本方案介绍了一种简单高效的方法，用于在稳态或炎症状态下从小鼠心肌中分离、鉴定和定量免疫细胞。该方案结合了酶消化和机械消化，以制备单细胞悬液，并可进一步通过流式细胞术进行分析。
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本文内容
摘要
摘要
免疫系统是健康心脏的重要组成部分。心肌组织在稳态及不同类型炎症状态下均存在多种免疫细胞亚群，且具有功能上的区室化分布。以往对心脏免疫细胞的研究依赖显微镜观察或尚不完善的组织消化方案，这些方法在严重炎症时具有足够的灵敏度，但在稳态条件下难以可靠地鉴定数量较少却关键的细胞群体。本文介绍一种简便的方法，通过血管内注射荧光标记抗体以区分不可避免的少量血管内细胞污染，随后结合酶消化（胶原酶、透明质酸酶和DNA酶）与机械法对小鼠心脏进行消化处理。该方法可获得单细胞悬液，其中细胞具有活性，可用于流式细胞术进行鉴定、表型分析和定量；也可进一步通过荧光激活细胞分选或磁珠分离法纯化，用于转录分析 体外 研究。我们提供了一个逐步进行流式细胞术分析的示例，用于区分心脏中主要的巨噬细胞和树突状细胞群体。对于中等规模的实验（10个心脏），完成该操作流程需要2–3小时。
引言
不同形式的心肌应激或损伤，包括缺血性（如缺血再灌注或心肌梗死）和非缺血性（如高血压或心肌炎），均可促进具有修复和保护作用、同时也具有致病性的炎性细胞的募集。早在1891年，Romberg首次描述了伤寒和猩红热患者心肌中存在细胞浸润1。然而，对心脏免疫细胞的深入研究需要更先进的免疫表型分析技术的发展。因此，直到最近，我们才开始认识到在稳态条件下，心肌内存在一群多样化的免疫细胞，它们在维持心脏正常功能中发挥着关键作用。
组织学一直是表征心脏炎症期间免疫细胞的最常用方法，至今仍是如此。然而，尽管组织学是一种有价值的诊断工具，但在研究心脏免疫细胞时仍存在重要局限性。驻留在心肌中的免疫细胞仅占总细胞数的极小比例，并且在相对巨大的空间中或多或少均匀分布。同样，多种类型的心脏炎症（如病毒性心肌炎）呈现出局灶性炎症模式。这意味着对心脏免疫系统的准确分析通常需要更高程度的组织学取样，从而增加成本以减少偏差。此外，组织学在细胞鉴定中所能提供的可用信息非常有限（例如 参数数量）。随着需要使用多种表达标志物（包括表面标志物、转录因子或分泌分子）来鉴定的细胞亚群不断增加，流式细胞术因其低成本和高通量，已成为免疫表型分析最强大的工具。
免疫表型分析技术的应用在很大程度上依赖于高效消化方案的发展，这些方案使得对大量细胞进行单细胞分析成为可能。全面的细胞提取方案的建立，为心脏免疫学研究开辟了新的机遇。通过结合组织消化、流式细胞术和转录组学分析，研究人员已对心脏中主要的巨噬细胞和树突状细胞群体进行了表征2,3。在稳态条件下，心脏中数量最多的免疫细胞群体是CD64+MerTK+巨噬细胞，该群体可根据其是否表达CCR2或CD11c进一步细分2。CCR2+巨噬细胞来源于成年骨髓造血，而大多数CCR2-巨噬细胞主要起源于产前阶段，其可表达高水平或低水平的MHC-II。巨噬细胞在稳态下支持电传导连接6，在损伤期间则发挥关键功能，如组织修复4和清除细胞碎片5。在不同类型炎症过程中，会出现大量Ly6ChiMHC-IIloCD64int单核细胞的浸润，随后这些单核细胞分化为Ly6ChiCCR2+巨噬细胞2,7。在健康个体的心肌中，还存在一个数量相对较少但十分重要的细胞群体——树突状细胞8,9。近期研究已明确心脏中两种主要的传统树突状细胞（cDCs）亚群：cDC1（CD103+ DCs）和cDC2（CD11b+ DCs）。树突状细胞在抵御感染中发挥重要作用8，但在炎症过程中也可能促进自身组织损伤，尤其是在心肌梗死期间9。
本文介绍一种从鼠类心肌中分离活的心脏免疫细胞的简单方法。该方法结合了酶消化和机械消化，并通过细胞筛过滤，以获得可用于流式细胞术分选或磁珠富集分析的单细胞悬液。准确检测心肌血管外细胞需要进行心脏灌注，以清除心脏微血管系统血液中可能存在的污染细胞。此外，我们还提供了一步可选的血管内免疫细胞标记步骤，该步骤基于Galkina et al. 的方案10，可用于进一步区分心肌细胞与血管内污染细胞。最后，我们展示了一种基础的流式细胞术分析方法，用于鉴定主要的巨噬细胞和经典树突状细胞（cDC）亚群。
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方案
