Summary
Bu iletişim kuralı görüntüleme sistemi içinde çeşitli hücre tiplerinin bir canlı hücre kullanarak gerçek zamanlı akını oranları ile LDL kolesterol alımını ölçme verimli bir yaklaşım sağlar. Bu teknik Farmakolojik aktivite LDL akını hücre morfolojisi ve dolayısıyla potansiyel sitotoksisite izleme sırasında etkileyen bileşiklerin ekran için bir platform sağlar.
Abstract
LDL kolesterol alımını LDLR aracılı endositoz ile düzenlenmesi çalışmada metabolik bozukluğu, kalp-damar hastalıkları ve böbrek hastalığı da dahil olmak üzere çeşitli büyük patolojileri önemli bir alandır. Şu anda, aynı anda için hücrelerin sağlığını izleme sırasında LDL alımını değerlendirmek için kullanılabilir hiçbir yöntemi yoktur. Çalışmada eşzamanlı hücre sağlık için izleme ile LDL akını seri ölçümler elde etmek için canlı hücre görüntü analiz sistemi kullanan bir Protokolü sunar. Bu roman tekniği üç insan hücre hatlarında (karaciğer, böbrek borulu epitel ve koroner arter endotel hücreleri) dört saat boyunca test edilmiştir. Ayrıca, bu teknik duyarlılığını iyi bilinen LDL alım inhibitörleri, Dynasore ve rekombinant PCSK9 protein ile yanı sıra bir LDL alımını organizatörü, Simvastatin tarafından doğrulanır. Birlikte ele alındığında, bu yöntem aynı anda Farmakolojik aktivite eleme hem de hücre morfolojisi, dolayısıyla sitotoksisite LDL akını düzenleyen bileşiklerin izleme için bir orta yüksek üretilen iş platformu sağlar. Analiz farklı görüntüleme sistemleri ve analitik yazılım ile kullanılabilir.
Introduction
Dolaşan LDL kolesterol düzeyleri kalp-damar hastalıkları1, böbrek hastalığı2 gibi çeşitli inflamatuar özünde LDL düşük yoğunluklu Lipoprotein reseptör LDLR-aracılı endositoz çalışmanın önemli bir alan olduğu hastalıklar3 ve genetik bozukluklar mutasyonlar kolesterol taşıma genler4,5,6,7ile. LDLR-aracılı kolesterol akını çalışmalarda kimyasal Dynasore8,9,10, aynı zamanda LDL düzenleyen de dahil olmak üzere Dynamin inhibitörleri gibi birden çok araştırma araçları tanımlaması yol açmıştır proteinler gibi Proprotein konvertaz Subtilisin/Kexin 9 (PCSK9)11,12yazın.
LDL-LDLR endositoz yolu clathrin kaplı çukurlar13içine hücre yüzeyindeki LDL-LDLR kompleks iyon ile başlar. Veziküller sonra taşıma hücre içindeki boşluklara da LDL-LDLR komplekse özümseyerek hücre yüzey membran invagination tarafından oluşturulur. Kurulan vezikül erken ve o zaman geç endosomes geliştikçe, pH LDL ayırma--dan onun reseptör14neden geç endosome içinde bırakır. Geçmişte, LDL akını miktar yöntemleri radyo etiketli 125-LDL Co kuluçka hücreleri ve sonraki çıkarma hücreler miktar15için radyo etiketli protein ile bağlıydı. Bu o zaman kullanım dıı-LDL ve sonraki immunostaining gibi fluorescently etiketli LDL proteinlerin veya floresan okuma bir spektrofotometre veya plaka okuyucu15,16kullanarak için protein çıkarımı tarafından değiştirildi. Fluorescently etiketli LDL da (FACS) sıralama floresans aktif hücreye LDL ve hücre yüzey LDL bağlama17içselleştirilmesi analizi için kullanılmıştır. Hücrelerin canlılık tedavi sırasında izleme veri toplama sonra tedavi için bu yöntemleri izin verirken mümkün değildir.
Geç endosome Asidik pH floresan LDL pH-harekete geçirmek sonda pHrodo sonra içselleştirilmesi18,19fluoresces kırmızı LDL gibi bir kullanımına izin verir. LDL alımını değerlendirme canlı hücrelerdeki sürekli zamanlı kurs için bu özellik sağlar. Bu nedenle, bu iletişim kuralını pHrodo kırmızı-LDL floresans görüntüleme canlı hücre Analizi hücre sağlık için eş zamanlı izleme ile seri olarak ölçü LDL alımı için kullanır. Bu roman tekniği güvenilirliğini olarak üç farklı insan hücre hatları, insan hepatik Karsinomu (HepG2) hücreleri, insan renal epitel (HK2) hücreleri ve insan koroner damar endotel hücreleri (HCAEC dört saatlik zaman ders üzerinde test sonuçlar gösterir ). Bu hücre satırları LDL izni20,21,22,23,24,25,-26,27 klinik olarak anlamlı , böbrek hastalığı28,29,30,31ve kalp hastalığı32,33, anılan sıraya göre. LDL akını izleme özelliğine ek olarak, bu protokolü ile iki iyi bilinen LDL alım inhibitörleri, Dynasore hidrat ve rekombinant PCSK9 protein yanı sıra LDLR ifade ve LDL alımı, simvastatin statin bir uyarıcı tedavi içerir. Dynasore ve rekombinant PCSK9 her LDL alımını azaltmak için farklı yollar çalışır.
