心脏血管外免疫细胞的分离与鉴定

摘要

本方案介绍了一种简单高效的方法，用于在稳态或炎症状态下从小鼠心肌中分离、鉴定和定量免疫细胞。该方案结合了酶消化和机械消化，以制备单细胞悬液，并可进一步通过流式细胞术进行分析。

摘要

免疫系统是健康心脏的重要组成部分。心肌组织在稳态及不同类型炎症状态下均存在多种免疫细胞亚群，且具有功能上的区室化分布。以往对心脏免疫细胞的研究依赖显微镜观察或尚不完善的组织消化方案，这些方法在严重炎症时具有足够的灵敏度，但在稳态条件下难以可靠地鉴定数量较少却关键的细胞群体。本文介绍一种简便的方法，通过血管内注射荧光标记抗体以区分不可避免的少量血管内细胞污染，随后结合酶消化（胶原酶、透明质酸酶和DNA酶）与机械法对小鼠心脏进行消化处理。该方法可获得单细胞悬液，其中细胞具有活性，可用于流式细胞术进行鉴定、表型分析和定量；也可进一步通过荧光激活细胞分选或磁珠分离法纯化，用于转录分析 体外 研究。我们提供了一个逐步进行流式细胞术分析的示例，用于区分心脏中主要的巨噬细胞和树突状细胞群体。对于中等规模的实验（10个心脏），完成该操作流程需要2–3小时。

引言

不同形式的心肌应激或损伤，包括缺血性（如缺血再灌注或心肌梗死）和非缺血性（如高血压或心肌炎），均可促进具有修复和保护作用、同时也具有致病性的炎性细胞的募集。早在1891年，Romberg首次描述了伤寒和猩红热患者心肌中存在细胞浸润¹。然而，对心脏免疫细胞的深入研究需要更先进的免疫表型分析技术的发展。因此，直到最近，我们才开始认识到在稳态条件下，心肌内存在一群多样化的免疫细胞，它们在维持心脏正常功能中发挥着关键作用。

组织学一直是表征心脏炎症期间免疫细胞的最常用方法，至今仍是如此。然而，尽管组织学是一种有价值的诊断工具，但在研究心脏免疫细胞时仍存在重要局限性。驻留在心肌中的免疫细胞仅占总细胞数的极小比例，并且在相对巨大的空间中或多或少均匀分布。同样，多种类型的心脏炎症（如病毒性心肌炎）呈现出局灶性炎症模式。这意味着对心脏免疫系统的准确分析通常需要更高程度的组织学取样，从而增加成本以减少偏差。此外，组织学在细胞鉴定中所能提供的可用信息非常有限（例如 参数数量）。随着需要使用多种表达标志物（包括表面标志物、转录因子或分泌分子）来鉴定的细胞亚群不断增加，流式细胞术因其低成本和高通量，已成为免疫表型分析最强大的工具。

免疫表型分析技术的应用在很大程度上依赖于高效消化方案的发展，这些方案使得对大量细胞进行单细胞分析成为可能。全面的细胞提取方案的建立，为心脏免疫学研究开....

方案

伦理声明：本方案已通过大学健康网络动物护理委员会（加拿大安大略省多伦多市）的审查与批准，符合加拿大动物护理委员会的规定。

1. 缓冲液配制

1. 配制 HBB 缓冲液（Hank's 平衡盐溶液 (HBSS)，2% 热灭活牛血清，0.2% 牛血清白蛋白）。将 10 mL 热灭活牛血清和 1 g 牛血清白蛋白加入 500 mL HBSS 中。经 0.2 µm 滤膜过滤除菌，4 °C 保存。
2. 配制 FACS 缓冲液（磷酸盐缓冲液 (PBS)，2% 热灭活牛血清，1 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA, pH 8.0)）。将 10 mL 热灭活牛血清和 1 mL 0.5 M EDTA 加入 500 mL PBS 中。经 0.2 µm 滤膜过滤除菌，4 °C 保存。
   注意：溶液可在 4 °C 保存最多 1 个月。

2. 循环白细胞的标记

1. 无菌条件下，将 1 µg 抗小鼠 CD45 抗体溶于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制注射液，每只小鼠注射体积为 200 µL。将液体吸入 28.5G 胰岛素注射器中，并避光保存。
   注意：使用两种不同荧光染料标记的抗 CD45 抗体，以区分血管内（通过静脉注射标记）与心脏内染色（消化后标记；见步骤 4）。
2. 通过将小鼠（8–12 周龄）尾部暴露于红色加热灯下 5 分....

