Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Påvisning av Tilapia Lake Virus bruker konvensjonelle RT PCR og SYBR grønne RT-qPCR

Published: November 10, 2018 doi: 10.3791/58596
Automatic Translation
1, 2, 2
1Institute of Veterinary Bacteriology Vetsuisse Faculty, University of Bern, 2Department of Veterinary Microbiology and Immunology and Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Kasetsart University Institute for Advanced Studies, Kasetsart University

Summary

Denne protokollen diagnostiserer Tilapia Lake Virus (TiLV) i tilapia vev bruker RT PCR metoder. Hele metoden er beskrevet fra vev disseksjon til totale RNA utvinning, etterfulgt av cDNA syntese og oppdagelse av TiLV ved konvensjonelle PCR eller kvantitativ PCR bruker dsDNA bindende en fluorescerende bindende fargestoff.

Abstract

Målet med denne metoden er å lette rask, følsom og bestemt påvisning av Tilapia Lake Virus (TiLV) i tilapia vev. Denne protokollen kan brukes som en del av overvåking programmer, biosikkerhet tiltak og TiLV grunnleggende forskningslaboratorier. Gullstandarden for virus diagnostikk innebærer vanligvis virus aisolering etterfulgt av komplementære teknikker som reverse-transkripsjon polymerasekjedereaksjons (RT-PCR) for ytterligere bekreftelse. Dette kan være tungvint, tidkrevende og krever vanligvis vevsprøver tungt infisert med virus. Bruk av RT-kvantitative (q) PCR i deteksjon av virus er en fordel på grunn av sin kvantitative natur, høy følsomhet, spesifisitet, skalerbarhet og det raske tid føre. Her, basert hele metoden for PCR tilnærminger for TiLV oppdagelsen er beskrevet, fra tilapia orgel snitt, total ribonukleinsyre (RNA) utvinning bruker en guanidium thiocyanate-fenol-kloroform løsning, RNA kvantifisering, etterfulgt av en to-trinns PCR protokollen innebærer, utfyllende deoksyribonukleinsyre (cDNA) syntese og gjenkjenning av TiLV ved konvensjonelle PCR eller kvantitativ identifikasjon via qPCR bruker SYBR grønne jeg fargestoff. Konvensjonelle PCR krever innlegget PCR trinn og vil bare informere om tilstedeværelse av virus. Sistnevnte tilnærmingen gjør absolutt kvantifisering av TiLV til så lite som 2 eksemplarer, og dermed er svært nyttig for TiLV diagnose i sub kliniske tilfeller. En detaljert beskrivelse av to PCR tilnærminger, representant resultater fra to laboratorier og en grundig diskusjon av kritiske parametere av begge er inkludert for å sikre at forskere og diagnosticians finne mest egnet og gjeldende metoden TiLV gjenkjenning.

Introduction

Globale innbygger fisken leverer nådde en ny rekord av 20 kg i 2014 og det var kraftig vekst i akvakultur. Akvakultur er fortsatt en av de raskest voksende dyr mat produserende sektorene verden og er bare dyr mat produserende sektoren som vokser raskere enn befolkningen1. Tilapiine cichilds utgjør den nest viktigste ferskvannsfisk oppdrett over hele verden med en total verdensomspennende produksjon av 6.4 millioner tonn (MT) og en estimert verdi på 9,8 milliarder amerikanske dollar i 20152. Ti produsenter av tilapia er Kina (1,78 MT), Indonesia (1.12 MT) og Egypt (0,88 MT), etterfulgt av Bangladesh, Vietnam, Filippinene, Brasil, Thailand, Colombia og Uganda2. Det forventes at globale tilapia produksjon vil være rundt 7.3 MT av 20303. Tilapia har blitt slik en viktig globale matkilde ikke bare fordi de er en billig kilde til protein4 men også fordi de er enkle å rase i kapasitet under en rekke vann og klima forhold5,6. Bare noen tiår siden, var det antatt at det var få kommersielt betydelig sykdommer truende tilapia oppdrett, men dette er ikke lenger sant. En nye viral sykdommen kalles tilapia innsjøen virus sykdom (TiLVD) er den første noensinne kritisk sykdom-epidemien i tilapia og hele bransjen er utsatt. Denne sykdommen har sosio-økonomiske konsekvenser og er en direkte trussel på matsikkerhet for millioner av mennesker i Afrika7, Asia og Sør Amerika. På starten av 2018 rapporterte World Organization for dyr helse (OIE) at den paranoid agenten for denne sykdommen, TiLV, ble offisielt funnet på tre kontinenter dekker åtte land8 og siden denne patogen kortet var oppdatert det har vært rapporter om TiLV i Tanzania, Uganda9, Indonesia10, Taiwan11 og Peru12. TiLV er en roman single-strandet RNA virus beskrevet for å være en orthomyxo-lignende virus fordi den inneholder en rekke egenskaper som minner om andre orthomyoxoviruses som influensa eller smittsomme laks anemi virus (ISAV)13. Det ble først identifisert i kjølvannet av massive tap av ville og Oppdrettede tilapia i Lake i Galilea, Israel14. Deretter referert lignende sykdomsutbrudd til som sommeren dødelighet og en måned dødelighet syndrom knyttet TiLV infeksjon ble rapportert i Nil-tilapia (Oreochromis niloticus) i Egypt15 og Nilen og røde hybrid tilapia (Oreochromis spp.) i Thailand16, henholdsvis. Deteksjon av akvatiske dyr virus er historisk utført av vekst og isolering av virus i cellekultur. Ulike linjer har blitt testet for overføring og isolering av TiLV inkludert E-11 celler avledet fra snakehead fisken (Ophiocephalus striatus)17,18, OmB og TmB fra Oreochromis mossambicus18, og OnlB og OnlL fra Nilen tilapia (O. niloticus)19. Mens virus kultur har fordelen at det gir materiale for ytterligere eksperimenter, har ulempen at det krever minst 4-7 dager å observere dannelsen av cytopathic effekter (CPE) og avgjørende, ulike piscine virus, som er mer Tilpass til replikering kan overføres og produsere lignende CPE.