Dynasore Dynamins10 küçük molekül inhibitörü ve clathrin bağımlı endositoz LDL-LDLR karmaşık10,34engelleyerek LDL alımını azaltır. Rekombinant PCSK9, öte yandan, peptidaz LDLR için bağlar ve onun hücre yüzeyine LDL içselleştirilmiş karmaşık gerekli konformasyon değişiklikleri35,36 bloke ederek bırakmadan sonra geri dönüşüm engeller S8 ailesinin bir üyesidir . Azalma hücre yüzey LDLR yoğunluğu sonunda hücre tarafından düşük LDL alımı için yol açar. Statinler, doğrudan 3-hidroksi-3-methylglutaryl-koenzim (HMG-CoA) redüktaz enzim ve böylece kolesterol sentezi, engelleme de upregulate için artan LDL alımı için önde gelen LDLR25,38 ifade bilinir. Bu iletişim kuralı duyarlılığını LDL akını üç klinik insan hücre hatları, HK2, HepG2 ve HCAECs, Dynasore ve/veya rekombinant PCSK9, ve HepG2 hücreleri tarafından LDL Anlamazdın belirgin bir artış önemli indirimler algılayarak doğrulanır Simvastatin hücre morfolojisi/sağlık için izleme ile dört saatlik zaman ders. Birlikte ele alındığında, bu yöntem için aynı anda tarama Farmakolojik aktivite ve sitotoksisite bileşiklerin canlı hücrelerdeki LDL alımını düzenleyen bir orta yüksek üretilen iş platformu sağlar.
Protocol
1. tohum hücreleri bir 24-şey plaka
- Medya hücreleri Aspire edin, Dubelco'nın fosfat tamponlu tuz (dPBS) 5 mL hücrelerle yıkama ve dPBS Aspire edin. 100 mm çanak HepG2 hücrelerdeki için 1.5 mL % 0.25 kullanmak tripsin/EDTA, ve HK2 için hücreleri veya HCAECs 1,5 mL % 0.05 tripsin/EDTA çözeltisi hücreleri ayırmak için kullanın.
- 37 ° C kuluçka plaka 4 dakika ya kadar hücreleri müstakil kuluçkaya. Tripsin 4 dakika kuluçka sonra HepG2 ve HK2 veya çözüm, dPBS artı % 5 fetal Sığır serum (FBS), nötralize tripsin 3 mL için komple bir medya 3 mL ekleyerek HCAEC hücreler için etkisiz hale getirin.
- Hücreleri 15 mL konik tüpler içine aktarmak ve 5 min için 250 x g, santrifüj kapasitesi, medya Aspire edin ve hücre Pelet tam medyada yeniden askıya alma.
- Hücre süspansiyon yavaşça hücre kümeleri kadar kırmak için bir 40 mikron kafes süzgeç aracılığıyla filtre. Hücreleri süzgeç aracılığıyla yıkama yok.
- Hücreleri saymak ve onları en iyi duruma getirilmiş bir yoğunluk plakası. Örneğin, iyi HepG2 hücreleri veya HK2 hücreleri veya HCAECs kuyuda bir 24-şey plaka başına 10.000 hücre başına 5000 hücre en iyi sonuçlara neden.
- Gecede 37 ° C'de hücreler eklemek izin vermek için plaka kuluçkaya.
- Ertesi gün, hücre hücre satırı (olmadan FBS) için medya % 5 temel ortama değiştirmek Lipo Protein eksik Serum (LPDS) veya düşük (% 2) FBS medyaya bağlı olarak tedavi (1.7 bakın). Ardından, kuluçka hücreleri açlıktan 24 h için devam edin. 24-şey plaka bir kuyu başına 500 μL Toplam medya kullanın.
- Üç yoldan biriyle hücreleri tedavi: 10 µg/mL rPCSK9 (veya araç) ekleyin ve 1 saat, 37 ° C kuluçka hücrelere Dynasore hidrat (veya araç, dimetil sülfoksit) 40 µM ekleme ve hücreleri 37 ° C kuluçka için 10 dakika geri dönmek , veya 1 µM Simvastatin (veya araç, dimetil sülfoksit) eklemek ve hücreleri 37 ° C kuluçka 12, 18 veya 24 saat boyunca dönmek. Medya % 5 ile kullanmak için rPCSK9 veya Dynasore tedavi LPDS. Düşük (% 2) kullanın FBS veya ortamlardan % 5 LPDS Simvastatin tedavileri ile.
Not: istediğiniz bileşikler hücrelerle tedavi medya değişim için zaman lipoprotein açlık (adım 1.6) uzun süreli deneyler için veya analiz öncesinde kısa süreli deneyler için yapılabilir. Alternatif olarak, özelleştirilmiş tedavi kez türü ve deneyler amacı bağlı seçilebilir. - Sonra pHrodo kırmızı etiketli LDL (1 mg/mL stok) 5 µL 10 µg/mL nihai bir konsantrasyon elde etmek için her şey için ekleyin. O zaman, dikkatli bir şekilde herhangi bir kabarcıklar kuyulardan çıkarın.
2. canlı hücre Analizi
- Hemen etiketli LDL ekledikten sonra plaka canlı hücre Analizi sistemi kuluçka makinesine yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) ve yoğunlaşma plaka azaltmak 15 dakika equilibrate için plaka izin.
- Bu arada, belgili tanımlık bilgisayar yazılımı açın ve plaka tutarak gemi ekleyerek tarama planlamak. Resim 16 kare / 10 X 4 kırmızı ve faz kanallarını kullanarak saat boyunca 1 saat aralıklarla kuyuda.
- Veri işleme için kullanmak için bir plaka haritası oluşturun.
- Özellikler sekmesini tıklayın plaka haritaseçin. Girdi belgili tanımlık hücre tipi ve bileşikleri sekmesini tedavi sonuçlarının karşılaştırılması.
- Bölgeler sekmesini, çoğaltır her kümesi seçin ve bölgeleri olarak kaydedin.
3. analiz parametrelerini ayarlama
- Deneysel bir çalışma tamamlandıktan sonra sayım kümesinde kapsanan her parametre ölçmek için bilgisayarı eğitmek için yazılım bir görüntü kümesi oluşturun.
