विनोदी उन्मुक्ति के प्रमुख खिलाड़ियों को सुलझाना: Murine Peyer के पैच से उन्नत और अनुकूलित लिम्फोसाइट आइसोलेशन प्रोटोकॉल
Summary
इस अध्ययन में, हम एक उपंयास और Peyer के पैच (पी एस) से लिम्फोसाइटों के अलगाव के लिए प्रभावी प्रोटोकॉल मौजूद है, जो बाद में vivo में और इन विट्रो में के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कार्यात्मक परख के रूप में अच्छी तरह से फुफ्फुसीय टी के प्रवाह cytometric अध्ययन हेल्पर और कीटाणु केंद्र बी कोशिकाओं ।
Abstract
आंत म्यूकोसा में, प्रतिरक्षा कोशिकाओं एक अद्वितीय प्रतिरक्षा इकाई का गठन, जो प्रतिरक्षा सहिष्णुता को बढ़ावा देता है, जबकि समवर्ती रोगजनकों के खिलाफ प्रतिरक्षा रक्षा को प्राथमिकता । यह अच्छी तरह से स्थापित है कि Peyer पैच (पी एस) कई प्रभाव टी और बी सेल सबसेट की मेजबानी से श्लैष्मिक प्रतिरक्षा नेटवर्क में एक अनिवार्य भूमिका है । इन प्रभाव कोशिकाओं के एक निश्चित अंश, फुफ्फुसीय टी सहायक (TFH) और कीटाणु केंद्र (जीसी) बी कोशिकाओं विनोदी प्रतिरक्षा के विनियमन में व्यावसायिक हैं । इसलिए, उनके भेदभाव कार्यक्रम और कार्यात्मक गुण के संदर्भ में पी एस के भीतर इन सेल सबसेट के लक्षण वर्णन श्लैष्मिक उन्मुक्ति के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं । यह अंत करने के लिए, एक आसानी से लागू, कुशल और पीपीएस से लिम्फोसाइट अलगाव के reproducible विधि शोधकर्ताओं के लिए मूल्यवान होगा । इस अध्ययन में, हम उच्च कोशिका उपज के साथ माउस पीपीएस से लिम्फोसाइटों को अलग करने के लिए एक प्रभावी तरीका उत्पन्न करने के उद्देश्य से. हमारे दृष्टिकोण से पता चला कि इस तरह के पाचन एजेंट और ऊतक आंदोलन के उपयोग के रूप में प्रारंभिक ऊतक प्रसंस्करण, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल धुंधला शर्तों और एंटीबॉडी पैनलों के चयन, गुणवत्ता और अलग लिम्फोसाइटों की पहचान पर बहुत प्रभाव है और पर प्रयोगात्मक परिणाम ।
यहां, हम एक शोधकर्ताओं को सक्षम करने के लिए कुशलता से लिम्फोसाइट आबादी reproducible प्रवाह cytometry टी और बी सेल उपसेट के मूल्यांकन के आधार पर मुख्य रूप से TFH और जीसी बी सेल सबसेट पर ध्यान केंद्रित की अनुमति पीपीएस से अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन ।
Introduction
शुरू से अंत तक पूरे जठरांत्र संबंधी मार्ग एक व्यापक लसीकावत् नेटवर्क है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं को मानव और माउस1में किसी भी अंय अंग से अधिक शामिल है के साथ अलंकार है । है Peyer पैच (पी एस) इस सेलुलर प्रतिरक्षा संगठन की आंतों शाखा का एक प्रमुख घटक का गठन, तथाकथित आंत से जुड़े लसीकावत् ऊतक (GALT)2,3। पीपीएस के भीतर, आहार सामग्री से व्युत्पंन एंटीजन के लाखों लोगों के हजारों, खाना खानेवाला microbiota और रोगजनकों लगातार नमूना लिया जा रहा है, और जब उन की ओर आवश्यक उचित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं इस प्रकार आंतों प्रतिरक्षा को बनाए रखने बढ़ रहे हैं Homeostasis. इस मायने में, पीपीएस “छोटी आंत के tonsils” के रूप में नामित किया जा सकता है. पीपीएस प्रमुख उप डिब्बों से मिलकर बनता है: subepithelial डोम (SED), बड़े बी सेल कूप क्षेत्रों; फाए (आईएफआर), जहां टी कोशिकाओं4स्थित है झूठ कूप से जुड़े उपकला (और) । पीपीएस की इस अनूठी compartmentalization विभिन्न प्रभाव सेल सबसेट का सहयोग करने के लिए सक्षम बनाता है, इस प्रकार, पेट में immunocompetence प्रदान.