I de siste tiårene, har det vært en bevegelse bort fra tradisjonelle, ofte tidkrevende diagnostiske metoder som cellekultur, serologi og antigen oppdagelsen og erstatning med raskere og mer følsom nukleinsyre basert oppdagelsen tester20, 21. Dette er tydelig ved at mange qPCR analyser har blitt utviklet som viktig diagnostiske metoder for en rekke sykdommer i akvatiske dyr, som for ISAV22,23, viral hemoragisk septicaemia virus (VHSV)24 ,25, betanodavirus26,27 fordøyelsesfunksjon alphavirus28, fisk iridovirus29, Anguillid herpesvirus 1 (AngHV1)30og Lymphocystis sykdom virus (LCDV)31 . Robust metoder for diagnostisering og patogen overvåking er presserende nødvendig å redusere spredningen av TiLV. Slike metoder bør tillate tidlig deteksjon av infeksjon før klinisk underskriver utvikle og oppdagelsen av lav virus laster. Hittil har forskjellige PCR protokoller inkludert RT PCR14,32, har nestede RT PCR18, semi nestede RT PCR33og RT-qPCR32,34 blitt utviklet for oppdagelsen av TiLV i fisk vev. En sammenligning av RT-qPCR og virus isolasjon i utsatt linjer for TiLV gjenkjenning avslørte at RT-qPCR 1000 ganger mer følsom enn virus isolasjon32. Selv om hvert publiserte PCR-protokollen har rapportert ulike følsomhet for gjenkjenning av TiLV, er de fleste analyser svært følsomme med oppdagelsen grensene av viral Kopier 7,5 Kopier33, 7 eksemplarer18 eller 2 Kopier32 per reaksjon.

Målet med denne metoder artikkelen er å forklare i detalj hvordan du utfører TiLV gjenkjenning analyser, starter med tilapia vev samling, til totale RNA utvinning, cDNA syntese og TiLV bestemte PCR basert analyser. Spesielt har omfattende protokoller av både konvensjonell RT PCR, og også SYBR green-baserte RT-qPCR blitt beskrevet å appellere til et bredt spekter av forskere å oppdage TiLV. Tidligere er mindre sensitive, men er vanligvis et billigere alternativ for gjenkjenning. Sistnevnte krever mer forseggjort infrastruktur som en kvantitativ PCR-maskin og dyrere reagenser, men det har fordelene av å være kvantitative, rask og svært følsom, betyr at det kan bli brukt for påvisning av TiLV i sub klinisk infisert fisk. RT PCR og RT-qPCR protokollene ble utført i to forskjellige laboratorier med forskjellige geografiske isolater av TiLV og inkludert resultater markere følsomheten og reproduserbarhet av analyser beskrevet her.

Protocol

Dyr bruk protokollen for denne studien ble godkjent av Kasetsart University dyr etikk tillatelse nummer ACKU 59-VET-016.

Merk: Se Tabell for materiale for utvidet informasjon om reagenser og utstyr foreslått for denne protokollen.

1. vev prøvetaking

  1. Euthanize fisken med en overdose av fedd olje (volumet avhenger av størrelsen på fisken og konsentrasjonen av produkter, vanligvis mer enn 3 mL/L). Legg en fjerdedel av tang og mayo saksen til 95% (v/v) etanol etterfulgt av brennende utstyret bruker en alkohol-brenner for å sterilisere utstyret.
    Merk: Tricaine methanesulfonate (MS-222) kan brukes i stedet for fedd olje.
  2. Finn leveren og kutte en liten (ca 20-100 mg) eller samle 200 µL av Slim bruker cover glass eller kirurgisk blad fjerne slim fra fremre bakre tilapia fisken og Legg prøvene i en 1,5 mL microcentrifuge tube.
  3. Behandle prøver umiddelbart, lagre i en RNA stabilisere løsning eller flytte dem til-80 ° C til fremme bruk.
    Merk: Største oppgaven i arbeidet med RNA forbereder seg intakt RNA molekyler og holde dem uskadet gjennom alle etterfølgende handlings. RNA ryggraden er medfødt mer følsom å skade enn DNA. Utvinning og isolasjon av totalt fra vev celler nødvendiggjør forsiktig laboratorium teknikk; ta alle bestemmelser for å hindre RNase forurensning seg hansker, bruker RNase gratis vann, reagenser, utstyr, plast ware, glass, arbeidsplass og bruker filteret tips for pipettering.