- Yazılım, plaka görünümü açın, sonra Analiz iş araçları kutusunda Oluştur veya resim koleksiyonu Ekleseçin.
- Yeni resim koleksiyonuseçin, görüntü koleksiyon için bir ad yazın ve faz ve kırmızı kanalları Kanal yanındaki kutuları işaretleyerek seçin.
- 5 daha çok resim seçin ve geçerli resim koleksiyonuna ekleyerek resim koleksiyonuna ekleyin.
- Hücreleri için işleme tanımı oluşturun. Tablo 1 HepG2, HK2 ve HCAE hücre tanımları bu LDL akını protokol işleme parametrelerini içerir.
- Analiz iş araçları kutusunda, Yeni işlem tanımıseçin. Adım 2.1.2 açılır menüden'adlı resim koleksiyonunu seçin. Giriş parametreleri Tablo 1hücrelerden türü için.
- Önizleme kutusunda, Önizleme tümseçmek için menüyü kullanın.
- Analiz maskesi kutusunda İzdiham maskesi ve Kırmızı nesne maske kutuları işlem tanımı için analiz dahil alanını görüntülemek için denetleyin. Bkz: Şekil 1.
- Hücreleri ve LDL maskede eklenir emin olmak için resim koleksiyonu arasında ilerler. Dosya ve işleme tanımını kaydetmek seçin.
- Deneysel çalışma görüntülerden dizi analiz.
- Deneme plaka görünümünde açın. Denize indirmek yeni analiz iş Analizi iş araçları kutusunda seçin. Kaydedilmiş işlem tanımı'nı seçin.
- Analiz iş adı, analiz için zaman aralığı seçin ve analiz etmek için deneysel wells vurgulayın. Başlat düğmesini tıklatın.
4. analiz ve veri işleme
- Analiz iş tamamlandıktan sonra verileri verebilirsiniz:
- Tamamlanan analiz seçin ve göstertuşuna basın. Utilities menüsünden Ölçü/grafik vermeseçin.
- Bölgeler menüde Bütün Wells, seçin ve Grup menüde almayı kümelerine wells bir grup olarak ortalama değerler çoğaltır seçin ve vermek için tek tek değerleri her şey için Yok'useçin.
- Kırmızı nesne metrik menüsünde Toplam kırmızı nesne entegre yoğunluk (RCU x µm2/Image)seçin. Bu parametre kırmızı sinyal yoğunluğu (RCU içinde) kez toplamı Toplam LDL alımını hücreleri tarafından karşılık gelen her şey üzerinde kırmızı sinyal (µm2) tüm belgili tanımlık imge içinde alanı gösterir.
- Veri ver düğmesini tıklatın. Bireysel görüntüleri veri yıkmakkontrol. Verileri otomatik olarak bir panoya kopyalanır ve yeni bir elektronik tablo dosyasına yapıştırılabilir.
- Faz nesne metrik menüsünde izdiham (yüzde)seçin. Bireysel görüntüleri veri yıkmakkontrol. Veri ver düğmesini tıklatın. Verileri otomatik olarak bir panoya kopyalanır ve toplam kırmızı nesne entegre yoğunluk veri içeren elektronik tablo dosyasına kopyalanabilir.
- Aşağıda ki formül ile toplam alan yüzde izdiham dönüşüm uygulanır.
Toplam faz alan (µm2/Image) = izdiham (%) × (resim yüksekliği (piksel) × kararlılık) × (resim genişliği (piksel) × kararlılık)
Not: her şey hücrelerde alanına karşılık gelen resim başına faz alanının yüzde izdiham izdiham (%) parametresi gösterir. Bu ölçüm her birey için toplam aşama alanına dönüştürülmesi gerektiğini bir kez ihraç görüntü. Faz kanal (resim yüksekliği, genişliği ve çözünürlük) deneysel her araç için yukarıdaki formül ile kullanılmak üzere görüntü spesifikasyonları Gemi özellikleri altında Görüntü kanallarınabakarak bulunabilir. - Toplam kırmızı nesne entegre yoğunluk olarak 4.1.6 kuyular arasında değişkenlik hücre yoğunluğu ortadan kaldırmak için tek tek her resim için aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanan toplam faz bölgesine normalleştirmek.
- Toplam kırmızı nesne entegre yoğunluk (RCU x µm2/Image) değerleri her resmin resim başına LDL alımı (RCU) değerler elde etmek için onun karşılık gelen Toplam faz alan (µm2/Image) bölün.
- Sonra her şey her şey ortalama LDL Anlamazdın elde edilir ve sonra grup elde etmek için tüm çoğaltma Wells LDL alımını değerlerin ortalamasını tüm görüntülerin LDL alımı (RCU) veri ortalama. Bu veriler son LDL alımını değerlerdir ve illüstrasyon ve yazılım kullanarak istatistiksel analiz için kullanılan.
