心脏外免疫细胞的分离与鉴定

摘要

该协议提出了一种简便、有效的方法, 用于分离、鉴定和量化在小鼠心肌中的免疫细胞在稳态或炎症状态下的存在。该协议结合酶和机械消化的生成单细胞悬浮, 可以进一步分析的流式细胞术。

摘要

免疫系统是健康心脏的重要组成部分。心肌是一个丰富的不同免疫细胞亚群的家, 在稳定状态和不同形式的炎症期间功能划分。直到最近, 对心脏免疫细胞的研究需要使用显微镜或发育不良的消化协议, 这在严重炎症期间提供了足够的敏感性, 但无法自信地识别小但关键人群的稳定状态下的细胞。在这里, 我们讨论了一个简单的方法, 结合酶 (胶原酶, 透明质酸和 DNAse) 和机械消化的小鼠心脏之前的血管内管理荧光标记的抗体, 以区别较小但不可避免的血管内的细胞污染物。该方法通过流式细胞仪对细胞进行鉴定、分型和定量, 或通过荧光活化细胞分选或磁珠分离进一步纯化, 从而产生分离的活体细胞悬浮。转录分析或体外研究。我们包括一个分步流细胞分析的例子, 以区分关键的巨噬细胞和树突状体细胞群体的心脏。为中等大小实验 (10 心脏) 过程的完成要求 2–3 h。

引言

不同形式的心肌应激或损伤, 包括缺血性 (缺血再灌注或心肌梗死) 和非缺血性 (高血压或心肌炎), 促进炎症细胞的招募与修复和保护, 但也致病性。早在 1891, 龙贝格首先描述了感染斑疹伤寒和猩红热¹患者心肌细胞浸润的存在。然而, 对心脏免疫细胞的详细研究需要发展更先进的免疫分型技术。因此, 直到最近我们才开始了解到, 在稳定状态下, 具有重要维护作用的免疫细胞的不同种群驻留在心肌内。

组织学一直是, 而且仍然是最常用的方法来表征心脏免疫细胞在炎症。然而, 虽然组织学是一个有价值的诊断工具, 它在心脏免疫细胞研究中的应用有重要的局限性。驻留在心肌中的免疫细胞占总细胞的很小比例, 或多或少分布在一个比例巨大的空间中。同样, 几种形式的心脏炎症, 如病毒性心肌炎, 显示炎症的焦点模式。这意味着对心脏的免疫系统的准确分析往往需要更高的组织学取样, 增加成本, 以减少偏见。此外, 组织学在细胞识别中提供了非常有限的可用信息 (如参数数目)。随着越来越多的细胞子集需要使用多个表达标记 (包括表面标记, 转录因子或分泌分子), 流式细胞术已经建立了自己作为最强大的工具, 免疫分型,由于低成本和高吞吐量。

免疫分型技术的使用是密切依赖于开发高效的消化协议, 允许对大量细胞的单细胞分析。细胞提取的穷尽性协议的发展为心脏免疫学研究开辟了新的机遇之窗。通过消化、流式细胞术和转录组学的结合, 在心脏中的巨噬细胞和树突状体细胞的主要种群特征为^2、3。最丰富的心脏免疫细胞在稳定状态是 CD64⁺MerTK⁺巨噬细胞, 可进一步分裂的基础上, 其表达 CCR2 或 CD11c²。CCR2⁺巨噬细胞起源于成人骨髓造血, 而大多数 CCR2 巨噬细胞, 可以表达高或低的 MHC II, 主要是产前起源。巨噬细胞执行关键功能, 如修复⁴和清除碎片⁵在伤害或支持电连接⁶稳定状态。在不同的炎症形式期间 Ly6C 的一个重要汇集 CD64^int单核细胞发生, 以后区分成 Ly6C^hi CCR2⁺巨噬细胞^2,7.一个明显较小, 但重要的是, 居住在健康个体的心肌细胞的数量是由树突状细胞^8,9组成。心脏常规 DCs (招揽) 的两个主要子集最近的特点是: cDC1 (CD103⁺ dcs) 和 cDC2 (CD11b⁺ dcs)。DCs 在抵御感染方面起着重要作用⁸ , 但也可以促进炎症期间的自我伤害, 特别是在心肌梗塞⁹期间。

