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方法文章

基于图像的中性粒细胞胞外诱捕网自动化定量分析：采用 NETQUANT 方法

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DOI：

10.3791/58528

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2019年11月27日

 , 
1Department of Clinical Sciences, Division of Infection Medicine, Lund University

本文内容

摘要

本文介绍了一种生成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的实验方案，以及NETQUANT的操作方法；NETQUANT是一种用于定量免疫荧光图像中NETs的全自动软件工具。

摘要

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是由DNA和颗粒来源的抗菌蛋白组成的网状抗菌结构。免疫荧光显微镜结合基于图像的定量方法仍是定量中性粒细胞胞外诱捕网形成的重要工具。然而，目前可用于定量NETs的免疫荧光方法存在若干关键局限性。基于图像的手动定量方法通常具有主观性，容易出错，且对用户而言繁琐费时，尤其对缺乏经验的操作者更是如此。此外，目前可用的定量软件要么为半自动，要么在使用前需要专门培训。本文中，我们展示了NETQUANT——一种基于免疫荧光图像的自动化定量方法，用于评估NET的形成。该软件易于使用，具备用户友好的图形界面（GUI）。它综合考虑了若干生物学相关参数，如细胞表面积的增加、DNA与NET标志蛋白的比值变化以及细胞核形态的改变，以定义NET的形成。此外，该工具以免费应用程序的形式开发，支持单细胞分辨率的定量与分析。

引言

中性粒细胞是抵御多种微生物病原体先天宿主防御反应的关键介导者1。它们通过释放含有多种抗菌蛋白的颗粒2、产生活性氧（ROS）和次氯酸1，以及通过吞噬作用3来执行其抗菌功能。此外，Brinkmann et al.4 描述了中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）作为一种新型机制，可使中性粒细胞捕获并清除入侵的病原体。自十余年前被发现以来4，NETs 已被证实与多种感染性5,6和非感染性7疾病相关。NET 的形成是一个主动过程，最终导致染色质 DNA 被颗粒来源的抗菌蛋白包裹后被排出细胞外8。与 NET 形成相关的细胞和细胞核形态学的一些关键变化包括核形态的丧失、染色质去浓缩、颗粒蛋白从细胞质向细胞核的转移，以及细胞核和细胞直径的增大8,9。

呈网状结构的NETs，其形态可表现为略大于细胞的弥散结构，或为单个中性粒细胞数倍大小的结构，通常被视为NETosis的指标5,10。通过荧光显微镜，可使用荧光探针（如4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI））标记DNA，并结合针对NET结合蛋白（如中性粒细胞弹性蛋白酶）的免疫荧光染色来检测NETs。通过定量分析DNA与NET结合蛋白染色信号的共定位区域，可测定图像中NETs覆盖的总面积11。

目前有多种图像分析方法可用于基于荧光图像的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）定量11,12。但这些软件存在局限性，表现为不够用户友好和/或缺乏完全自动化功能。本文中，我们展示了NETQUANT13的操作方法，该软件是一款免费提供的应用程序，可实现无偏倚、全自动的免疫荧光显微图像基础上的NET定量分析。该程序具备用户友好的图形界面（GUI），并可进行单细胞分析。该软件通过检测DNA-NET结合标志物的形态变化、染色质去浓缩所伴随的细胞核变形以及DNA与NET结合蛋白比率的升高，来量化图像中的NETosis过程。综上所述，基于多个NET定义标准，该方法可在多个数据集中实现严格且无偏倚的NET定量。