Representative Results
Hücre canlı görüntüleme sağlayan güvenilir üç insan hücre satır kolesterol akını çalışmaları sırasında hücre sağlığını izlenmesinde
Biz bizim tahlil hangi kolesterol homeostazı yönetmelik insan hepatik Karsinomu (HepG2) hücreleri, insan renal epitel (HK2) hücreleri ve insan koroner arter endotel hücreleri de dahil olmak üzere büyük bir patofizyolojik rol oynar üç insan hücre hatlarında doğrulanmış (HCAECs). Biz canlı hücre görüntüleme sistemi LDL alımını tahlil seri ölçümler ile 4 h saat ders 1 saat aralıklarla gerçekleştirmek için kullanılır. Bizim sonuçları test tüm hücre tipleri bu yeni teknik ve sonucu sürekli LDL alımını 4,33 h akın çalışma süresi için son bitiş noktası (Şekil 2) gösteren eğrileri ile uyumlu olduğunu gösterir. Şekil 2 ' de gösterilen akını veri toplam pHrodo kırmızı etiketli LDL floresans normalleştirme tarafından elde edilmiştir (Toplam RCU x µm2 görüntü başına kırmızı nesne entegre yoğunluk/görüntü) her görüntünün her şey (faz nesne alanının µ görüntüde başına toplam hücre alanına hücre yoğunluğu değişkenliği wells ortadan kaldırmak için m2/Image). Ayrıca, LDL kolesterol alımını etkileyen bileşikler eleme amacıyla LDL akını Testin duyarlılığı doğrulamak için biz LDL akını, Dynasore ve rPCSK9 inhibe bilinen iki olumlu ve LDL ikna etmek için bilinen bir pozitif denetimi kullanılır alımı, Simvastatin. Dynasore ve rPCSK9, tedavi sonuçlarımız tarafından doğrulanmış olarak üç önemli indirimler LDL akını bir 4 h saat boyunca (Şekil 2A-C) gösterdi insan hücre hatları (HepG2, HK2 ve HCAEC) test. Örneğin, Şekil 2A LDL akını Dynasore tedavi süresi boyunca DMSO ile tedavi hücrelere kıyasla ile HepG2 hücrelerdeki azalır gösterir; DMSO denetimi işlenmemiş kontrol grubuna göre LDL akını üzerinde önemli bir etkisi vardı Dynasore için araç kontrol olarak. Ayrıca, bizim bulgular LDL alımını Simvastatin (Şekil 3) ile tedavi takip, LDL akını önemli değişiklikleri algılamak için bu yöntem duyarlılığını destekleyen HepG2 hücreleri tarafından belirgin bir artış gösterdi. Tipik süresi noktasıdır LDL alımı çalışmaları, 4.5 h zaman nokta hakkında LDL akını önemli ölçüde ya Dynasore ya da rPCSK9 tedavi ile azalır ve Simvastatin tedavi (Şekil 4) artırılması.
Bu sistem gerçek zamanlı görüntüler hücrelerinin incelenmesi bileşikler potansiyel sitotoksisite izlemek için kullanılan her şey verir canlı hücre LDL alımı çalışmaları için Imaging kullanarak bir büyük avantaj sağlıyor. Şekil 5-7 net LDL akını için görsel bir referans olarak ilk kez noktası (0.33 h) ve son bitiş noktası (4,33 h) araştırdı üç hücre hatları temsilcisi görüntüleri göstermektedir. Görüntüleri Dynasore veya rPCSK9 tedavileri takip, etkinliği ve güvenliği bu bileşiklerin gösteren hücre normal morfoloji onaylayın.
Canlı hücre Analizi verir güvenilir seri nicel kolesterol akını ölçümleri ile çeşitli tedaviler
Canlı bir hücre görüntüleme sistemi ile bu iletişim kuralını kullanan bir büyük avantajı saat ders boyunca veri toplamak ve LDL akını olarak geleneksel olarak yapılan bir son kez puan yerine birden fazla zaman puan karşılaştırmak için yeteneğidir. Bu iletişim kuralını kullanan, biz terminal zamanda noktada yanı sıra saat ders boyunca 1 saat aralıklarla yüzde reductionin LDL akını hesaplamak edebiliyoruz. Tablo 2 özetler LDL akını 10 dk öncesi tedavi 40 µM ile aşağıdaki üç test edilmiş insan hücre hatlarında azalma Dynasore veya 1 h ön arıtma ile 10 µg/mL rPCSK9. 4,33 h son çalışma bitiş noktası olarak 40 µM Dynasore ile tedavi azaltılmış anlamlı LDL akını HepG2 hücreleri, HK2 hücreleri ve HCAECs % 53, %68 ve % 54, sırasıyla (Tablo 2A-C) ve LDL azalma % 55 10 µg/mL, rPCSK9 ile tedavi sonuçlandı HK2 akını (tablo 2B)hücreleri. Terminal süresi noktası olduğu gibi geleneksel deneyleri miktarının yanı sıra, biz LDL akını nedeniyle tedavi, her zaman bir noktada deneme azalma kantitatif analiz gerçekleştirmek edebiliyoruz. Örneğin, tablo 2B LDL alımını bir azalma hücre sonuçlandı 1.33 h % 79, %67 2,33 h HK2 rPCSK9 ile tedavi, %59 3.33 h tedavi edilmezse hücrelere göre tedavi sonrası gösterir. Bu iletişim kuralı, tedaviden sonra LDL akını kantitatif analiz için güvenilir bir yöntem sağlar.