在这里, 我们描述了一个简单的方法来隔离的存活的心脏免疫细胞的小鼠心肌。该方法结合酶和机械消化与细胞过滤过滤, 以获得一个单一的细胞悬浮, 可以分析, 或进一步纯化, 通过流式细胞仪分类或磁珠浓缩。准确测量外心肌细胞需要心脏灌注, 以消除可能的污染物从血液中的心脏微血管。此外, 我们提出了一个可选的步骤, 免疫细胞的血管内标记, 可用于进一步区分心肌细胞从血管内污染物, 根据 Galkina等¹⁰号议定书。最后, 我们提出了一个基本的流式细胞分析, 以确定主要巨噬细胞和 cDC 亚人口。

方案

伦理声明: 本议定书已由大学卫生网 (加拿大多伦多) 动物保育委员会审查和批准, 并符合加拿大动物保育理事会的规定。

1. 缓冲准备

1. 准备 HBB 缓冲液 (汉克的平衡盐溶液 (HBSS), 2% 热灭活牛血清, 0.2% 牛血清白蛋白)。添加10毫升的热灭活牛血清和1克牛血清白蛋白到500毫升的 HBSS。过滤器消毒通过0.2 µm 过滤器和存储在4摄氏度。
2. 制备血液学缓冲剂 (磷酸缓冲盐水 (PBS), 2% 热灭活牛血清, 1 毫米乙二胺乙酸 (EDTA, pH 值 8.0))。添加10毫升热灭活牛血清和1毫升0.5 米 EDTA 到500毫升的 PBS。过滤器消毒通过0.2 µm 过滤器和存储在4摄氏度。
   注: 解决方案可存储在摄氏4摄氏度, 长达1月。

2. 循环白细胞的标签

1. 灌装制备抗小鼠 CD45 注射液, 1 µg 的抗体稀释在无菌磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中, 最终注射量为200µL/小鼠。将体积装入28.5G 胰岛素注射器中, 远离光线。
   注: 使用两种不同的 fluorochrome 标记的 anti-CD45 抗体, 以区分血管内 (染色通过静脉注射管理) 从心内染色 (染色后消化; 见步骤 4)。
2. 预热小鼠 (8–12周), 通过将尾部暴露在一盏红色的热灯上5分钟。
   注意: 不要使动物过热。把灯保持在安全的距离 (> 30 厘米)。
   1. 使用适当的设备来抑制胸骨位置上的动物。用拇指和无名指将尾部的底部与食指、中指和尾部的中远端区域固定, 以非显性手暴露和稳定尾部。
      注意: 不要在尾部的尖端施加太多的力, 因为皮肤可以被拔掉。插入针与斜面朝上的静脉。始终保持针平行的静脉在任何时候, 因为它是容易穿刺静脉。
      注: 血液进入注射器可能会发生, 是一个良好的注射迹象。将针弯曲到90°角度可以促进静脉的管理。与您的安全办公室确认, 弯曲的针头可能代表危险。
   2. 静脉注射200µL 静脉入尾脉。液体应该容易地流动并且临时地清除静脉。
      注意: 如果遇到阻力, 不要强迫流体。这是针错位的迹象。
   3. 允许抗体在人道 euthanizing 老鼠之前循环5分钟。