पीपीएस की कमी afferent लसीका, और इस कारण के कारण, छोटी आंत से पीपीएस के लिए ले जाया एंटीजन अंय लसीकावत् अंगों के अधिकांश के विपरीत लसीका वाहिकाओं के माध्यम से आयोजित नहीं किया जा रहा है । इसके बजाय, फाए में स्थित विशेष उपकला कोशिकाओं, तथाकथित एम कोशिकाओं, पी एस5में चमकदार एंटीजन के हस्तांतरण के लिए जिम्मेदार हैं. बाद में, वृक्ष कक्षों (dc) और फाए6,7के नीचे subepithelial डोम (SED) क्षेत्र में स्थित हैं जो फ़ैगोसाइट के द्वारा पहुँचाया प्रतिजनों उठाया जाता है । पीपी में dc द्वारा इस प्रतिजन छंटाई प्रक्रिया अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया8 और IgA स्रावित कोशिकाओं9के बाद की पीढ़ी को शुरू करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
खाना खानेवाला वनस्पति और आहार सामग्री से भारी प्रतिजनी बोझ के कारण, पीपीएस मेजबान endogenously इस तरह के TFH और IgA+ GC बी कोशिकाओं10के रूप में महान बहुतायत में प्रभाव टी और बी सेल सबसेट सक्रिय, सुझाव है कि पीपीएस सक्रिय प्रतिरक्षा की एक साइट का प्रतिनिधित्व प्रतिक्रिया११. कुल CD4+ टी सेल डिब्बे के भीतर अप करने के लिए 20-25% TFH कोशिकाओं का पता लगाने और अप करने के लिए 10-15% कुल बी कोशिकाओं के भीतर जीसी बी कोशिकाओं unimmunized युवा C57BL से एकत्र पी एस में संभव है/6 चूहों12. अंय टी सहायक सेल प्रकार (यानी, Th1, Th2, Th17 कोशिकाओं) के विपरीत, TFH कोशिकाओं को बी कोशिका रोम में मुख्य रूप से tropism अभिव्यक्ति है, जो CXCR5 ढाल13TFH के साथ सेल होमिंग को बढ़ावा देता है के कारण अद्वितीय CXCL13 दिखाते हैं । बी पी एस की कोशिका कूप क्षेत्र में, TFH कोशिकाओं IgA वर्ग स्विच पुनर्संयोजन और शारीरिक hypermutation सक्रिय बी कोशिकाओं में से जो उच्च संबंध IgA कोशिकाओं का उत्पादन14अंतर पैदा करते हैं । बाद में, इन एंटीबॉडी-स्रावित प्लाज्मा कोशिकाओं लेमिना propria (एल. पी.) के लिए विस्थापित और आंत में प्रतिरक्षा homeostasis को विनियमित10.