2. Guanidium Thiocyanate - fenol - kloroform utvinning av RNA

  1. Legg 1 mL av monophasic løsning som inneholder fenol og guanidine isothiocyanate inn i et rør som inneholder Vevsprøve fra avsnitt 1.
    Advarsel: Denne løsningen er svært giftig og må håndteres med forsiktighet i laminær strømning hette med verneutstyr og iført riktig beskyttende eyewear, klær og sikkerhet hansker.
  2. Grind Vevsprøve bruker et vev støter homogenizer til det er homogent.
    Merk: Utvalg kan også være homogenisert ved hjelp av en strøm homogenizer kombinert med keramiske perler. Sikre at vev prøven er helt homogenisert før du fortsetter til neste trinn eller stoppe protokollen her og lagre de fullt homogenisert prøvene-80 ° c til fremme bruk.
  3. Legge til 200 µL av kloroform for fase separasjon.
    FORSIKTIG kloroform er en potensiell narkotiske og er ekstremt farlige. Det bør håndteres med forsiktighet i laminær strømning hette med verneutstyr og ved å ha riktig beskyttende eyewear, klær og sikkerhet hansker. Som et mindre giftig alternativ, 1-Bromo-3-chloropropane kan også brukes.
    Merk: Skala volumet opp eller ned der det passer. For eksempel, hvis bare 500 µL monophasic løsning med fenol og guanidine isothiocyanate ble brukt, så bare legge 100 µL av kloroform på dette trinnet.
    1. Bland prøver godt inversjon for 15 s.
    2. Inkuber prøver for 3 min ved romtemperatur (RT).
  4. Sentrifuge for 15 min 12.000 × g og 4 ° C.
    Merk: Det bør være et klart skille i en lavere organisk fase, en hvit interphase og en øvre vandige fasen som inneholder RNA. Denne topp fasen er normalt fargeløs, men avhengig av type og mengde homogenisert vev, det kan ha en lys rosa utseende.
  5. Overføre øvre vandig laget (ca 500 µL) til en frisk microcentrifuge tube uten å forstyrre interphase.
    Merk: ikke prøv å overføre hele vandige fasen, la litt for å forhindre alle potensielle forurensning av RNA inneholder vandige fasen med økologisk eller interphase.
  6. Legge til 1-volum av 100% isopropanol til å fremkalle RNA.
    1. Eventuelt hvis svært små mengder vev ble brukt, Legg 1 µL (5-10 µg) av RNase-fri glykogen til hver prøve å fremme effektiv RNA nedbør. Dette vil hjelpe identifisering av RNA pellet i trinn 2.8.
      Merk: Glykogen fungerer som RNA og hindrer små mengder RNA stikker til siden av røret.
    2. Mix rør godt av inversjon flere ganger.
    3. Lagre prøvene for 2T til overnatting på 20 ° C.
  7. Sentrifuger prøver i 15 min på 12.000 x g og 4 ° C.
  8. Kast nedbryting, være forsiktig med å dislodge RNA pellet nederst på microcentrifuge tube.
  9. Legg 1 mL av 75% etanol (v/v) og bland RNA eksempler ved å snu røret flere ganger.
  10. Sentrifuger i 15 min på 10.000 x g og 4 ° C.
    Merk: Protokollen kan stoppes her og prøvene bestående av RNA pellet i 75% etanol kan lagres på 20 ° C til fremme bruk.
  11. Kast nedbryting, å bli vaktsom ikke å løsne RNA pellet nederst på microcentrifuge tube.
    1. Du kan eventuelt Gjenta trinn 2.9-2.11 med 70% etanol (v/v). Grundig vask RNA pellet vil minimere alle salt eller miljøgifter bære-over som kan påvirke vil sensitive nedstrøms applikasjoner.
  12. Trekke ut resterende etanol bruker en pipette, og deretter air-dry RNA pellet ved romtemperatur i mer enn 5 til 10 min.
    Merk: over tørket pellets vil være vanskelig å suspendere.
  13. Legge til 30-60 µL RNase uten vann, pre varmet til 55-60 ° C til solubilize RNA-pellets.
  14. Plass RNA på is for umiddelbar bruk eller butikken på-80 ° C for senere bruk.

3. kvantifisere RNA konsentrasjon med et Micro-volum spektrofotometer

  1. Bytte innstillingene for spektrofotometeret til RNA.
  2. Bruke 1-2 µL av RNase-fritt vann som en tom.
  3. Bruke 1-2 µL av hver RNA prøve for å vurdere hvor RNA.
  4. Registrere målinger på 230 nm, 260 nm og 280 nm for hvert utvalg.
  5. Fortynne RNA til 200 ng/µL bruker RNase-fritt vann.

4. syntese av komplementære DNA (cDNA) bruker totalt RNA

  1. Bland 1 µg av totale protokollen 2, 2 µM oligo (dT), 0,5 mM dNTPs blanding og bringe det siste bindet til 10 µL med nuclease-fritt vann. For dette, kan du forberede en RT-master-blanding av antall prøver og kontroller skal testes.
    Merk: Kontrollene er et minus-revers transkriptase utvalg (-RT) der RT enzymet er erstattet med nuclease-fritt vann (se trinn 4.3) og en ingen mal (NTC) der nuclease-fritt vann legges til master-mix i stedet for RNA mal.
    1. Bland prøvene godt av pipettering etterfulgt av en kort sentrifugering.
  2. Inkuber prøvene ved 65 ° C i 5 min etterfulgt av en 2 min incubation på is.
    1. Kort sentrifuge prøvene å samle alle av væsken i bunnen av rør.
  3. Legg til 1 x revers transkriptase buffer, 100 U revers transkriptase og bringe det siste bindet hver prøve 20 µL bruker nuclease-fritt vann.
    1. Bland prøvene godt av pipettering etterfulgt av en kort sentrifugering.
  4. Inkuber eksemplene ved 42 ° C for 60 min etterfulgt av 85 ° C i 5 minutter.
  5. Fortynne den syntetiserte cDNA til en ønsket konsentrasjon ved å legge til en passende mengde nuclease uten vann og plasser cDNA på is for umiddelbar bruk eller lagre den på 20 ° C for senere bruk.

