2 或 CD11c²。CCR2⁺巨噬细胞起源于成人骨髓造血, 而大多数 CCR2 巨噬细胞, 可以表达高或低的 MHC II, 主要是产前起源。巨噬细胞执行关键功能, 如修复⁴和清除碎片⁵在伤害或支持电连接⁶稳定状态。在不同的炎症形式期间 Ly6C 的一个重要汇集 CD64^int单核细胞发生, 以后区分成 Ly6C^hi CCR2⁺巨噬细胞^2,7.一个明显较小, 但重要的是, 居住在健康个体的心肌细胞的数量是由树突状细胞^8,9组成。心脏常规 DCs (招揽) 的两个主要子集最近的特点是: cDC1 (CD103⁺ dcs) 和 cDC2 (CD11b⁺ dcs)。DCs 在抵御感染方面起着重要作用⁸ , 但也可以促进炎症期间的自我伤害, 特别是在心肌梗塞⁹期间。

在这里, 我们描述了一个简单的方法来隔离的存活的心脏免疫细胞的小鼠心肌。该方法结合酶和机械消化与细胞过滤过滤, 以获得一个单一的细胞悬浮, 可以分析, 或进一步纯化, 通过流式细胞仪分类或磁珠浓缩。准确测量外心肌细胞需要心脏灌注, 以消除可能的污染物从血液中的心脏微血管。此外, 我们提出了一个可选的步骤, 免疫细胞的血管内标记, 可用于进一步区分心肌细胞从血管内污染物, 根据 Galkina等¹⁰号议定书。最后, 我们提出了一个基本的流式细胞分析, 以确定主要巨噬细胞和 cDC 亚人口。

伦理声明: 本议定书已由大学卫生网 (加拿大多伦多) 动物保育委员会审查和批准, 并符合加拿大动物保育理事会的规定。

1. 缓冲准备

1. 准备 HBB 缓冲液 (汉克的平衡盐溶液 (HBSS), 2% 热灭活牛血清, 0.2% 牛血清白蛋白)。添加10毫升的热灭活牛血清和1克牛血清白蛋白到500毫升的 HBSS。过滤器消毒通过0.2 µm 过滤器和存储在4摄氏度。
2. 制备血液学缓冲剂 (磷酸缓冲盐水 (PBS), 2% 热灭活牛血清, 1 毫米乙二胺乙酸 (EDTA, pH 值 8.0))。添加10毫升热灭活牛血清和1毫升0.5 米 EDTA 到500毫升的 PBS。过滤器消毒通过0.2 µm 过滤器和存储在4摄氏度。
   注: 解决方案可存储在摄氏4摄氏度, 长达1月。

2. 循环白细胞的标签

1. 灌装制备抗小鼠 CD45 注射液, 1 µg 的抗体稀释在无菌磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中, 最终注射量为200µL/小鼠。将体积装入28.5G 胰岛素注射器中, 远离光线。
   注: 使用两种不同的 fluorochrome 标记的 anti-CD45 抗体, 以区分血管内 (染色通过静脉注射管理) 从心内染色 (染色后消化; 见步骤 4)。
2. 预热小鼠 (8–12周), 通过将尾部暴露在一盏红色的热灯上5分钟。
   注意: 不要使动物过热。把灯保持在安全的距离 (> 30 厘米)。
   1. 使用适当的设备来抑制胸骨位置上的动物。用拇指和无名指将尾部的底部与食指、中指和尾部的中远端区域固定, 以非显性手暴露和稳定尾部。
      注意: 不要在尾部的尖端施加太多的力, 因为皮肤可以被拔掉。插入针与斜面朝上的静脉。始终保持针平行的静脉在任何时候, 因为它是容易穿刺静脉。
      注: 血液进入注射器可能会发生, 是一个良好的注射迹象。将针弯曲到90°角度可以促进静脉的管理。与您的安全办公室确认, 弯曲的针头可能代表危险。
   2. 静脉注射200µL 静脉入尾脉。液体应该容易地流动并且临时地清除静脉。
      注意: 如果遇到阻力, 不要强迫流体。这是针错位的迹象。
   3. 允许抗体在人道 euthanizing 老鼠之前循环5分钟。