伦理声明：本方案已通过大学健康网络动物护理委员会（加拿大安大略省多伦多市）的审查与批准，符合加拿大动物护理委员会的规定。
1. 缓冲液配制
- 配制 HBB 缓冲液（Hank's 平衡盐溶液 (HBSS)，2% 热灭活牛血清，0.2% 牛血清白蛋白）。将 10 mL 热灭活牛血清和 1 g 牛血清白蛋白加入 500 mL HBSS 中。经 0.2 µm 滤膜过滤除菌，4 °C 保存。
- 配制 FACS 缓冲液（磷酸盐缓冲液 (PBS)，2% 热灭活牛血清，1 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA, pH 8.0)）。将 10 mL 热灭活牛血清和 1 mL 0.5 M EDTA 加入 500 mL PBS 中。经 0.2 µm 滤膜过滤除菌，4 °C 保存。
注意：溶液可在 4 °C 保存最多 1 个月。
2. 循环白细胞的标记
- 无菌条件下，将 1 µg 抗小鼠 CD45 抗体溶于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制注射液，每只小鼠注射体积为 200 µL。将液体吸入 28.5G 胰岛素注射器中，并避光保存。
注意：使用两种不同荧光染料标记的抗 CD45 抗体，以区分血管内（通过静脉注射标记）与心脏内染色（消化后标记；见步骤 4）。 - 通过将小鼠（8–12 周龄）尾部暴露于红色加热灯下 5 分钟，进行预热。
警告：避免动物过热。保持灯与小鼠之间安全距离（>30 cm）。- 使用适当的固定装置将动物以胸卧位固定。用非优势手暴露并稳定尾部，以食指和中指固定尾根部，拇指和无名指固定尾部中远端。
警告：避免在尾尖施加过大压力，以防皮肤被拉脱。将针头斜面朝上插入静脉。操作过程中始终保持针头与静脉平行，以免刺穿静脉。
注意：若血液进入注射器，表明注射成功。将针头弯曲成 90° 角可能有助于静脉注射。请咨询安全办公室，因弯曲针头可能存在安全隐患。 - 通过尾静脉静脉注射 200 µL 液体。液体应顺畅流动，并暂时使静脉变透明。
警告：若遇阻力，切勿强行推注液体。这表明针头位置不当。 - 抗体循环 5 分钟后，人道处死小鼠。
- 使用适当的固定装置将动物以胸卧位固定。用非优势手暴露并稳定尾部，以食指和中指固定尾根部，拇指和无名指固定尾部中远端。
3. 心脏分离与消化
- 使用 CO₂ 处死小鼠2 或其他机构认可的安乐死程序。
- 对于 CO2 安乐死，将小鼠放入 CO2 腔室并设置填充速率为每分钟腔室体积的20%（即， 如果腔室为10 L，则以2 L/min的速度填充。运行2分钟，并监测小鼠直至呼吸停止。
- 关闭 CO2 再将小鼠放置1-2分钟。在打开舱室前，确保呼吸已停止，并进行足趾挤压以确认小鼠死亡，然后继续处理小鼠。
- 用70%乙醇喷洒小鼠。提起腹部皮肤，从髋部水平沿腹侧中线向上至胸骨处剪开，解剖小鼠。打开腹腔，移开肝脏以暴露膈肌。
- 剪开膈肌，然后沿中线两侧剪断肋骨，注意避免刺破肺和心脏。
- 通过推开肋骨暴露心脏，然后先剪开左心房，再剪开右心房。
注意：切开心房时需谨慎操作，确保不损伤任何动脉或静脉，以免影响器官内血液冲洗的效率。 - 用60 mL注射器连接21 G针头并装入冷PBS，以15–20 mL冷PBS灌注心脏。用镊子轻轻夹住心脏基底部，在心尖附近将针头插入左心室。重复此操作于右心室。灌注成功时，肺呈白色，肝脏颜色变浅。
注意：为避免血液凝固导致循环细胞污染目标器官，灌注应在安乐死后5分钟内进行。
- 通过推开肋骨暴露心脏，然后先剪开左心房，再剪开右心房。
- 用镊子夹住心脏基部，轻轻向上提起心脏，然后剪断主要的肺动脉和肺静脉、主动脉以及心包囊，将心脏摘除。
- 用干净的无绒纸巾轻轻捏住心脏的拇指和食指之间，用镊子去除心房、主要动静脉残余及其他污染物，以清洁心脏。
注意：确保完全去除心房组织，且不残留肺或血管等其他组织，因为这些组织含有各自独立的常驻免疫细胞。尤其是肺组织含有大量免疫细胞，可能掩盖心肌内数量较少的免疫细胞群体。
- 用干净的无绒纸巾轻轻捏住心脏的拇指和食指之间，用镊子去除心房、主要动静脉残余及其他污染物，以清洁心脏。
- 将心脏置于盛有50 µL冷PBS的5 cm塑料培养皿中。
- 使用弯头解剖剪将心脏切碎，直至无可见块状组织，呈均匀细腻的质地。