Resim 1 : Tanımı maskesi işleme. HK2 hücre temsilcisi görüntüleri ( Tablo 1' de ayrıntılı) uygun işlem tanımının uygulama takip tasvir edilmektedir. AreHK2 hücreleri ile faz Maskapplied (B),(a)maskeleme olmadan kırmızı nesne uygulanan maskesi (C) veya uygulanan faz ve kırmızı nesne maskeleri (D) ile gösterilir. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : LDL alımını canlı kullanarak azaltma 4,33 h saat boyunca görüntüleme sistemi hücre. Canlı hücre Analizi sistemi LDL akını insan hepatik Karsinomu (HEPG2) hücreleri(a), insan renal tübüler epitel (HK2) hücreleri (B) ve insan koroner arter endotel (HCAE) hücreleri (C) ölçmek için kullanılır. Hücreleri olumlu denetimler olarak Dynasore (belgili tanımlık koşmak önce 10 dak) veya rPCSK9 (belgili tanımlık koşmak önce 1 h) ile tedavi edildi. DMSO Dynasore tedavisi için bir araç olarak kullanılmıştır. Pozitif denetimleri tüm 3 hücre hatlarında LDL akını önemli ölçüde azalmıştır. LDL akını değerleri toplam faz nesne alanına (µm2/Image) Toplam kırmızı nesne entegre yoğunluk (RCUxµm2/Image) normalleştirme tarafından elde. Veri çoğu mean±SEM. N = 6 kuyu/grup. 2 veya 3 bağımsız deneyler temsilcisi verilerdir. p < 0,0001 vs boş, ve ###p < 0,0001 vs DMSO, iki yönlü ANOVA kullanarak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . LDL alımını görüntüleme sistemi 4,33 h saat boyunca canlı hücre kullanarak artış. Canlı hücre Analizi sistemi insan hepatik Karsinomu (HEPG2) hücrelerinde LDL akını ölçmek için kullanılır. LDL alımı % 2 içeren medyayı kullanarak tedavi Simvastatin ile 12 h (A), 18 h (B) veya 24 h (C) önemli ölçüde arttı FBS. 24 h saat noktası da % 5 içeren medya ile gerçekleştirildi (olmadan FBS) LPDS. DMSO negatif kontrol kullanıldı. LDL akını değerleri toplam faz nesne alanına (µm2/Image) Toplam kırmızı nesne entegre yoğunluk (RCU x µm2/Image) normalleştirme tarafından elde. Veri çoğu mean±SEM. N = 6 kuyu/grup. Bir bağımsız deney temsilcisi verilerdir. p < 0,0001 vs DMSO, öğrenci t-testi kullanarak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Önemli LDL akını azaltma LDL alımını düşürücü ajanlar 4.3 h zamanda noktada tarafından. LDL akını insan hepatik Karsinomu (HepG2) hücreleri(a), insan renal tübüler epitel (HK2) hücreleri (B) ve LDL alımı ile tedavi aşağıdaki insan koroner arter endotel (HCAE) hücreleri (C) önemli ölçüde azalır inhibitörleri Dynasore 10 dk veya rPCSK9 1 saat için. LDL akını belirgin Simvastatin HepG2 hücrelerdeki 12, 18 veya 24 s tedaviler sonra (D) artırılır. Veri çoğu mean±SEM. N = 6 kuyu/grup. 2 veya 3 bağımsız deneyler temsilcisi verilerdir. p < 0,0001 iki yönlü ANOVA kullanarak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . LDL akını hepatosellüler karsinom (HepG2) hücrelerinde LDL alımını düşürmek Aracı, Dynasore tarafından azaltılmış. Faz nesne ve HepG2 hücreler için kırmızı nesne temsilcisi görüntülerini 0,33 h (sol kapı aynası) olarak tasvir edilir ve 4,33 h bitiş noktası (doğru panelleri) hücreleri sağlıklı durumunu göster. 40 µM Dynasore, LDL-kolesterol alımını azaltmak için bilinen olumlu denetimi (C) olarak kullanılmıştır. Görüntüleri 10 X büyütme oranında alındı. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 . LDL akını insan hücrelerinde renal tübüler epitel (HK2) LDL alımını düşürmek aracılar, Dynasore ve rPCSK9 azaltılmış. Temsilcisi görüntüleri aşama nesne ve 0,33 h (sol kapı aynası) ve 4,33 h bitiş noktası (doğru paneller) tasvir HK2 hücreler için kırmızı nesne hücreleri sağlıklı durumunu göster. 40 µM Dynasore (C), veya 10 µg/mL rPCSK9 (D), LDL kolesterol alımını azaltmak için bilinen pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Görüntüleri 10 X büyütme oranında alınır. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7 . LDL akını insan koroner arter endotel hücrelerinde (HCAECs) LDL alımını düşürmek Aracı, Dynasore tarafından azaltılmış. Faz nesne ve kırmızı nesne için 0,33 h (sol kapı aynası) ve 4,33 h bitiş noktası (doğru paneller) tasvir HCAECs temsilcisi görüntülerini hücreleri sağlıklı durumunu göster. 40 µM Dynasore, LDL-kolesterol alımını azaltmak için bilinen olumlu denetimi (C) olarak kullanılmıştır. Görüntüleri 10 X büyütme oranında alındı. Ölçek çubuğu = 100 µm. veri çoğu mean±SEM. N = 6 kuyu/grup. 2 veya 3 bağımsız deneyler temsilcisi verilerdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tablo 1: tanımı parametreleri işleme. Bu parametreler, bu protokol için kullanılan analiz sistemi için özeldir. Kırmızı kırmızı kanalı alanında ve faz kanal hücreye alan çözümlemek için parametrelerin ayarlanması gerekir. HepG2, HK2, parametre ayarlarını HCAE hücre hatları sunulmaktadır.
Tablo 2: HepG2, HK2 ve HCAE hücrelerinde LDL akını yüzde değişim tedavi Dynasore, rPCSK9 veya Simvastatin ile 4.3 h'de (A)HepG2 hücreleri, (B) HK2 hücreleri, (C) HCAE hücreleri ve (D) HepG2 hücreleri.
Discussion
Geçerli protokol canlı hücre görüntüleme bir zaman ders çeşitli insan hücre hatlarında üzerinden gerçek zamanlı LDL alımını ölçmek için yeni ve daha etkili bir yöntem olarak kullanımını göstermektedir. İnsan hepatik Karsinomu (HepG2) hücreler kolesterol düşürücü tedavi21,22,23,24,25,26içineleme çalışmalarda yaygın olarak kullanılır, 39,40. Bu nedenle, bu hücre tipi canlı hücre görüntüleme sistemin LDL akını araştırmalar yeteneğini test etmek için seçti. Sonuçlarımız HepG2 hücreleri birarada olabilir ile bu yeni teknik ve sonuç olarak sürekli LDL alımını akını tahlil süresince kadar 4,33 h son bitiş noktası olarak gösteren bir sigmoid benzeri eğride gösterir (Şekil 2A ve Şekil 3 ).