3. 心脏隔绝和消化

1. 弄死小鼠使用 CO₂或由其他体制上接受的安乐死做法。
   1. 对于共₂安乐死, 将鼠标放置在 co₂腔内, 并将填充速率设置为每分钟室容积的 20% (即,如果分庭为10升, 则填写2升/分钟)。运行2分钟和监控鼠标, 直到呼吸停止。
   2. 关闭 CO₂ , 并将鼠标留在另外的1-2 分钟内. 确保在打开房间前停止呼吸, 并在开始处理鼠标前进行脚趾捏以确认鼠标已死。
2. 用70% 乙醇喷洒老鼠。抬起腹部的皮肤, 并解剖鼠标沿腹中线开始在臀部的水平到胸骨。打开腹部并移动肝脏以暴露隔膜。
3. 切开隔膜, 然后在中线两侧的肋骨, 小心避免刺穿肺部和心脏。
   1. 通过剥离肋骨来暴露心脏, 然后先切开左心房, 然后右心房。
      注意: 在切开心房时要小心, 确保没有动脉或静脉受伤, 因为这样可以降低器官中的血液冲洗效率。
   2. 灌注的心脏与15–20毫升的冷 pbs 使用60毫升注射器装有21克针和冷 pbs。用镊子轻轻地抓住心脏的底座, 将针插入靠近顶端的左心室。在右心室重复这个过程。适当的注射会导致白肺和苍白的肝脏。
      注: 应在安乐死后5分钟内进行灌注, 以避免血液凝固, 这可能会污染器官与循环细胞的利益。
4. 用镊子握住心脏的底座, 轻轻地拉起心脏, 然后通过切断主要的肺动脉和静脉、主动脉和心包袋来分离心脏。
   1. 用干净的无绒纸巾轻轻地握住拇指和食指之间的心脏, 用镊子将主要动脉和静脉的心房和残余物拉出来, 将心脏清洁。
      注: 确保心房全部被移除, 没有其他组织, 如肺或血管, 因为这些组织有自己的免疫细胞。特别是肺有一个大的免疫细胞的人口, 可以掩盖的小群体的人在心肌。
5. 把心脏放在一个5厘米的塑料盘子里, 用50µL 的冷 PBS。
   1. 用弯曲的解剖剪刀切碎心脏, 直到没有可见的碎片, 它有平滑的一致性。
      注意: 在切的过程中尽量保持心脏在盘子的一个包含区域, 以减少组织损失。
   2. 用弯曲钳将 thetrituratedheart 组织移植到2毫升离心管中, 800 µL 冷 Dulbecco 的改性鹰培养基 (DMEM)。
6. 添加 450 u/毫升 ofcollagenase i, 60 u/毫升的透明质酸酶类型的 i S, 和 60 U/毫升的 DNase i 对每个样品。
   1. 在37摄氏度的摇摆振动筛上孵化样品, 在 50 rpm 45–60分钟。
7. 在消化之后, 简要地漩涡样品 (二十年代) 和立刻放置在冰保持样品在4°c。
   1. 使用1毫升 pipettor, 吸管的样品向上和向下, 直到组织样本是均匀的, 并没有堵塞的吸管尖端。
      注: 定义特定次数的吸管可能会增加重现性。如果心脏没有得到最佳的消化, 部分心肌可能会阻碍吸管。轻轻研磨的吸管尖端对离心管将有助于融汇更大的组织。
8. 预湿40µm 细胞过滤器放置在50毫升圆锥管与1毫升的冷 HBB。
   1. 将匀质样品添加到过滤器中, 通过缓慢浇注12–14毫升的冷 HBB 来洗涤。
   2. 将经过过滤的样品转移到标签为15毫升的锥形管上, 保持在4摄氏度。
9. 离心机样品在 400 x g 5 分钟在4摄氏度。吸出上清。
   1. 溶解红细胞通过增加1毫升的氯化铵-钾 (ACK) 裂解缓冲到每个样品。并用重悬样品涡流, 室温孵育5分钟。
   2. 一旦溶解完成, 添加5–8毫升的冷汉克的平衡盐溶液 (HBSS), 以防止溶血。
10. 离心机样品在 400 x gfor 5 分钟在4°c。吸出上清。
11. 在每个样品中添加1毫升的流化器缓冲器, 并将其转移到标签为1.5 毫升的离心管。
    注意: 该协议可以在这里暂停多达2小时, 样品存储在4摄氏度。