5. TiLV konvensjonelle PCR

  1. Bruk cDNA, eksempler og kontroller, generert i Seksjon 4-protokollen som maler for en PCR reaksjon bruker noen av de etablerte primer beskrevet i tabell 1, sammen med en DNA polymerase valgfrihet.
    Merk: En ekstra ikke-mal kontroll (NTC) bør inkluderes her ved å erstatte cDNA for nuclease-fritt vann i PCR reaksjonen. En positiv kontroll, hvis tilgjengelig, skal inkludert bestående av tidligere bekreftet TiLV positive eksempler eller det aktuelle TiLV cDNA fragmentet klonet i til en plasmider.
  2. Forberede en PCR master-blanding i henhold til retningslinjene i DNA polymerase systemet i bruk og antallet eksempler og kontroller skal testes. Denne blandingen bør ta frem primer, omvendt primer, dNTPs, MgCl2 og den valgte DNA polymerase, sammen med bufferen.
  3. Ifølge retningslinjene i den valgte DNA polymerase, kombinere utpekte volumet av master-blanding med foreslåtte cDNA prøver og kontroll prøver.
    Merk: Forbereder en 0,5 x reaksjon overflødig er ofte gunstig siden noen av master-mix går tapt under pipettering.
  4. Utføre PCR sykling betingelser i henhold til retningslinjene for utnyttet DNA polymerase systemet og bruker et riktig annealing temperatur for primerne i bruk (tabell 1). Vanligvis et slikt program vil innebære en innledende rødsprit ved 95 ° C i 2-5 min, etterfulgt av 30-40 sykluser av rødsprit 95 ° c for 30 s, annealing på anbefalt temperatur i 30 s og forlengelse ved 72 ° C for 30 s, etterfulgt av en siste forlengelse ved 72 ° C i 5-10 min.
  5. Laste 5-15 µL av hver PCR reaksjon og en passende DNA stigen i brønner av en 1-2% agarose gel, avhengig forventet PCR produktet. Separate forsterket DNA av gel geleelektroforese og stain gel av ethidium bromide (EthBr) å forenkle visualisering av DNA band av forventet størrelse (tabell 1) i en gel dokumentasjon maskinen med UV-lyset.
    FORSIKTIG: EtBr er giftig; Det bør håndteres med forsiktighet ved iført riktig verneklær og vernehansker.
Ekko TiLV genomet segment Fremover primer
5 - 3'		 Omvendt primer
5 - 3'		 PCR produktet størrelse (bp) Tm
° C		 Opprinnelige referanse
1 CCAAACGTTATCTCTTAATTACGCAC GCAAATATTTCTCTCATTCGCCT 1641 50 Surachetpong et al., 2017
1 CCTCATTCCTCGTTGTGTAAGT AGGAGTTGCTGTTGGGTTATAG 1000 62 Mugimba et al., 2018
2 ACTCTCTATTACCAAATACATTTACT TTACCATATATATAGTGAAGGC 1445 45 Surachetpong et al., 2017
2 GTCCAGGGCGGTATGTATTG CTTACGGCTGACAAGTCTCTAAG 834 62 Mugimba et al., 2018
3 GTTGGGCACAAGGCATCCTA TATCACGTGCGTACTCGTTCAGT 250 56 Eyngor et al., 2014
3 TATGCAGTACTTTCCCTGCC TTGCTCTGAGCAAGAGTACC 491 57 Eyngor et al., 2014
3 ACCCCTTAATCCTTAATAGACCGTTA CCCATAATCCTCTATTAGAACGTCGT 1352 50 Surachetpong et al., 2017
3 GTCGAGGCATTCCAGAAGTAAG GAGCTAAGGGAACGGCTATTG 834 62 Mugimba et al., 2018
4 AGCAGCAGCAGGAGAAAGAG ACCGTCCTGTTTCTGAATGG 358 60 Nicholson et al., 2017
4 CCAAAGTTTACTCCTATTACCCAGA GCAAATCTTTCTCCAATTACCGTCT 1250 50 Surachetpong et al., 2017
4 GCCCAATGGTTCCCATATCT GCCCAATGGTTCCCATATCT 524 62 Mugimba et al., 2018
5 CCAAATGTTTCTCTTATCTCAGACTC CTTTTTCTCAGTTTACCACTTTATG 1087 57 Surachetpong et al., 2017
5 CAACTCTTAGCCTCCGGAATAC CGTTCTGCACTGGGTTACA 696 62 Mugimba et al., 2018
6 CCAAATTTTACCTCTCGCAT TCAAGCACTTAAAACTGTACC 1027 45 Surachetpong et al., 2017
6 CCCACACGACAGGACATATAG GAGTTGGCTTAGGGTGATAAGA 948 62 Mugimba et al., 2018
7 CTCTCTTTGCATTGCATACCGT GACCAATTATCCCTGCTTTCA 704 57 Surachetpong et al., 2017
7 TCCTTTAGGGATTGGCACTAAC TTCCATCGACTGCTCCTAGA 486 62 Mugimba et al., 2018
8 ACCTCATCTACACTAACATTTCCA TCATCATTACACAAATGGAGTAGCT 637 50 Surachetpong et al., 2017
8 CTTAAGGGCCATCCTGTCATC TGGCTCAAATCCCAACACTAA 476 62 Mugimba et al., 2018
9 TTGGTGATGTCACGATGGATA AGTTCTATCGCCAGCCATGT 351 60 Nicholson et al., 2017
9 ACAAGTCCGATTACTTTTTCCGC TCTTTCTCACGTCCTTAAAGTCA 530 50 Surachetpong et al., 2017
9 GATATCCTCCACATGACCCTTC GTACGTCACTTTGTGCCATTAC 261 62 Mugimba et al., 2018
10 AACCCTACTAACACCAAATATAGCT CTTTCCCTCTGACACCCTGT 450 50 Surachetpong et al., 2017
10 TCCTCTCTGTCCCTTCTGTT CAGGATGAGTGTGGCAGATTAT 276 62 Mugimba et al., 2018

Tabell 1. Publisert primer par for forsterkningen på TiLV cDNA ved hjelp av sluttpunkt PCR. Primer satt i fet ble brukt til å generere representant resultatene som vises i figur 3A og 3B.

