本文介绍了一种生成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的实验方案，以及NETQUANT的操作方法；NETQUANT是一种用于定量免疫荧光图像中NETs的全自动软件工具。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是由DNA和颗粒来源的抗菌蛋白组成的网状抗菌结构。免疫荧光显微镜结合基于图像的定量方法仍是定量中性粒细胞胞外诱捕网形成的重要工具。然而，目前可用于定量NETs的免疫荧光方法存在若干关键局限性。基于图像的手动定量方法通常具有主观性，容易出错，且对用户而言繁琐费时，尤其对缺乏经验的操作者更是如此。此外，目前可用的定量软件要么为半自动，要么在使用前需要专门培训。本文中，我们展示了NETQUANT——一种基于免疫荧光图像的自动化定量方法，用于评估NET的形成。该软件易于使用，具备用户友好的图形界面（GUI）。它综合考虑了若干生物学相关参数，如细胞表面积的增加、DNA与NET标志蛋白的比值变化以及细胞核形态的改变，以定义NET的形成。此外，该工具以免费应用程序的形式开发，支持单细胞分辨率的定量与分析。
引言
中性粒细胞是抵御多种微生物病原体先天宿主防御反应的关键介导者1。它们通过释放含有多种抗菌蛋白的颗粒2、产生活性氧（ROS）和次氯酸1，以及通过吞噬作用3来执行其抗菌功能。此外，Brinkmann et al.4 描述了中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）作为一种新型机制，可使中性粒细胞捕获并清除入侵的病原体。自十余年前被发现以来4，NETs 已被证实与多种感染性5,6和非感染性7疾病相关。NET 的形成是一个主动过程，最终导致染色质 DNA 被颗粒来源的抗菌蛋白包裹后被排出细胞外8。与 NET 形成相关的细胞和细胞核形态学的一些关键变化包括核形态的丧失、染色质去浓缩、颗粒蛋白从细胞质向细胞核的转移，以及细胞核和细胞直径的增大8,9。
呈网状结构的NETs....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
隆德大学伦理委员会批准了根据《赫尔辛基宣言》（2013/728）从健康志愿者采集静脉血（2013/728）。所有志愿者均签署了书面知情同意书。
1. 使用密度梯度离心法分离外周血中性粒细胞
- 在含有肝素的试管中采集人静脉血，并将试管放置至室温。
注意：需至少采集健康供体16 mL血液，以获得足够大的细胞沉淀。 - 将血液与等体积的生理盐水（0.9% NaCl）中2%右旋糖酐混合，在无菌50 mL锥形离心管中室温静置沉降30分钟。
- 将上清液吸出至无菌50 mL锥形离心管中，在4 °C下以200 × g离心10分钟。
- 从本步骤起，后续分离操作均在4 °C或冰上进行。
- 将沉淀用5 mL冰浴生理盐水重悬，并叠加于无菌15 mL锥形离心管中5 mL白细胞分离梯度液（含9.1%泛影酸钠与5.7%右旋糖酐，w/v）之上。
- 在4 °C下以400 × g离心30分钟。
- 吸除上清液并弃去。
- 通过将沉淀重悬于3 mL冰浴去离子水中30秒以裂解红细胞；立即加入1 mL 3.6% NaCl溶液，随后补加10 mL冰浴生理盐水。
- 将细胞悬液以350 × g离心10分钟。
- 移除上清液，收集细胞沉淀并用1 mL生理盐水重悬。取10 µL细胞悬液置于微量离心管中，用于台盼蓝染色结合Bürker计数板评估细....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
将 5 × 105 个中性粒细胞/mL 接种到置于 12 孔板中的盖玻片上，用 20 nM PMA 刺激或不进行刺激，处理 150 分钟。随后使用一抗兔抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体、二抗荧光标记的山羊抗兔 IgG 抗体以及 DAPI（一种可荧光标记 DNA 的染料）对样本进行染色（详见材料表）。使用落射荧光显微镜和 20X（NA = 0.75）物镜，至少采集 5 张图像。用于本文中测试分析的示例数据可通过点击链接 https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34 上的样本数据集图标进行下载。
本文描述了NETQUANT工作流程（图1）在特定样本中定量中性粒细胞胞外诱捕网（NET）.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成是中性粒细胞多种防御机制中相对较新的一种4，近年来，研究者对NET在多种研究领域中的作用产生了显著增长的兴趣5,7,14,15。利用免疫荧光显微镜获取图像并进行基于图像的定量分析，是目前广泛用于NET定量的方法。该方法的优势在于能够在单细胞水平上检测正在形成NET的细胞，从而更有效地降低背景信号。人工定量方法可能极为耗时、缓慢，并易受操作者主观偏差的影响。目前已有一些半自动化的分析工具，可为用户提供可靠的分析结果11,12，但这些工具在操作上可能需要较高的技术能力，或在定量过程中仍需执行多个手动步骤，这对此前缺乏经验的操作者而言尤其具有挑战性。在最近的一项研究中，已有研究者采用完全自动.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
TM 和 PN 拥有与 NETQUANT 中使用的算法相关的待批准专利。
致谢
本工作由 Crafoord 基金会（TM 和 PN）、瑞典政府研究基金（PN、TM）、瑞典研究理事会（PN）和 Groschinsky 基金会（TM、PN）资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BD Vacutainer 肝素化塑料管 | BD Biosciences | 367885 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 114547 | |
| 含 L-谷氨酰胺的 RPMI-1640 培养基 | Gibco | 11835-030 | |
| 50 mL 锥形瓶 | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 15 mL 锥形瓶 | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 12 孔组织培养板 | Falcon | 10626491 | |
| #1 盖玻片，10 mm | Menzel Glaser | CS10100 | |
| 载玻片 | Menzel Glaser | 631-0098 | |
| 一抗：抗人弹性蛋白酶抗体 | DAKO | DAKO rabbit 1373, contract immunization | |
| 二抗：荧光标记山羊抗兔抗体 | Life technologies | A-11072, A-11070 | |
| 含 DAPI 的 PROLONG-Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Life technologies | P36930 | 封片介质 |
| 山羊血清 | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| 佛波醇-12-十四烷酸-13-乙酸酯（PMA） | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Nikon Ti-E 正置荧光显微镜 | Nikon | ||
| CCD 相机 | Andor Zyla | ||
| Plan Apochromat 20x、40x 物镜 | Nikon | ||
| Windows 10 | Microsoft | 操作系统 | |
| macOS Sierra 10.12 | Apple | 操作系统 | |
| MATLAB | Mathworks |
参考文献
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Nordenfelt, P., Tapper, H.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