4. 流式细胞仪染色及分析

1. 离心机样品在 400 x g 5 分钟在4摄氏度。
   1. 为了减少非特异性抗体的结合, 稀释 1:100 anti-CD16/CD32 和单核细胞阻滞剂 (1:20) (见材料表) 核算每样的50µL。室温孵育15分钟。
   2. 准备抗体稀释 (每种抗体的 1:250) 核算每个样品的50µL。
      注: 可将活性染料纳入抗体鸡尾酒中, 以排除死细胞。或者, 可以使用流分析的小尺寸排除 (图 1C和D)。
   3. 没有洗涤, 添加50µL 抗体主混合到每个样本和混合。
   4. 在黑暗中孵化4摄氏度的样品, 30 分钟。
2. 在每样样品上加600µL, 以 400 x克为5分钟, 在4摄氏度处冲洗和离心样品。
3. 在300µL 中吸取上清和并用重悬颗粒。在黑暗中保持样品在4摄氏度。
   注: 一些活性染料, 如 DAPI, 需要在运行流式细胞术前10分钟内染色。
4. 通过流式细胞术 (见图1和 2) 在未来3小时内进行分析。如果需要较长的时间, 建议使用低浓度多聚甲醛 (PBS 0.5–1%) 进行短期固定, 以保持染色。
   注: 强烈建议在启动流式细胞仪分析前, 通过40µm 细胞过滤器筛选样品, 以防止射流技术的流量。

到目前为止, 还没有一个好的方法可以隔离其他心脏细胞成分, 如心肌细胞。因此, 流式细胞术对心脏单细胞悬浮液的分析需要用 CD45 预浇来识别免疫细胞的数量, 其次是单细胞和小尺寸排斥门 (图 1a)。或者, 可以执行生存性染色, 以排除死细胞。小尺寸排除和活性染料染色表示几乎等同于排除死细胞的方法 (图 1B和1D)。强烈建议在消化过程后不久进行抗体染色, 并始终保持细胞悬浮在4摄氏度, 因为细胞的生存能力可能会衰退。这个过程通常产生关于80–90% 的可行免疫细胞。

心肌有不同的免疫细胞群, 其中许多仍有待于鉴定和鉴定。被确定为 CD64+细胞的巨噬细胞是心脏的主要免疫群体, 代表所有免疫细胞的 60–70% (图 1C, 顶端)。成年小鼠心脏的消化率约为 3–5 x 104巨噬细胞, 这取决于心脏的大小。心肌巨噬细胞可以进一步细分的基础上, 他们的 CD11c 或 CCR2 的表达和他们的 MHC-II.2的水平。

其他具有良好特征的心脏免疫亚群是传统的树突状细胞。常规 DCs 是 CD64细胞, 表达中间到高级别的 MHC II 和高水平的 CD11c (图 1C, 底部)。这些细胞可以根据它们的 CD103 或 CD11b8,9的表达方式进一步分化。与巨噬细胞相比, DCs 代表的心脏亚群要小得多。成年小鼠心脏的消化率在每个子集的150和 500 dc 之间产生。