6. TiLV kvantitative polymerasekjedereaksjons (qPCR)

  1. Bruke en plasmider som inneholder den aktuelle TiLV genomisk segmentet 3 cDNA som standard, for eksempel pTiLV32, forberede en duplisert eller triplicated 10 ganger føljetong fortynning serie.
  2. Forberede en qPCR master-blanding for alle prøver, standarder og kontroller, tar hensyn til at reaksjonene skal utføres i duplisere eller tre eksemplarer utnytte 0,4 µL nuclease uten vann, 0,3 µL av fremover primer, 0,3 µL av omvendt primer og 5 µL av 2 x SYBR Green DNA polymerase master-blanding per reaksjon.
    1. Bruk primerne i en konsentrasjon av 10 µM, og primer informasjon og den standard pTiLV som følger:
      Videresende primer: TiLV-112F (5'-CTGAGCTAAAGAGGCAATATGGATT-3 ")
      Omvendt primer: TiLV-112R (5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCT-3 ")
      Standard pTiLV:10 pg/µL
      Merk: Hvis det totale antallet eksempler og kontroller er 10 og utføres i triplicates, dette tilsvarer en qPCR master-blanding bestående av 12 µL nuclease-fritt vann, 9 µL frem primer, 9 µL omvendt primer og 150 µL SYBR Green DNA polymerase master-mix. Kommersielt kjøpte 2 x universell SYBR Green DNA inneholder polymerase master-mikser alle de nødvendige komponentene for qPCR reaksjonen, nemlig SYBR Green jeg fargestoff, hot-start Taq DNA utvalg, dNTPs, MgCl2 og passiv referanse fargestoffer. Beskytte SYBR Green master mix fra lys.
  3. Dispensere 6 µL qPCR master-mix i qPCR stripe rør eller en 96 godt plate som er kompatibel med qPCR maskinen i bruk.
  4. Legge til 4 µL cDNA mal, kontroller eller serielt utvannet TiLV standarder i rør eller brønner av 96 godt plate.
  5. Lukk qPCR rør eller forsegle 96 godt platen med en kompatibel plate cover for qPCR maskinen i bruk
    1. Forsiktig sveip qPCR rør å blande løsningen og rotere ned qPCR rør eller 96 godt plate ved hjelp av en sentrifuge for å samle alle av væsken i bunnen av fartøyene.
  6. Plassere rør eller plate i sanntid termisk cycler.
    1. Program qPCR thermocycler å utføre en innledende rødsprit 95 ° c for 3 min, etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C for 10 s og 60 ° C for 30 s primer avspenning og elongation, med et smeltende kurve skritt 65 ° c til 95 ° C med en tilvekst på 0,5 ° C / 5 s.
    2. Velg SYBR som en fluorophore farge, og velg ukjent som en prøve og sette inn et navn i boksen en prøve.
    3. Åpne lokket av RT-qPCR maskinen plassere qPCR stripen i tildelte brønnene, og stenger lokket.
  7. Utføre RT-qPCR analysen med de valgte betingelsene. Maskinen starter etter lokket har nådd ønsket temperatur. Samle fluorescens for hvert utvalg etter hvert forlengelsen trinn å overvåke fremdriften av reaksjonen.
    Merk: QPCR maskinen og relatert programvare automatisk beregne alle parametere til analysen og vise forsterkning kurvene i sanntid, mens standardkurve og smeltende kurven i genereres på slutten av qPCR syklus.
  8. Utføre analyse og oppkjøpet av første sikre som smelting kurver for hvert utvalg og standard har en uniform topp ved forventet temperatur for amplicon.
    1. Evaluere forsterkning kurvene prøvene og standarder og sett terskelen i en region forsterkning i cDNAs er det samme i alle prøvene. Dette er normalt utføres automatisk av programvaren, men bør sjekkes.
    2. Beregne antall TiLV kopier med standardkurven.

Representative Results

Etter protokoll beskrevet i del 1, var døende røde hybrid tilapia viser klinisk underskriver av TiLV infeksjon (figur 1A) euthanized med bading i en høy konsentrasjon av fedd olje, som fungerer som en bedøvende. Rapportert kliniske symptomene er variabel, men de vanligste symptomene synes å være apati, hud erosjon og misfarging, exophthalmia, frittliggende skalaer, åpne sår/lesjon og unormal atferd15,16,33, 35,36, noen av disse kan tydelig ses i figur 1A. Bukveggen var fjernet for å samle indre organer som leveren, milt eller hodet nyre (figur 1B). Slim også innhentet prøver på dette stadiet av forsiktig skrape huden fra det fremre til bakre fisken bruker en cover glass eller kirurgisk blad37.