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方案

隆德大学伦理委员会批准了根据《赫尔辛基宣言》（2013/728）从健康志愿者采集静脉血（2013/728）。所有志愿者均签署了书面知情同意书。

1. 使用密度梯度离心法分离外周血中性粒细胞

  1. 在含有肝素的试管中采集人静脉血，并将试管放置至室温。
    注意：需至少采集健康供体16 mL血液，以获得足够大的细胞沉淀。
  2. 将血液与等体积的生理盐水（0.9% NaCl）中2%右旋糖酐混合，在无菌50 mL锥形离心管中室温静置沉降30分钟。
  3. 将上清液吸出至无菌50 mL锥形离心管中，在4 °C下以200 × g离心10分钟。
  4. 从本步骤起，后续分离操作均在4 °C或冰上进行。
  5. 将沉淀用5 mL冰浴生理盐水重悬，并叠加于无菌15 mL锥形离心管中5 mL白细胞分离梯度液（含9.1%泛影酸钠与5.7%右旋糖酐，w/v）之上。
  6. 在4 °C下以400 × g离心30分钟。
  7. 吸除上清液并弃去。
  8. 通过将沉淀重悬于3 mL冰浴去离子水中30秒以裂解红细胞；立即加入1 mL 3.6% NaCl溶液，随后补加10 mL冰浴生理盐水。
  9. 将细胞悬液以350 × g离心10分钟。
  10. 移除上清液，收集细胞沉淀并用1 mL生理盐水重悬。取10 µL细胞悬液置于微量离心管中，用于台盼蓝染色结合Bürker计数板评估细胞数量与活力。
  11. 将10 µL细胞悬液加入90 µL 0.4%台盼蓝溶液中。取10 µL混合液置于Bürker计数板中，计数计数室四角由三条线围成的四个方格内的细胞。因摄取染料而呈深蓝色的细胞为无活力细胞，计数时应排除。
  12. 根据以下公式计算细胞浓度（单位：个细胞/mL）。
    细胞计数公式示意图：使用台盼蓝和计数室因子、稀释因子计算细胞数/mL。
    注意：此处计数室因子为10,000，稀释因子为10，计数方格总数为4。
  13. 将剩余细胞悬液定容至10 mL，进行最终洗涤步骤。
  14. 以200 × g离心5分钟。
  15. 将中性粒细胞重悬于含2 mg/mL热灭活人血清白蛋白（HSA）的RPMI-1640培养基中，细胞浓度为5 × 105 个细胞/mL。

2. 盖玻片的准备与中性粒细胞的刺激

  1. 在12孔板的每个孔中放入一个盖玻片（10 mm，#1），加入200 µL 0.01%多聚-L-赖氨酸溶液覆盖盖玻片，并于37 °C孵育过夜。
  2. 用300 µL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤盖玻片一次，然后静置干燥。
  3. 向每孔加入400 µL浓度为5 × 105 个中性粒细胞/mL的细胞悬液，在室温下孵育15分钟。
  4. 将含有中性粒细胞的培养板转移至37 °C、含5% CO2的培养箱中孵育15分钟。
  5. 移除上清液。对照组每孔加入400 µL预热的含2 mg/mL人血清白蛋白（HSA）的RPMI-1640培养基；实验组每孔加入300 µL预热的含20 nM佛波醇12-十四烷酸酯13-乙酸酯（PMA）的RPMI培养基以进行刺激。
  6. 在37 °C、含5% CO2的条件下刺激中性粒细胞150分钟。

3. NETs 的可视化

  1. 吸去上清液，用 200 µL PBS 将样品洗涤 2 次。
  2. 加入 200 µL 含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS，37 °C 下固定 20 分钟。
    注意：PFA 具有毒性，操作时需小心谨慎。
  3. 用 200 µL PBS 将样品洗涤 3 次。
  4. 加入 50 µL 0.5% Triton X-100，处理 30 秒以通透样品。
  5. 用 200 µL PBS 将样品洗涤 3 次。
  6. 用含 5% 山羊血清的 PBS 在 37 °C 下封闭样品 1 小时。
  7. 加入 300 µL 一抗（兔抗人中性粒细胞弹性蛋白酶），用封闭液按 1:500 稀释，在 37 °C 下孵育 90 分钟。
  8. 用 300 µL PBS 将样品洗涤 3 次。
  9. 加入 300 µL 二抗（山羊抗兔荧光抗体），按 1:1000 稀释，在 37 °C 下孵育 90 分钟。
  10. 用 300 µL PBS 将盖玻片洗涤 3 次。
  11. 将盖玻片从孔中取出，加入 10 µL 含 DAPI 的封片剂封片。室温避光放置过夜，使样品干燥。
    注意：使用 DAPI 对 DNA 进行染色是该方法中的关键步骤。用户也可通过以下方式进行排查：加入外源性 DAPI 溶液，终浓度为 0.1‒0.5 µg/mL，孵育 2‒3 分钟，随后用 300 µL PBS 洗涤 3 次。
  12. 使用 20X 物镜在宽场荧光显微镜下采集图像。