注意：切碎心脏时，尽量将其保持在培养皿的有限区域内，以尽量减少组织损失。 - 使用弯头镊子将匀浆后的心脏组织转移至含有800 µL冷的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）的2 mL微量离心管中。
- 使用弯头解剖剪将心脏切碎，直至无可见块状组织，呈均匀细腻的质地。
- 向每个样品中加入 450 U/mL 胶原酶 I、60 U/mL 透明质酸酶 I-S 和 60 U/mL DNase-I。
- 将样品置于37 °C摇床中，以50 rpm转速振荡孵育45–60分钟。
- 消化后，短暂涡旋振荡样品（20 秒），立即置于冰上，保持样品温度为 4 °C。
- 使用1 mL移液器，将样品上下吹打至组织样品均匀且不堵塞移液器吸头为止。
注意：明确移液次数可提高实验的可重复性。若心脏组织消化不充分，心肌碎片可能堵塞移液枪头。可轻轻将移液枪头在微量离心管内壁研磨，以帮助均质化较大的组织碎片。
- 使用1 mL移液器，将样品上下吹打至组织样品均匀且不堵塞移液器吸头为止。
- 将1 mL预冷的HBB加入置于50 mL锥形管上的40 µm细胞滤筛中润湿。
- 将匀浆后的样品加入滤膜中，缓慢倒入 12–14 mL 冷却的 HBB 洗涤液进行冲洗。
- 将过滤后的样品转移至已标记的15 mL锥形管中，置于4 °C保存。
- 以 400 x g 离心样品 g 4 °C下离心5分钟。吸除上清液。
- 通过向每个样本中加入1 mL氯化铵钾（ACK）裂解缓冲液来裂解红细胞。涡旋重悬样本，并在室温下孵育5分钟。
- 裂解完成后，加入5–8 mL冷的Hank's平衡盐溶液（HBSS）以终止溶血。
- 在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 5 分钟。吸除上清液。
- 向每个样本中加入1 mL FACS缓冲液，并转移至已标记的1.5 mL微量离心管中。
注意：样本可在 4 °C 下保存，暂停操作时间最长可达 2 小时。
4. 流式细胞术染色与分析
- 在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心样品 5 分钟。
- 为减少非特异性抗体结合，将抗 CD16/CD32（1:100 稀释）和单核细胞阻断剂（1:20 稀释）（参见材料表）用 FACS 缓冲液稀释，按每份样品 50 µL 计算用量。室温孵育 15 分钟。
- 配制抗体稀释液（每种抗体 1:250 稀释），按每份样品 50 µL FACS 缓冲液计算用量。
注意：可在抗体混合液中加入活死染料，以排除死细胞。或者，也可通过流式分析中的小颗粒排除法实现（图 1C 和 D）。 - 无需洗涤，直接向每份样品中加入 50 µL 抗体混合液并混匀。
- 在 4 °C 避光孵育 30 分钟。
- 向每份样品中加入 600 µL FACS 缓冲液进行洗涤，并在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟。
- 吸除上清液，将沉淀重悬于 300 µL FACS 缓冲液中。样品置于 4 °C 避光保存。
注意：某些活死染料（如 DAPI）需在上机进行流式细胞术前 10 分钟内染色。 - 在接下来的 3 小时内进行流式细胞术分析（参见图 1 和图 2）。若需更长时间保存，建议使用低浓度多聚甲醛（PBS 中 0.5–1%）进行短期固定，以维持染色效果。
注意：强烈建议在开始流式细胞术分析前，将样品通过 40 µm 细胞滤网过滤，以防止流式细胞仪流路系统发生堵塞。
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结果
迄今为止，尚无理想的方法可将免疫细胞从其他心脏细胞成分（如心肌细胞）中分离出来。因此，通过流式细胞术分析心脏单细胞悬液时，需先通过CD45进行预设门控以鉴定免疫细胞群体，随后进行单细胞及小尺寸排除门控（图1A）。或者，也可进行活率染色以排除死细胞。小尺寸排除与活率染料染色在排除死细胞方面效果几乎相当（图1B 和 1D）。建议在消化处理后尽快进行抗体染色，并始终将细胞悬液置于4 °C环境中，因为细胞活力可能随时间下降。该操作通常可获得约80–90%的活免疫细胞。
心肌组织中栖居着多种多样的免疫细胞，其中许多细胞仍待鉴定和表征。巨噬细胞被鉴定为CD64+细胞，是心脏中主要的免疫细胞群体，占所有免疫细胞的60–70%（...