Figure 1
Figur 1 . Tilapia disseksjon og prøve samling. A. TiLV-infiserte røde hybrid tilapia med huden leisons, rødhet rundt munnen og bløtdyr, hud erosjon og hornhinne. B. Sectioned rød hybrid tilapia å tillate vev samling fra leveren (på blå pil), milt eller hodet nyre organer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Deretter protokollen detaljert i § 2 for Guanidium Thiocyanate-fenol-kloroform utvinning av totalt ble fulgt og RNA kvantifisering som beskrevet i § 3 ble utført for å vurdere eksempel renhet av beregning av renhet forholdstallene og undersøkelse av spectral profiler (figur 2). Figur 2A viser et representativt resultat fra en vellykket totale RNA utvinning prosedyre, mens figur 2B representerer en dårlig RNA forberedelse. Nukleinsyrer har absorbansen maxima på 260 mens proteiner deres på 280 nm. Forholdet mellom målinger på 260 nm og 280 nm angir renheten av hvert utvalg og prosenter av 1,9 til 2,1 angir ren RNA som er tilfelle for eksemplet i figur 2A. Lavere A260/280 prosenter i figur 2B indikerer mulig protein eller fenol forurensning leftover fra RNA utvinning prosedyre. Absorbans ved 230 nm kan skyldes eksempel forurensning og A260/230 nm forholdet beregnes også grunn. Dette forholdet bør være i størrelsesorden 2.0-2.2 for ren RNA preparater som illustrert av verdien 2.03 for eksemplet i figur 2A, mens finne 2B har lav A260/230 forholdet 1.07 og spectral profilen viser et skifte i bunnen på 230 nm mot 240 NM som antyder gjenværende guanidine eller fenol i utvalget. For utvalget vises i figur 2B, kan nytt fremskynde RNA å fjerne forurensning forbedre renheten av prøven.

Figure 2
Figur 2 . Spektrofotometri kvantifisering av totale utvunnet fra syke tilapia vev. A. renhet forholdstall og spectral profiler fra en vellykket RNA forberedelse. B. som A, unntatt representant for en dårlig RNA utvinning prosedyre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

For å oppdage TiLV av RT PCR, rene prøver slik som den i figur 2A var omvendt transkribert (protocol 4) i cDNA og brukes som en mal for PCR analysen i seksjon 5 og representant resultater er vist i figur 3A. Primere vises i fet skrift i tabell 1 ble brukt til å forsterke et 491 bp fragment TiLV genomisk segmentet 314. PCR produktene var atskilt med gel geleelektroforese og farget med EtBr for visualisering. Figur 3A viser resultatet av en to-trinns RT PCR 4 cDNA utvalg (S1-S4), avledet fra lever av syke tilapia isolert i Thailand og i hver prøve, en ren enkelt band av ca 500 bp kan observeres og dermed prøver 1-4 er TiLV positiv. Samme PCR produktet ble kjøpt fra positiv kontroll prøven, som omfatter cDNA av TiLV segment 3 klonet i en plasmider32 mens ingen mal kontrollen (NTC) ikke gi PCR produkter. Analysen i figur 3B ble utført samme primerne som figur 3A men med forskjellige laboratorium ved hjelp av en ettrinns RT PCR tilnærming og 5 RNA prøver avledet fra hodet nyre vev av tilapia opprinnelse i egyptiske akvakultur 15. det ble besluttet å bruke denne oppdagelsen analysen at prøver 1, 3 og 5 er TiLV positive mens prøver 2 og 4 TiLV negative siden ingen PCR produkter ble funnet på riktig størrelse. De negative kontrollene, inkludert to minus revers transkriptase kontroller og to NTCs ikke generere PCR produkter. En ettrinns RT PCR analysen ble også fremført målretting tilapia ActinB genet. Amplicon størrelsen på 217 bp ble generert i hver eksempel (S1-S5) som forventet38. Denne analysen var en kontroll for integriteten av RNA prøvene så vel som tillater for en semi kvantitative undersøkelse av TiLV positive prøvene. Gitt at generert Tilapia ActB produktet er relativt lik, kan deretter forskjeller i TiLV bestemt PCR produkt generert tolkes som en sann refleksjon av TiLV i en gitt Vevsprøve.

Figure 3
Figur 3 . RT TiLV PCR. A. cDNA prøver produsert av leveren vev av syke tilapia, samlet fra Thailand var skjermen for TiLV infeksjon med bestemte primere for segmentet 3 (vises i fet skrift i tabell 1) av TiLV med en 2-trinns RT PCR analysen. M = markør i base-parene; S1-S4 = utvalg 1-4; C1 = positiv kontroll med pTiLV som PCR mal; og C2 = ingen mal kontroll (NTC). B. ettrinns RT PCR bruker samme primerne som i A og prøver fra hodet nyre vev av syke tilapia samlet Egypt15. M = markør i base-parene; S1-S5 = utvalg 1-5. Kontroller C1-C2 er minus revers transkriptase kontroller og C3-C4 NTCs. nedre panelet bruker en ettrinns RT PCR primere rettet mot tilapia ActinB38 (se tekst for detaljer) produserer et PCR-produkt av 217 base-parene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

I motsetning til endepunktet PCRene representert i Figur 3qPCR analyser som er forklart i protokollen 6, måle mengden av PCR produkt etter hver PCR syklus. Forsterkning av målet DNA registreres med fluorescerende molekyler som samhandler med DNA fra hver runde av reaksjonen. Her ble SYBR Green jeg fargestoff benyttet, som setter tiden med double-strandet DNA. Fluorescerende signalet følges under reaksjonen og intensitet gjelder mengden produkt dannet 39,40,41,42,43. TiLV qPCR analyser ble utført som beskrevet i protokollen 6 i ulike laboratorier med forskjellige SYBR Green reagenser, qPCR maskiner og prøver fra ulike land. Den resulterende forsterkning kurver er vist i figur 4A og 4B. Det kan være observert at for hver analysen, i løpet av eksperimentet har fire faser: den lineære bakken fasen, eksponentiell tidligfasen, sent eksponentiell fase og platå fasen. Den lineære bakken fasen oppstår under tidlig sykluser hvor DNA duplisering kan ikke ennå identifiseres fordi DNA mengder produsere nok signal/bakgrunn forhold. Planlagte fluorescens beregnes i denne fasen. Deretter starter målet DNA å doble i konsentrasjon med hver syklus inducing signalet å bli synlig over bakgrunnen og øke eksponentielt. Forsterkning effektiviteten (E) av en godt optimalisert qPCR analysen er svært høy (nær 100%) i begynnelsen av reaksjon og forblir stabil i denne tidlige eksponentiell fasen av forsterkning og det er på dette punktet at kvantifisering er utført, når reaksjon effektivitet er fortsatt stabil. I senere sykluser signalet begynner å flate, og intensiteten av fluorescensen er ikke lenger korrelert til mal kopi startnummeret fordi reaksjon komponentene er utmattet44. Metning kan også oppstå på grunn av konkurranse fra re annealing reaksjoner, skiftende konsentrasjon prosenter av komponentene, eller mengden av enzymet enheter til DNA substrat molekyler. Muligens utgjør slike parametre forskjellene mellom forsterkning kurvene for analyser figur 4A og 4B. Inkludert kontrollene genererte ikke disse karakteristiske forsterkning kurver.