4. 使用 NETQUANT 分析与定量中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）

注意：可通过点击 Zenodo Github 归档或 Nordenfelt 实验室网站（https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34）上的安装文件下载 NETQUANT。

  1. 导入数据集进行分析、通道命名及图像转换
    1. 在 NETQUANT 中打开 Setup 选项卡。
    2. 在源菜单中点击 Get path 选项，选择待分析图像序列所在的文件夹作为分析源路径。
    3. 在目标菜单中点击 Get Path 选项，选择用于保存图像分析后数据的文件夹。
    4. 对通道进行命名，使“DNA channel”对应图像中的 DNA 染色（例如，DNA 或 DAPI），而“NET-channel”对应图像中 NET 结合蛋白的染色（例如，NET、中性粒细胞弹性蛋白酶）。为确保软件正常运行，建议将包含对照图像文件的文件夹命名为“control”。
      注意：NET 通道仅指 NET 结合的颗粒蛋白标记物的染色。
    5. 点击 Image information 子菜单中的 Load image information 按钮，将图像元数据输入软件。
    6. 在 Channel order 子菜单中选择图像中包含的正确通道顺序。此选项作为安全机制，防止意外的通道错配。
    7. 点击 Prepare data button 按钮，从原始数据中获取主要图像属性并转换图像。转换后的图像将出现在 Sample type 子菜单中。点击 Sample type 菜单以显示并选择所有已获取的待分析数据集。
    8. 从 Sample type 子菜单中选择一幅图像，点击 Display image data 按钮，分别显示拆分为 DNA 通道和 NET 通道的图像。
  2. 在 DNA 通道和 NET 通道中对细胞进行分割
    1. 通过点击 DNA 通道和 NET 通道中的 Method 子菜单，选择分割方法。
      注意：默认的分割方法设为 adaptive，此为推荐设置。其他可选方法包括 global、edge 和 Chan-Vese。还提供了一种 watershed 选项，以帮助区分位置邻近的细胞或 NETs。
    2. 进入 Segmentation 选项卡，点击 Segment control samples 选项，首先对两个通道中的对照样本进行分割。
    3. 在样本类型子菜单中选择 PMA，点击 Batch 选项（推荐）以开始对数据集中包含的所有图像进行批量分割。在样本类型菜单中选择图像，点击 Display image data 按钮，以可视化并验证分割后生成的二值图像掩膜（DNA 掩膜和 NET 掩膜）。
  3. 可识别特征的单细胞分析
    1. 进入分析选项卡，点击 Determine threshold 按钮，分析对照样本。
    2. 将样本类型更改为 PMA，点击 Get cell properties 按钮，完成对刺激样本的分析。
    3. 从 Sample type 子菜单中选择一幅图像，点击 Display image data 按钮，显示图像的叠加结果以及图像中的细胞总数和形成 NET 的细胞数量。
  4. 比较细胞特征以识别 NET 形成细胞
    1. 从样本类型子菜单中选择样本，点击 Analyze NETs 按钮完成分析。可从样本类型子菜单中选择单个图像进行分析，或通过选择批量选项（推荐）对整批图像进行分析。
    2. 手动调整 NET 判定标准，以获得特定样本的最佳结果。将识别出的 NETs 与原始图像进行比较，以评估识别质量。
      注意：所确定的 NET 判定标准可应用于数据集中的所有图像。对 NET 判定标准的任何更改将同时应用于所有对照样本，从而限制因 NET 参数过拟合而可能产生的差异。用户可根据需要调整 NET 判定标准中的设置。此前已有研究探讨了假发现率与 NETQUANT 之间的关系13。典型的面积增加范围为 2–4，圆度为 0.7–0.9，DNA/NET 比值为 0.6–2.0。
    3. 在 Cell data 子菜单中检查数据摘要，其中显示了图像数量、每幅图像的细胞计数及每幅图像中 NETs 的百分比。
      注意：“NET-gauge”显示整个数据集中 NETs 的总百分比。NET-gauge 下方的摘要统计表中显示总图像数、总细胞数、样本中 NETs 的百分比（NETs%）以及对照样本中 NETs%。我们建议将对照数据与刺激样本的数据一同报告。
  5. 结果输出
    1. 进入 Output 选项卡，选择并查看结果输出。
    2. 通过选择输出形式并点击 Output results 按钮，探索并比较对照和 PMA 分析生成的各种数据输出。
      注意：分析完成后生成的所有数据（包括对照和刺激样本）均保存在目标子菜单中选定的分析文件夹中。数据以 .csv 或 .pdf 格式保存。
    3. 启动 Method file 以获取用于分析的软件版本和 NET 判定标准（用于发表时的方法部分）。
    4. 点击 Results data table 以可视化特定样本中的各个数据点。
    5. 可视化样本中 NET 面积分布及 DNA:NET 比值。图中红线表示阈值。
    6. 点击 Bivariate distribution 文件，确定 NET 面积与 DNA 形状之间的关系。
  6. 加载先前分析结果及批量执行所有步骤
    1. 使用 Load previous analysis 按钮，将先前成功的分析设置加载至 NETQUANT 中。
    2. 使用 Setup 菜单中包含的 Batch all steps 按钮，直接运行步骤 5–12（Figure 1， Figure 2， Figure 3， Figure 4， Figure 5），以获得最终输出结果。