3. 心脏隔绝和消化

1. 弄死小鼠使用 CO₂或由其他体制上接受的安乐死做法。
   1. 对于共₂安乐死, 将鼠标放置在 co₂腔内, 并将填充速率设置为每分钟室容积的 20% (即,如果分庭为10升, 则填写2升/分钟)。运行2分钟和监控鼠标, 直到呼吸停止。
   2. 关闭 CO₂ , 并将鼠标留在另外的1-2 分钟内. 确保在打开房间前停止呼吸, 并在开始处理鼠标前进行脚趾捏以确认鼠标已死。
2. 用70% 乙醇喷洒老鼠。抬起腹部的皮肤, 并解剖鼠标沿腹中线开始在臀部的水平到胸骨。打开腹部并移动肝脏以暴露隔膜。
3. 切开隔膜, 然后在中线两侧的肋骨, 小心避免刺穿肺部和心脏。
   1. 通过剥离肋骨来暴露心脏, 然后先切开左心房, 然后右心房。
      注意: 在切开心房时要小心, 确保没有动脉或静脉受伤, 因为这样可以降低器官中的血液冲洗效率。
   2. 灌注的心脏与15–20毫升的冷 pbs 使用60毫升注射器装有21克针和冷 pbs。用镊子轻轻地抓住心脏的底座, 将针插入靠近顶端的左心室。在右心室重复这个过程。适当的注射会导致白肺和苍白的肝脏。
      注: 应在安乐死后5分钟内进行灌注, 以避免血液凝固, 这可能会污染器官与循环细胞的利益。
4. 用镊子握住心脏的底座, 轻轻地拉起心脏, 然后通过切断主要的肺动脉和静脉、主动脉和心包袋来分离心脏。
   1. 用干净的无绒纸巾轻轻地握住拇指和食指之间的心脏, 用镊子将主要动脉和静脉的心房和残余物拉出来, 将心脏清洁。
      注: 确保心房全部被移除, 没有其他组织, 如肺或血管, 因为这些组织有自己的免疫细胞。特别是肺有一个大的免疫细胞的人口, 可以掩盖的小群体的人在心肌。
5. 把心脏放在一个5厘米的塑料盘子里, 用50µL 的冷 PBS。
   1. 用弯曲的解剖剪刀切碎心脏, 直到没有可见的碎片, 它有平滑的一致性。
      注意: 在切的过程中尽量保持心脏在盘子的一个包含区域, 以减少组织损失。
   2. 用弯曲钳将 thetrituratedheart 组织移植到2毫升离心管中, 800 µL 冷 Dulbecco 的改性鹰培养基 (DMEM)。
6. 添加 450 u/毫升 ofcollagenase i, 60 u/毫升的透明质酸酶类型的 i S, 和 60 U/毫升的 DNase i 对每个样品。
   1. 在37摄氏度的摇摆振动筛上孵化样品, 在 50 rpm 45–60分钟。
7. 在消化之后, 简要地漩涡样品 (二十年代) 和立刻放置在冰保持样品在4°c。
   1. 使用1毫升 pipettor, 吸管的样品向上和向下, 直到组织样本是均匀的, 并没有堵塞的吸管尖端。
      注: 定义特定次数的吸管可能会增加重现性。如果心脏没有得到最佳的消化, 部分心肌可能会阻碍吸管。轻轻研磨的吸管尖端对离心管将有助于融汇更大的组织。
8. 预湿40µm 细胞过滤器放置在50毫升圆锥管与1毫升的冷 HBB。
   1. 将匀质样品添加到过滤器中, 通过缓慢浇注12–14毫升的冷 HBB 来洗涤。
   2. 将经过过滤的样品转移到标签为15毫升的锥形管上, 保持在4摄氏度。
9. 离心机样品在 400 x g 5 分钟在4摄氏度。吸出上清。
   1. 溶解红细胞通过增加1毫升的氯化铵-钾 (ACK) 裂解缓冲到每个样品。并用重悬样品涡流, 室温孵育5分钟。
   2. 一旦溶解完成, 添加5–8毫升的冷汉克的平衡盐溶液 (HBSS), 以防止溶血。
10. 离心机样品在 400 x gfor 5 分钟在4°c。吸出上清。
11. 在每个样品中添加1毫升的流化器缓冲器, 并将其转移到标签为1.5 毫升的离心管。
    注意: 该协议可以在这里暂停多达2小时, 样品存储在4摄氏度。

4. 流式细胞仪染色及分析

1. 离心机样品在 400 x g 5 分钟在4摄氏度。
   1. 为了减少非特异性抗体的结合, 稀释 1:100 anti-CD16/CD32 和单核细胞阻滞剂 (1:20) (见材料表) 核算每样的50µL。室温孵育15分钟。
   2. 准备抗体稀释 (每种抗体的 1:250) 核算每个样品的50µL。
      注: 可将活性染料纳入抗体鸡尾酒中, 以排除死细胞。或者, 可以使用流分析的小尺寸排除 (图 1C和D)。
   3. 没有洗涤, 添加50µL 抗体主混合到每个样本和混合。
   4. 在黑暗中孵化4摄氏度的样品, 30 分钟。
2. 在每样样品上加600µL, 以 400 x克为5分钟, 在4摄氏度处冲洗和离心样品。
3. 在300µL 中吸取上清和并用重悬颗粒。在黑暗中保持样品在4摄氏度。
   注: 一些活性染料, 如 DAPI, 需要在运行流式细胞术前10分钟内染色。
4. 通过流式细胞术 (见图1和 2) 在未来3小时内进行分析。如果需要较长的时间, 建议使用低浓度多聚甲醛 (PBS 0.5–1%) 进行短期固定, 以保持染色。
   注: 强烈建议在启动流式细胞仪分析前, 通过40µm 细胞过滤器筛选样品, 以防止射流技术的流量。