结果

迄今为止，尚无理想的方法可将免疫细胞从其他心脏细胞成分（如心肌细胞）中分离出来。因此，通过流式细胞术分析心脏单细胞悬液时，需先通过CD45进行预设门控以鉴定免疫细胞群体，随后进行单细胞及小尺寸排除门控（图1A）。或者，也可进行活率染色以排除死细胞。小尺寸排除与活率染料染色在排除死细胞方面效果几乎相当（图1B 和 1D）。建议在消化处理后尽快进行抗体染色，并始终将细胞悬液置于4 °C环境中，因为细胞活力可能随时间下降。该操作通常可获得约80–90%的活免疫细胞。

心肌组织中栖居着多种多样的免疫细胞，其中许多细胞仍待鉴定和表征。巨噬细胞被鉴定为CD64⁺细胞，是心脏中主要的免疫细胞群体，占所有免疫细胞的60–70%（.......

讨论

心肌炎症，即心肌炎，是大多数心血管疾病的特征。然而，在非疾病状态下，心肌并非缺乏自身的免疫组分。在稳态条件下，多种免疫细胞存在于心肌中，发挥着维持组织稳态和保护机体的重要作用。若无本实验方案中所介绍的此类方法，便无法对这些多样化的细胞群体进行表征。

通过机械法与酶消化法相结合处理心肌组织，可获得单细胞悬液，该悬液可与其他分析方法联合使用，例如流式细胞术或免疫磁珠分离法。在采用本方法时，需注意以下几点。首先，本研究中所有分析均针对心肌组织内的细胞群体；我们排除心房组织，因其为具有独特特性的特殊组织。其次，所用酶的用量以活性单位表示，以便于使用其他来源酶制剂时进行消化条件的设置。然而，强烈建议根据经验对酶的终浓度和消化时间进行优化，因为酶量不足会显著降低细胞得率，而过度消化则会严重影响细胞活力。第三，选择性步骤中通过血管内注射标记抗体的方法，在研究正常心肌中稀有细胞群体（如淋巴细胞、单核细胞或中性粒细胞）²，或在血液中细胞数量可能发生改变的情况下（如单核细胞增多、粒细胞增多或淋巴细胞增多），尤为推荐。这些情况下可能造成心肌内细胞变化的假象.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液	Wisent	311-010-CL	1x PBS
21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide 针头	BD	305167
Hank’s 平衡盐溶液	Wisent	311-511-CL	1x HBSS
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A4503-50G
牛血清	Sigma	B9433
0.5 M 乙二胺四乙酸	BioShop	EDT111
真空滤器，0.2 µm Filtropur V50	Sarstedt	83.1823.001
28 G 1/2 1 cc 胰岛素注射器	BD	329424
60 mL 注射器	BD	309653
Dulbecco 改良 Eagle 培养基	Wisent	319-005-CL	含 4.5 g/L 葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的 1x DMEM
I 型胶原酶	Sigma	C0130	来源于溶组织梭状芽孢杆菌
I-S 型透明质酸酶	Sigma	H3506
DNase-I	Sigma	D4513	来源于牛胰腺
细胞筛，40 µm 尼龙	Falcon	352340
氯化铵-氯化钾 (ACK) 裂解缓冲液	Lonza	10-546E
Alexa Fluor 700 抗小鼠/人 CD11b	Biolegend	101222	1:250 稀释
APC/Cy7 抗小鼠 Ly-6c	Biolegend	128025	1:250 稀释
APC 抗小鼠 CD103	Biolegend	121414	1:250 稀释
Brilliant Violet 605 抗小鼠 CD11c	Biolegend	117334	1:250 稀释
PE 抗小鼠 Ly-6G	Biolegend	127607	1:250 稀释
Pacific Blue 抗小鼠 I-Ab	Biolegend	116422	1:250 稀释
FITC 抗小鼠 CD64 (FcgRI)	Biolegend	139315	1:250 稀释
PE/Cy7 抗小鼠 CD45	Biolegend	103113	1:250 稀释
PerCP/Cy5.5 抗小鼠 CD45	Biolegend	103132	1:40 稀释
TruStain fcX (抗小鼠 CD16/32)	Biolegend	101320	1:100 稀释
True-Stain 单核细胞阻断剂	Biolegend	426101	1:20 稀释
FlowJo V10	TreeStar Inc		https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
小鼠：Batf3-/-	The Jackson Laboratory	JAX: 013755