Figure 4
Figur 4 . Forsterkning tomter å vise akkumulering av produktet over varigheten av sanntids PCR analysen. A. forsterkning kurver av TiLV-positive eksempler avledet fra Thailand, NTCs og positiv plasmider kontroll med en SYBR-grønn jeg 2-trinns qPCR analysen. Diagrammet ble generert ved å plotte relative fluorescens (RFU) vs syklus nummer. B. forsterkning kurver av TiLV positive eksempler avledet fra Egypt, som i figur 3B og en NTC. Forsterkning kurven er fluorescens reporter signalet normalisert til fluorescens av passiv ROX fargestoffet inkludert i analysen (Rn) versus syklus nummeret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

På slutten av qPCR thermocycling på alle maskiner i hvert laboratorium, ble data kjøpt og analysert. Figur 5A og 5B viser representant smeltende kurver fra analyser utført i hvert laboratorium. Hver qPCR maskin var programmert til å utføre en smeltende curve analyse på slutten. Dette ble oppnådd ved å gradvis øke temperaturen og overvåking fluorescens som en funksjon av temperaturen. Når temperaturen er høy nok til å denature dsDNA, registreres en stor nedgang i fluorescens fordi fluorophore molekylet er utgitt. Programvaren til hvert qPCR instrument beregnet annealing temperaturen (Tm) fra smeltende kurve dataene ved å plotte negative første avledede vs temperaturen (figur 5). Det kan sees at figur 5A og 5B at produktene dannet i de ulike Prøvesett har uniform smeltende overgangen ved forventet temperatur på ca 80 ° C for analysen. Ingen andre topper ved lavere temperaturer ble observert. På grunn av sin lille størrelse er Tm av primer-dimers vanligvis lavere enn målet DNA sekvensen. Derfor gjør denne forskjellen mellom Tm'sdet enkelt å identifisere potensielle primer-dimers eller andre ikke-spesifikke forsterkning produkter. Kontrollene genererte ikke smelte kurver som TiLV positive eksempler og standarder og kan sees som en nesten horisontale linjen nederst i listene i figur 5A og 5B.

Figure 5
Figur 5 . Smelt curve analyse for å sikre analysen spesifisitet og ulike PCR produkter kan differensieres av deres smeltende funksjoner. A. smelte curve analyse av TiLV-positive prøver fra Thailand, negativ kontroll og positiv plasmider kontroll. B. smelte curve analyse av TiLV positive eksempler avledet fra Egypt, pTiLV standarder og en NTC. Listene i A og B både viser endringen i fluorescens delt av endringer i temperatur plottet mot temperatur for å produsere et klart bilde av smeltende dynamikken. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

De fleste kommer qPCR med en programvare tilrettelegge ytterligere evaluering av qPCR kjøre og vil kvantifisere prøvene ved å generere en standardkurve ved å plotte automatisk syklus terskelen (Ct) mot logaritmen av den pTiLV standarder Kopier som vises i figur 6A og 6B for to uavhengige laboratorier. Kort, Ct er enheten for å vurdere qPCR resultater. Ct verdien angir antall sykluser kreves for å nå en angitt terskel fluorescens signalnivå. Jo større mengden starte mal, jo færre sykluser det tar å oppnå et synlig fluorescens nivå. Faktisk vil prøver med en høy belastning på TiLV ha lavere Ct verdier enn prøver med en lav belastning på TiLV som i fisk med en sub klinisk infeksjon. For å bestemme Ct verdier, trekkes bakgrunn fluorescens nivåer første fra rådata. Deretter vil programvaren tilknyttet qPCR enheten automatisk velge en fluorescens terskel ved å søke data kurver for hver prøve og omfatter en Ct representerer hvor prøven krysset grensen. Dette gjøres separat for hver analysen og hver terskelen bør vurderes nøye, sikre at terskelen er satt i den logaritmiske delen av forsterkning kurver og på et sted hvor alle kurver er parallelle. Dermed bestemte Ct ervervet er en relativ verdi og det er i forhold til de starte mal kopi nummer45, men det er også spesifikke for qPCR maskinen og anvendte reagensene, effektiviteten av PCR forsterkning og følsomheten til gjenkjenning. Disse parameterne bidra til forskjellene observert bruke samme analysen i figur 6.