Kolesterol homeostazı çeşitli nephropathies patofizyolojisi içinde önemli bir rol oynar. Nitekim, kolesterol birikimi böbrek dokusunda böbrek fibrozis kronik böbrek hastalığı için lider için büyük bir katkıda bulunuyor ve çeşitli nephropathies28,29,30,31yılında büyük bir patolojisi. Bu nedenle, Nefroloji alanında kullanılan bir popüler ve güvenilir hücre satır olarak insan hücrelerinde renal epitel (HK2) bizim yöntemi incelenmiştir. Bizim veri aynı zamanda LDL akını HK2 hücrelerdeki ölçmek için canlı hücre görüntüleme sistemi fizibilite desteklenen. Şekil 2' deBgösterildiği gibi HK2 hücreleri LDL kolesterol (4 saat) akını çalışma süresi boyunca doğrusal olarak aldı.
Gelişme ve ilerleme ateroskleroz32,33,41, dünya çapında bir numaralı katil sırayla olan kardiyovasküler hastalık, önde gelen nedenidir kolesterol metabolizmasında önemi nedeniyle 42, bizim Yöntem ateroskleroz ilgili bir hücreye doğrulamak amaçladık. Bu koroner arter lümen ateroskleroz hastada bir kolesterol aşağılamaya maruz ilk hücre tiplerinden birini olarak biz insan koroner damar endotel hücreleri (HCAECs) kullanılır. Şekil 2'C de gösterilen veriler bu LDL akını yöntemi de etkili HCAECs ile çalışır gösteriyor. HepG2 hücreleri için benzer bir sigmoid benzeri eğrisi sonuç grafiktir.
Geçerlilik ve LDL-kolesterol alımını etkileyen bileşikler süzmek için geliştirilmiş bu LDL akını Testin duyarlılığı sınamak için üç denetim, LDL alımını düşürücü ajanlar Dynasore ve rPCSK9 ve LDL akını harekete geçirmek Simvastatin kullanılır. Burada, biz yukarıdaki tedavi hücre hatları (HepG2, HK2 ve HCAECs) Dynasore veya rPCSK9 akını tahlil önce en iyi duruma getirilmiş konsantrasyonları ile belirtilen. Tüm üç test hücre satır 4 saatlik bir zaman boyunca (Şekil 2) LDL akını önemli indirimleri ile tedavilere yanıt bizim sonuçlar gösterdi. Örneğin, son kez noktası olarak 4,33 h 40 µM Dynasore ile tedavi % 53, %68 ve % 54, LDL akını HepG2 hücreleri, HK2 hücreleri ve HCAECs sırasıyla azaltılmış anlamlı (p < 0,0001; Resim 2 A-C ve Tablo 2A-C). Buna ek olarak, rPCSK9 10 µg/mL, bir işaretli % 55 indirim HK2 hücrelerinde LDL akını neden (p < 0,0001; Resim 2 B ve tablo 2B). Ayrıca, bizim bulgular Simvastatin HepG2 hücrelerle tedavi önemli değişiklikler LDL akını algılamak için bu yöntem duyarlılığını destekleyen LDL alımı (Şekil 3), belirgin artış içinde sonuçlandı gösterdi. RPCSK9 iyi belgelenmiş sonuçları ile bir ek denetim tedavi olarak kullanılır ama küçük miktarlarda satın almak pahalı olarak rPCSK9 HepG2 ve HCAEC hücreleri ile tedavi çalışmaları bu protokol için dahil değildir. Bu nedenle rPCSK9 sadece bu protokol HK2 hücreleri için doğrulamak için kullanılmıştır.
Hücre analizi, LDL akını, sağlık ve hücre morfolojisi sürekli izlenmesi için izin fonksiyonel ve zamanında ölçümü ile birlikte görüntüleme yaşıyor. Bu avantajı verimli bir şekilde aynı anda Farmakolojik aktivite ve sitotoksisite izlemek için ideal bir tekniği yapım bu yöntemi uygulanan bileşiklerin potansiyel sitotoksisite algılayabilir. Rakamlar 5-7 üzerinde net LDL akını tedavilerin etkisi için görsel bir referans olarak son bitiş noktası (4,33 h) adlı üç test hücre satır temsilcisi görüntüleri göstermek ve ayrıca sınanan aşağıdaki hücrelerinin sağlıklı morfoloji gösterir tedaviler. Hücrelerin heathy morfoloji çalışma süresi için sağlamak için her kuyudan tüm görüntülerin görsel kontrol öneririz. Örneğin, verileri gösterilmez, ne zaman HepG2 hücrelerin görüntülerini 80 mikron ile tedavi Dynasore kontrol, tabağını kaldırma, hücre dekolmanı daha yüksek konsantrasyonları, düşündüren için hücre kenarlarına göründüğü gibi biz hücre dekolmanı belirtileri gözlenen Dynasore. Ayrıca, yüksek konsantrasyonları da değişmiş morfoloji gösteren için liderliğindeki simvastatin (3-10 mikron) olarak yüksek dozlarda statin45için rapor apoptosis indüklenen. Bu iletişim kuralı, 20-80 mikron Dynasore tedavi ve hücre görüntüleri hücreleri durumunu çözümlemek ve tedavilerin potansiyel ctotoxicity belirlemek için kullanılan aşağıdaki Simvastatin, 0,5-10 mikron konsantrasyon, titrasyon gerçekleştirmek için kullanılan çeşitli konsantrasyonları. Sonuçları 40 mikron kullanım için Dyansore ve simvastatin için 1 mikron en uygun konsantrasyonlarda önerdi.