在确定心肌内的免疫细胞数量时, 心脏与冷 PBS 的灌注是必不可少的。然而, 不完善的灌注可能增加样本中的血管内污染物的数量, 导致重要的偏见, 可以根据周围的变化 (血液), 而不是改变的心脏浸润。在这些情况下, 荧光标记的 anti-CD45 抗体的血管内管理, 标签所有的免疫细胞循环通过宏观和微血管 (图 2A), 可以帮助区分心肌细胞从血管内污染物。图 2B显示了一个不完全灌注心脏的例子, 其中20% 的免疫细胞是血管内污染物。重要的是, 这种水平的污染对巨噬细胞和 DC 分析没有什么影响, 因为它们很少在血液中发现 (图 2D)。

使用流式细胞术的单个细胞悬浮心肌允许研究的小亚群的心脏。例如, 转录因子 BATF3 的不足已被证明, 以防止发展成熟的 CD103+ DCs 在几个组织11。为了研究这种情况是否也适用于心肌, 用流式细胞仪对8–15周老 BATF3-deficient 或控制窝 (C57BL/6 背景) 中的心脏细胞单细胞悬浮液进行了分析。由于小的人口规模和数量的标记需要区分 DC 子集, 组织学无法提供足够的权力, 分析, 以达到一个明确的答案。然而, 使用流式细胞仪分析比较野生型与 Batf3鼠心肌的免疫细胞, CD103+ DCs 的缺乏可以在后者中得到证实 (图 3a 和 B)。此外, 我们观察到, BATF3-deficiency 并没有显著改变其他心脏种群的组成 (图 3C 和 D)。这些结果表明, 利用这种酶法和机械消解相结合的方法, 可以达到单细胞悬浮的敏感性程度。

图 1: 心脏巨噬细胞和 DCs 的门控策略.用流式细胞仪对 C57BL/6 小鼠离体心脏进行了消化, 并对单细胞悬浮液进行了分析。(A) CD45+ 活单线心细胞的门控。使用 CD45 标记来识别心脏单细胞匀浆中的免疫细胞, 其中包括非常高水平的非免疫细胞 (即,心肌细胞、内皮干细胞和成细胞)。通过比较 ssc-h 与 ssc (双峰) 和 fsc a 的对比, 排除了它。注: 任何其他的对比, ssc a, ssc h 和 ssc-w 或 fsc, fsc-h 和 fsc-w 是同样有用的。活细胞的选择可以通过排除非常小的细胞 (SSC-h 与 FSC-h 门) 来执行。(B) 使用大小与生存能力染色 (DAPI) 比较死细胞排斥现象。(C) 确定心脏巨噬细胞 (CD11b+ CD64+细胞) 和 DCs (CD64- MHC II. CD11c+) 的门控策略.心肌巨噬细胞可以根据其表达的 MHC II 和 CD11c 进一步分类. 根据 CD103 或 CD11b 的表达, 可以对心脏 DCs 进行细分. (D) 巨噬细胞和 DC 内 DAPI + 死细胞的代表性地块隔间小尺寸排除。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: 血管内细胞污染物的标签.(A) 对 anti-CD45 抗体治疗 (红) 或未治疗 (蓝) 小鼠的血中性粒细胞和 Ly6Chi单核细胞血管内 CD45 标签进行比较。(B) 通过血管内 CD45 标签确定心脏准备中的血管内污染物。(C) 有代表性的心肌和血管内细胞流动图。(D) anti-CD45 静脉注射后在巨噬细胞和 DC 车厢内标记细胞的代表性地块。请注意, 巨噬细胞和 DCs 完全外。血管内污染物通常为淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞2。请单击此处查看此图的较大版本.

图 3: BATF3-deficient 小鼠心肌巨噬细胞和 DCs 的定量.(A) Batf3和Batf3鼠心脏 DCs 的典型流动图。(B) 对Batf3和Batf3鼠心脏 DCs 进行量化。注意在Batf3小鼠中没有 CD103+ DCs。(C和D) Batf3和Batf3鼠心肌巨噬细胞 (MF) 的定量。误差线代表 SEM. 红色符号代表个体动物。请单击此处查看此图的较大版本.

作者没有什么可透露的。