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结果

将 5 × 105 个中性粒细胞/mL 接种到置于 12 孔板中的盖玻片上，用 20 nM PMA 刺激或不进行刺激，处理 150 分钟。随后使用一抗兔抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体、二抗荧光标记的山羊抗兔 IgG 抗体以及 DAPI（一种可荧光标记 DNA 的染料）对样本进行染色（详见材料表）。使用落射荧光显微镜和 20X（NA = 0.75）物镜，至少采集 5 张图像。用于本文中测试分析的示例数据可通过点击链接 https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34 上的样本数据集图标进行下载。

本文描述了NETQUANT工作流程（图1）在特定样本中定量中性粒细胞胞外诱捕网（NET）...

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讨论

中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成是中性粒细胞多种防御机制中相对较新的一种4，近年来，研究者对NET在多种研究领域中的作用产生了显著增长的兴趣5,7,14,15。利用免疫荧光显微镜获取图像并进行基于图像的定量分析，是目前广泛用于NET定量的方法。该方法的优势在于能够在单细胞水平上检测正在形成NET的细胞，从而更有效地降低背景信号。人工定量方法可能极为耗时、缓慢，并易受操作者主观偏差的影响。目前已有一些半自动化的分析工具，可为用户提供可靠的分析结果11,12，但这些工具在操作上可能需要较高的技术能力，或在定量过程中仍需执行多个手动步骤，这对此前缺乏经验的操作者而言尤其具有挑战性。在最近的一项研究中，已有研究者采用完全自动...

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披露

TM 和 PN 拥有与 NETQUANT 中使用的算法相关的待批准专利。

致谢

本工作由 Crafoord 基金会（TM 和 PN）、瑞典政府研究基金（PN、TM）、瑞典研究理事会（PN）和 Groschinsky 基金会（TM、PN）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BD Vacutainer 肝素化塑料管BD Biosciences367885
LymphoprepAxis-Shield114547
含 L-谷氨酰胺的 RPMI-1640 培养基Gibco11835-030
50 mL 锥形瓶Sarstedt62.547.004
15 mL 锥形瓶Sarstedt62.554.002
12 孔组织培养板Falcon10626491
#1 盖玻片，10 mmMenzel GlaserCS10100
载玻片Menzel Glaser631-0098
一抗：抗人弹性蛋白酶抗体DAKODAKO rabbit 1373, contract immunization
二抗：荧光标记山羊抗兔抗体Life technologiesA-11072, A-11070
含 DAPI 的 PROLONG-Gold 抗荧光淬灭封片剂Life technologiesP36930封片介质
山羊血清Sigma-AldrichG9023
佛波醇-12-十四烷酸-13-乙酸酯（PMA）Sigma-Aldrich79346
多聚甲醛Sigma-Aldrich158127
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Nikon Ti-E 正置荧光显微镜Nikon
CCD 相机Andor Zyla
Plan Apochromat 20x、40x 物镜Nikon
Windows 10Microsoft操作系统
macOS Sierra 10.12Apple操作系统
MATLABMathworks

参考文献

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