Son olarak, biz başka bir hücre satır bu yöntem ile tutarlı sonuçlar elde etmek için en uygun cep numarasını iyi ücret belirlemek için test edilecek ise bir hücre yoğunluğu titrasyon çalışma yapmak öneririz. Hücre yoğunluğu optimizasyonu çalışmamıza 10.000 hücre/iyi bir 24-şey plaka tutarlı LDL akını sonuçları HK2 ve HCAE hücreler için yol gösterdi. Hücre kümeleri son normalleştirilmiş LDL akını değerleri hataları ortaya çıkmasına gibi canlı hücre görüntüleme sistemi kullanarak bu LDL akını tahlil için eşit olarak dağıtılmış wells birleşmesi hücre monolayer arzu olduğuna dikkat etmek önemlidir. Bunun nedeni için akın veri normalleştirme, faz nesne alanının hücre yoğunluğu bir önlem olarak kullanılır ve ne zaman hücre kümeleri oluşturulur Bu parametre olumsuz etkilenebilir var. Biz HepG2 hücreler hücreleri/iyi tutarsız akını sonuçlara neden 5.000 yüksek yoğunlukları, seribaşı zaman form kümeleri için bir eğilim var gözlenen; Bu nedenle, biz 5000 hücreleri 24-şey plaka bir kuyu başı en uygun yoğunluk HepG2 hücreler için kullanılır.
Toplu olarak, bizim Yöntem Farmakolojik aktivite ve sitotoksisite LDL akını aynı anda düzenleyen bileşiklerin eleme için bir orta yüksek üretilen iş platformu sağlar. Bu yöntem, ligand alımı gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için lizozomal yuvası girin diğer fluorescently etiketli ligandlar kullanılmak üzere kolayca uyarlanabilir. Bu iletişim kuralı sunarken InCucyte için özellikleri görüntüleme yaşamak ve analiz sistemi, protokol Cellomics gibi alternatif görüntüleme sistemleri için adapte edilebilir.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Bu eser LAS için aşağıdaki hibe tarafından desteklenmiştir: Ulusal Sağlık Enstitüsü (R56HL132209 ve 1R01HL140468) ve Miami kalp Araştırma Enstitüsü. KY Amerikan Kalp Derneği HGUGM Bursu (18PRE33960070) bir alıcı var. HepG2 hücreleri nazikçe Doktor Emmanuel Thomas, Miami Üniversitesi-Miller okul tıp46,47,48tarafından temin edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pHrodo Red-LDL | ThermoFisher Scientific | L34356 | |
| HepG2 cells | E. Thomas Lab, U. Miami | HB-8065 | |
| MEM | Sigma | M0325 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5280 | |
| L-Glutamine 200 mM solution | Sigma | G7513 | |
| FBS | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| HK2 cells | ATCC | CRL-2190 | |
| Keratinocyte SFM media kit | Gibco | 17005-042 | |
| Primary Coronary Artery Endothelial Cells | ATCC | PCS-100-020 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-VEGF | ATCC | PCS-100-041 | |
| Human Lipoprotein Deficient Serum | Millipore | LP4 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gemini Bio-Products | 400-150 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | ATCC | PCS-999-004 | |
| 24 well plate | Falcon | 353226 | |
| 40 μM mesh cell strainer | VWR | 10199-654 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
| Trypan Blue Staining (0.4%) | Life Technologies | T10282 | |
| Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | Zoom | Imaging and analysis platform |
| Dynasore Hydrate | Sigma | D7693 | |
| PCSK9 Recombinant Protein | Cayman Chemicals | 20631 |
References
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).
- Trevisan, R., Dodesini, A. R., Lepore, G.
- Tall, A. R., Yvan-Charvet, L. Cholesterol, inflammation and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 15 (2), 104 (2015).
- Dedoussis, G. V., Schmidt, H., Genschel, J. LDL-receptor mutations in Europe. Human Mutation. 24 (6), 443-459 (2004).
- Sasaki, K., et al. ATP-binding cassette transporter A subfamily 8 is a sinusoidal efflux transporter for cholesterol and taurocholate in mouse and human liver. Molecular Pharmaceutics. , (2018).
- Storch, J., Xu, Z. Niemann-Pick C2 (NPC2) and intracellular cholesterol trafficking. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1791 (7), 671-678 (2009).
- Jansen, P. J., et al. Absence of ApoE upregulates murine brain ApoD and ABCA1 levels, but does not affect brain sterol levels, while human ApoE3 and human ApoE4 upregulate brain cholesterol precursor levels. Journal of Alzheimer's Disease. 18 (2), 319-329 (2009).
- Girard, E., et al. The dynamin chemical inhibitor dynasore impairs cholesterol trafficking and sterol-sensitive genes transcription in human HeLa cells and macrophages. PLoS One. 6 (12), 29042 (2011).
- Robinet, P., et al. Dynamin is involved in endolysosomal cholesterol delivery to the endoplasmic reticulum: role in cholesterol homeostasis. Traffic. 7 (7), 811-823 (2006).
- Macia, E., et al. Dynasore, a cell-permeable inhibitor of dynamin. Developmental Cell. 10 (6), 839-850 (2006).
- Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the LDLR and LDL-cholesterol. Journal of Biological Chemistry. , (2004).
- Qian, Y. -W., et al. Secreted PCSK9 downregulates low density lipoprotein receptor through receptor-mediated endocytosis. Journal of Lipid Research. 48 (7), 1488-1498 (2007).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. History of discovery: the LDL receptor. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (4), 431 (2009).
- Stephan, Z. F., Yurachek, E. C. Rapid fluorometric assay of LDL receptor activity by DiI-labeled LDL. Journal of Lipid Research. 34 (2), 325-330 (1993).
- Fisher, T. S., et al. Effects of pH and low density lipoprotein (LDL) on PCSK9-dependent LDL receptor regulation. Journal of Biological Chemistry. 282 (28), 20502-20512 (2007).