结果

到目前为止, 还没有一个好的方法可以隔离其他心脏细胞成分, 如心肌细胞。因此, 流式细胞术对心脏单细胞悬浮液的分析需要用 CD45 预浇来识别免疫细胞的数量, 其次是单细胞和小尺寸排斥门 (图 1a)。或者, 可以执行生存性染色, 以排除死细胞。小尺寸排除和活性染料染色表示几乎等同于排除死细胞的方法 (图 1B和1D)。强烈建议在消化过程后不久进行抗体染色, 并始终保持细胞悬浮在4摄氏度, 因为细胞的生存能力可能会衰退。这个过程通常产生关于80–90% 的可行免疫细胞。

心肌有不同的免疫细胞群, 其中许多仍有待于鉴定和鉴定。被确定为 CD64⁺细胞的巨噬细胞是心脏的主要免疫群体, 代表所有免疫细胞的 60–70%...

讨论

心肌炎症, 或心肌炎, 是大多数心血管疾病的特征。然而, 在非疾病状态下, 心肌并不缺乏自身的免疫成分。在稳态状态下, 许多免疫细胞驻留在心肌中, 发挥着维护和保护的重要作用。如果没有本议定书所提出的方法, 就不可能对这些不同的细胞群体进行描述。

一种结合的机械和酶消化的心肌允许隔离单个细胞悬浮, 可用于结合其他分析方法, 如流式细胞术或磁珠隔离。必须考虑到关于目前方法的若干考虑。首先, 我们所有的分析都是指心肌内的人群;我们从分析中排除心房, 因为这些都是专门的组织, 具有自身的特质。第二, 使用的酶的数量表示为活动单位, 以帮助建立消解使用酶从其他来源。然而, 强烈建议对酶的最终浓度和消化时间进行经验优化, 因为限制酶可以显著降低细胞的产量, 过多的消化会严重影响生存能力。第三, 在研究正常心肌 (如淋巴细胞、单核细胞或中性粒细胞)²或以下情况时, 特别推荐使用标记抗体的血管内管理的可选步骤。当血液中的人口数量可能发生变化 (monocytosis, granulocytosis 或淋巴球增多), 这可能给一个错误的印象, 在心肌...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲盐水	Wisent	311-010-CL	1x PBS
21 G x 1 1/2 （0.8 mm x 40 mm） PrecisionGlide 针	BD	305167
Hank's 平衡盐溶液	Wisent	311-511-CL	1x HBSS
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A4503-50G
牛血清	Sigma	B9433
0.5 M 乙二胺四乙酸	BioShop	EDT111
真空过滤器，0.2 µm Filtropur V50	Sarstedt	83.1823.001
28 G 1/2 1 cc 胰岛素注射器	BD	329424
60 mL 注射器	BD	309653
Dulbecco 改良 Eagle 培养基	Wisent	319-005-CL	1x DMEM，含 4.5 g/L 葡萄糖和 L-谷氨酰胺和丙酮酸
钠胶原酶 I	Sigma	C0130	来自溶组织梭菌
透明质酸酶 I-S 型	Sigma	H3506
DNase-I	Sigma	D4513	来自牛胰腺
细胞过滤器，40 µm 尼龙	Falcon	352340
氯化铵-钾 （ACK） 裂解缓冲液	Lonza	10-546E
Alexa Fluor 700 抗小鼠/人 CD11b	Biolegend	101222	1：250 稀释度
APC/Cy7 抗小鼠 Ly-6c	Biolegend	128025	1：250 稀释度
APC 抗小鼠 CD103	Biolegend	121414	1：250 稀释度
Brilliant Violet 605 抗小鼠 CD11c	Biolegend	117334	1：250 稀释
PE 抗小鼠 Ly-6G	Biolegend	127607	1：250 稀释
Pacific Blue 抗小鼠 I-Ab	Biolegend	116422	1：250 稀释
FITC 抗小鼠 CD64 （FcgRI）	Biolegend	139315	1：250 稀释
PE/Cy7 抗小鼠 CD45	Biolegend	103113	1：250
PerCP/Cy5.5 抗小鼠 CD45	Biolegend	103132	1：40 稀释
TruStain fcX（抗小鼠 CD16/32）	Biolegend	101320	1：100 稀释
True-Stain 单核细胞阻滞剂	Biolegend	426101	1：20 稀释
FlowJo V10	TreeStar Inc		https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
小鼠： Batf3-/-	The Jackson Laboratory	JAX： 013755