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讨论
心肌炎症，即心肌炎，是大多数心血管疾病的特征。然而，在非疾病状态下，心肌并非缺乏自身的免疫组分。在稳态条件下，多种免疫细胞存在于心肌中，发挥着维持组织稳态和保护机体的重要作用。若无本实验方案中所介绍的此类方法，便无法对这些多样化的细胞群体进行表征。
通过机械法与酶消化法相结合处理心肌组织，可获得单细胞悬液，该悬液可与其他分析方法联合使用，例如流式细胞术或免疫磁珠分离法。在采用本方法时，需注意以下几点。首先，本研究中所有分析均针对心肌组织内的细胞群体；我们排除心房组织，因其为具有独特特性的特殊组织。其次，所用酶的用量以活性单位表示，以便于使用其他来源酶制剂时进行消化条件的设置。然而，强烈建议根据经验对酶的终浓度和消化时间进行优化，因为酶量不足会显著降低细胞得率，而过度消化则会严重影响细胞活力。第三，选择性步骤中通过血管内注射标记抗体的方法，在研究正常心肌中稀有细胞群体（如淋巴细胞、单核细胞或中性粒细胞）2，或在血液中细胞数量可能发生改变的情况下（如单核细胞增多、粒细胞增多或淋巴细胞增多），尤为推荐。这些情况下可能造成心肌内细胞变化的假象...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了加拿大卫生研究院（148808 和 148792）的资助。SE 获得了安大略省办事处心脏与中风基金会、March of Dimes、Ted Rogers 心脏研究中心以及 Peter Munk 心脏中心提供的人员奖项支持。XCC 持有加拿大卫生研究院的班廷博士后奖学金。LA 持有心脏与中风基金会/Richard Lewar 研究生奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 磷酸盐缓冲液 | Wisent | 311-010-CL | 1x PBS |
| 21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide 针头 | BD | 305167 | |
| Hank’s 平衡盐溶液 | Wisent | 311-511-CL | 1x HBSS |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| 牛血清 | Sigma | B9433 | |
| 0.5 M 乙二胺四乙酸 | BioShop | EDT111 | |
| 真空滤器，0.2 µm Filtropur V50 | Sarstedt | 83.1823.001 | |
| 28 G 1/2 1 cc 胰岛素注射器 | BD | 329424 | |
| 60 mL 注射器 | BD | 309653 | |
| Dulbecco 改良 Eagle 培养基 | Wisent | 319-005-CL | 含 4.5 g/L 葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的 1x DMEM |
| I 型胶原酶 | Sigma | C0130 | 来源于溶组织梭状芽孢杆菌 |
| I-S 型透明质酸酶 | Sigma | H3506 | |
| DNase-I | Sigma | D4513 | 来源于牛胰腺 |
| 细胞筛，40 µm 尼龙 | Falcon | 352340 | |
| 氯化铵-氯化钾 (ACK) 裂解缓冲液 | Lonza | 10-546E | |
| Alexa Fluor 700 抗小鼠/人 CD11b | Biolegend | 101222 | 1:250 稀释 |
| APC/Cy7 抗小鼠 Ly-6c | Biolegend | 128025 | 1:250 稀释 |
| APC 抗小鼠 CD103 | Biolegend | 121414 | 1:250 稀释 |
| Brilliant Violet 605 抗小鼠 CD11c | Biolegend | 117334 | 1:250 稀释 |
| PE 抗小鼠 Ly-6G | Biolegend | 127607 | 1:250 稀释 |
| Pacific Blue 抗小鼠 I-Ab | Biolegend | 116422 | 1:250 稀释 |
| FITC 抗小鼠 CD64 (FcgRI) | Biolegend | 139315 | 1:250 稀释 |
| PE/Cy7 抗小鼠 CD45 | Biolegend | 103113 | 1:250 稀释 |
| PerCP/Cy5.5 抗小鼠 CD45 | Biolegend | 103132 | 1:40 稀释 |
| TruStain fcX (抗小鼠 CD16/32) | Biolegend | 101320 | 1:100 稀释 |
| True-Stain 单核细胞阻断剂 | Biolegend | 426101 | 1:20 稀释 |
| FlowJo V10 | TreeStar Inc | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| 小鼠：Batf3-/- | The Jackson Laboratory | JAX: 013755 |
参考文献
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