पहचान और पीपीएस के भीतर TFH और जीसी बी सेल आबादी के लक्षण वर्णन शोधकर्ताओं समय लेने वाली प्रतिरक्षण मॉडल की आवश्यकता के बिना स्थिर राज्य की स्थितियों के तहत विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की गतिशीलता की जांच करने के लिए सक्षम हो सकता है परंपरागत रूप से TFH में इस्तेमाल किया-जीसी बी सेल अध्ययन15,16,17,18। पीपीएस के भीतर TFH कोशिकाओं का विश्लेषण अन्य सेल उपसमुच्चय के रूप में के रूप में सरल नहीं है. तकनीकी चुनौतियों आदर्श ऊतक तैयारी की स्थिति, सतह एंटीबॉडी-मार्कर संयोजन, साथ ही उचित सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण का चयन की पहचान शामिल है । दोनों TFH और पीपी अनुसंधान क्षेत्र प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के संदर्भ में महान परिवर्तनशीलता प्रदर्शन और कई कारणों की वजह से मानकीकृत प्रोटोकॉल की स्थापना के लिए एक आम सहमति से दूर हैं । सबसे पहले, पीपीएस के भीतर प्रत्येक सेल सबसेट एक सेल सबसेट विशिष्ट तरीके से आगे संशोधनों की आवश्यकता ऊतक तैयारी शर्तों द्वारा विभेदक रूप से प्रभावित हो जाता है । दूसरा, वहां पीपीएस से सेल की तैयारी के विवरण के बारे में रिपोर्ट तरीकों के बीच एक महत्वपूर्ण विसंगति है । तीसरा, प्रोटोकॉल की संख्या आधारित तुलनात्मक अध्ययन आदर्श ऊतक तैयारी तकनीकों और प्रयोगात्मक शर्तों की जांच पीपी और TFH अनुसंधान के लिए नहीं बल्कि सीमित है ।
वर्तमान प्रोटोकॉल आधारित अध्ययन पीपी सेल की तैयारी के लिए सुझाव दिया19,20,21,22 TFH-या जीसी बी सेल उंमुख नहीं थे । इसके अलावा, कुछ ऊतक तैयारी की स्थिति19पीपीएस के लिए सिफारिश की,20 collagenase आधारित पाचन के रूप में इस तरह के प्रवाह cytometry नकारात्मक18द्वारा TFH पहचान के परिणाम को प्रभावित पाया गया । इस आधार पर, हम एक अनुकूलित, मानकीकृत और reproducible प्रोटोकॉल है कि पीपीएस के भीतर TFH और जीसी बी सेल गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि इस विषय पर काम कर जांचकर्ताओं के लिए मूल्यवान होगा कारण है । यह जरूरत है हमें प्रोत्साहन के लिए एक बेहतर और अप करने के लिए तारीख प्रोटोकॉल उत्पंन करने के लिए दिया अलगाव और पीपी लिम्फोसाइटों कि पतले सेलुलर वसूली, व्यवहार्यता के लिए अनुकूलित है के लक्षण वर्णन, और कई टी और बी के प्रवाह cytometric लक्षण वर्णन के लिए दक्षता कक्ष सबसेट । हम भी पिछले प्रोटोकॉल में सुझाए गए कई श्रमसाध्य तैयारी चरणों को बाहर करने का उद्देश्य है, जिससे, पीपीएस से ऊतक और सेल तैयारी के लिए आवश्यक जोड़तोड़ और समय को कम करने.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम एक TFH और जीसी बी कोशिकाओं के प्रवाह cytometric लक्षण वर्णन के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन । हमारे प्रोटोकॉल का प्रमुख लाभ में से एक यह है कि यह 107 (औसत 4-5 x 106 कोशिकाओं) किसी भी पाचन प्रक्रिया के ब…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उपयोगी विचार विमर्श और प्रवाह cytometry विश्लेषण के साथ समर्थन के लिए लौरा स्ट्रास और पीटर बाबा शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 ml syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
References
- van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
- Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
- Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
- Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer’s patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
- Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
- Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
- Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
- Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
- Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
- Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
- Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
- Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
- Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
- Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
- Espéli, M., Walker, J. M. . T follicular helper cells – Methods and Protocols. , (2015).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).
- Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282 (2014).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
- Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
- Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
- Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
- Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
- Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
- Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
- Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
- Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
- Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).