- Atrahimovich, D., Khatib, S., Sela, S., Vaya, J., Samson, A. O. Punicalagin induces serum low-density lipoprotein influx to macrophages. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, (2016).
- Xu, M., et al. δ-Tocopherol reduces lipid accumulation in Niemann-Pick type C1 and Wolman cholesterol storage disorders. Journal of Biological Chemistry. 112, (2012).
- Bonilla, D. L., et al. Autophagy regulates phagocytosis by modulating the expression of scavenger receptors. Immunity. 39 (3), 537-547 (2013).
- Guo, M., et al. Apelin-13 Decreases Lipid Storage in Hypertrophic Adipocytes In vitro Through the Upregulation of AQP7 Expression by the PI3K Signaling Pathway. Medical Science Monitor : International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 20, 1345-1352 (2014).
- Guillemot, J., Asselin, M. C., Susan-Resiga, D., Essalmani, R., Seidah, N. G. Deferoxamine stimulates LDLR expression and LDL uptake in HepG2 cells. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (3), 600-608 (2016).
- Javitt, N. B. Hep G2 cells as a resource for metabolic studies: lipoprotein, cholesterol, and bile acids. The FASEB Journal. 4 (2), 161-168 (1990).
- Mullen, P. J., Lüscher, B., Scharnagl, H., Krähenbühl, S., Brecht, K. Effect of simvastatin on cholesterol metabolism in C2C12 myotubes and HepG2 cells, and consequences for statin-induced myopathy. Biochemical Pharmacology. 79 (8), 1200-1209 (2010).
- McNutt, M. C., et al. Antagonism of secreted PCSK9 increases low density lipoprotein receptor expression in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (16), 10561-10570 (2009).
- Scharnagl, H., et al. Effect of atorvastatin, simvastatin, and lovastatin on the metabolism of cholesterol and triacylglycerides in HepG2 cells. Biochemical Pharmacology. 62 (11), 1545-1555 (2001).
- Scharnagl, H., et al. The effects of lifibrol (K12. 148) on the cholesterol metabolism of cultured cells: evidence for sterol independent stimulation of the LDL receptor pathway. Atherosclerosis. 153 (1), 69-80 (2000).
- Chan, J. C., et al. A proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 neutralizing antibody reduces serum cholesterol in mice and nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (24), 9820-9825 (2009).
- Ding, W., et al. Osteopontin deficiency ameliorates Alport pathology by preventing tubular metabolic deficits. JCI Insight. 3 (6), (2018).
- Herman-Edelstein, M., Scherzer, P., Tobar, A., Levi, M., Gafter, U. Altered renal lipid metabolism and renal lipid accumulation in human diabetic nephropathy. Journal of Lipid Research. 55 (3), 561-572 (2014).
- Su, H., et al. Lipid Deposition in Kidney Diseases: Interplay Among Redox, Lipid Mediators, and Renal Impairment. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (10), 1027-1043 (2018).
- Agrawal, S., Zaritsky, J. J., Fornoni, A., Smoyer, W. E. Dyslipidaemia in nephrotic syndrome: mechanisms and treatment. Nature Reviews Nephrology. 14 (1), 57 (2018).
- Babiak, J., Rudel, L. L. Lipoproteins and atherosclerosis. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 1 (3), 515-550 (1987).
- Wang, H. H., Garruti, G., Liu, M., Portincasa, P., Wang, D. Cholesterol and Lipoprotein Metabolism and Atherosclerosis: Recent Advances in Reverse Cholesterol Transport. Annals of Hepatology. 16 (1), 28-42 (2018).
- Preta, G., Cronin, J. G., Sheldon, I. M.
- Horton, J. D., Cohen, J. C., Hobbs, H. H. Molecular biology of PCSK9: its role in LDL metabolism. Trends in Biochemical Sciences. 32 (2), 71-77 (2007).
- Abifadel, M., et al. Mutations in PCSK9 cause autosomal dominant hypercholesterolemia. Nature Genetics. 34 (2), 154 (2003).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. Regulation of the mevalonate pathway. Nature. 343 (6257), 425 (1990).
- Dong, B., Wu, M., Cao, A., Li, H., Liu, J. Suppression of Idol expression is an additional mechanism underlying statin-induced up-regulation of hepatic LDL receptor expression. International Journal of Molecular Medicine. 27 (1), 103-110 (2011).
- Song, K. H., Kim, Y. H., Im, A. -R., Kim, Y. H. Black Raspberry Extract Enhances LDL Uptake in HepG2 Cells by Suppressing PCSK9 Expression to Upregulate LDLR Expression. Journal of Medicinal Food. , (2018).
- Chan, J. C., et al. A proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 neutralizing antibody reduces serum cholesterol in mice and nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9820-9825 (2009).
- Tabas, I., Williams, K. J., Borén, J. Subendothelial lipoprotein retention as the initiating process in atherosclerosis: update and therapeutic implications. Circulation. 116 (16), 1832-1844 (2007).
- Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 146-603 (2017).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor. Cell. 89 (3), 331-340 (1997).
- Horton, J. D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. SREBPs: activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver. The Journal of Clinical Investigation. 109 (9), 1125-1131 (2002).
- Tavintharan, S., et al. Reduced mitochondrial coenzyme Q10 levels in HepG2 cells treated with high-dose simvastatin: A possible role in statin-induced hepatotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. 223 (2), 173-179 (2007).
- Thomas, E., et al. HCV infection induces a unique hepatic innate immune response associated with robust production of type III interferons. Gastroenterology. 142 (4), 978-988 (2012).
- Thomas, E., Liang, T. J. Experimental models of hepatitis B and C-new insights and progress. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (6), 362 (2016).
- Yoneda, M., et al. Hepatitis B Virus and DNA Stimulation Trigger a Rapid Innate Immune Response through NF-κB. The Journal of Immunology. , 1502677 (2016).