Fra standard kurvene i figur 6regresjon analyser, inkludert beregningen av standardkurve bakker (m) og fanger, forsterkning effektivitet (100 x (101/m -1))46 og linearitet av reaksjonen ble utført. Standardkurve analyser ble også brukt til å bekrefte følsomhet (grense gjenkjenning), repeterbarhet og reproduserbarhet til analysen. Teoretisk sett, mengden av DNA dobles hver PCR syklus, betyr at effektiviteten (E) er lik 100%. Men i praksis er slik en ideell effektivitet sjelden nådd på grunn av sub-optimale PCR forhold som, DNA polymerase hemming, forurensning, mye cDNA og pipettering feil47. Vanligvis forsterkning E varierer fra 90-110% for gode analyser, i figur 6A en virkningsgrad på 94,5% ble beregnet med 8 serielt utvannet pTiLV prøver, mens analysen effektiviteten i analysen vist i figur 6B bruker 7 serielt utvannet pTiLV prøvene var 101.2%. En virkningsgrad over 100% er vanligvis av PCR-hemmere i analysen. Lineær regresjonsanalyse av standard handlingen kan også for beregning av antall TiLV eksemplarer i hvert eksempel41,42,45, som kan observeres for tre TiLV prøvene vises i rødt i figur 6B som er i tråd med resultatene for prøver S1, S3 og S5 vist i figur 3B.

Figure 6
Figur 6 . RT-qPCR standard kurver. Sanntid PCR av 10 ganger føljetong fortynninger av pTiLV, standarden som brukes på begge laboratorier. A. 8 serielt utvannet pTiLV prøver ble testet, alle kjente konsentrasjon og korrelert til antall TiLV Kopier / reaksjon. Standardkurven ble generert ved å plotte Logg kopi nummer vs syklus terskelen (Ct). Skråningen =-3.462, R2 = 0.9992 og effektiviteten er 94.47%. B. som A, unntatt 7 serielt utvannet pTiLV prøver (grønn) ble testet og diagrammet viser terskelen syklusen på y-aksen og kopien antall TiLV (antall) på x-aksen. Y-skjæringspunktet = 32.327, skråningen =-3.292, R2 = 0,98 og effektiviteten er 101.2%. For begge standarder kurver benyttes i A og B, stigningstallet og y-skjæringspunktet korrelasjonskoeffisienten verdier (R2) for å forstå ytelsen til analysen. Viktigere, bør R2 verdien være nær 1 siden det er et mål på linearitet av standardkurven. Skråningen brukes til å måle PCR effektiviteten hvor 100% effektivitet tilsvarer en skråning på-3.32, se viktigste tekst for ligningen og ytterligere detaljer. En god qPCR reaksjon har vanligvis en virkningsgrad mellom 90-110% samkjøre til en skråning på mellom-3.58 og-3.10. Standardkurven brukes til absolutt kvantifisering av ukjent TiLV positive eksempler og bestemmer antallet TiLV Kopier / reaksjon, som er tilfelle for tre TiLV positive prøvene farget rødt i B.

Discussion

TiLV ble først rapportert i 2014 i Israel14 og siden da har det blitt identifisert i flere land, inkludert Egypt, Colombia, India, Malaysia, Uganda, Tanzania og Thailand15,16,18, 35 , 48. global bevissthet, særlig tilapia produksjon har plassert mer oppmerksomhet om virus og ulike restriksjoner og kontrolltiltak fra myndigheter har implementert prøver å hindre spredning av TiLV. Her har en detaljert protokoll for TiLV gjenkjenning i tilapia vev, dekker prøvetaking, RNA isolasjon, cDNA syntese, PCR og qPCR analyser blitt forklart. Det er ulike aspekter ved disse metodene som garanterer bestemt diskusjon. TiLV har blitt identifisert i fisk spenner over en rekke størrelser9,12,14,15,49 og arter av tilapia så langt, inkludert oppdrettet hybrid tilapia (O. niloticus x O. aureus)11,14, Nilen tilapia (O. niloticus)9,10,14,15,16, 33 , 35 , 36 , 49 , 50 og røde tilapia (Oreochromis sp.)16,33,48,51, så vel som vill Nilen tilapia9,12, svart tilapia51, T. zilli14,15, S. galilaeus, O. aureus og T. simonis intermedia14 og nylig TiLV ble identifisert i vill karpe (Barbonymus schwanenfeldii)52. Vevsprøver fra indre organer (gill, milt, lever, hjerte, hodet nyre) eller Slim37 kan samles fra sunn samt døende tilapia uavhengig av alder, størrelse eller arter og behandlet for RNA isolasjon. Totalt RNA utvinning protokollen skissert bruker her en monophasic løsning av fenol og guanidinium thiocyanate, som er en chaotropic denaturing agent. Vev er direkte homogenisert i denne løsningen etterfulgt av kloroform og sentrifugering å oppnå fase separasjon der en klar RNA inneholder øvre vandige fasen, en interphase og en lavere organisk fase genereres. RNA er isolert fra den vandige fasen av isopropanol nedbør, etterfulgt av vask av den gjenopprettede å kvitte seg med forurensninger. Isolasjon av ved denne metoden ble utviklet av Piotr Chomczynski og Nicoletta Sacchi, og ble omtalt som guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform utvinning53,54. Denne typen reagens som brukes for RNA utvinning kan være kommersielt kjøpt eller laget i laboratoriet (se Tabell for materiale for mer informasjon). Denne protokollen tar litt lengre enn kolonne-baserte metoder som rensing silisium-basert, men generelt, det er mer kostnadseffektivt og gir mer RNA.

I denne protokollen, kvantifisere RNA bruke A260 ble beskrevet der spectrophotometry verdier kan angi RNA kvalitet (A260/A280 = 1,9-2.1). Mens denne metoden vil gi en god indikasjon på prøven renhet, kan det absolutt informere om kvaliteten på den utpakkede RNA. Å riktig avgjøre om RNA er intakt eller delvis degradert, prøver kan være separasjon av agarose gel geleelektroforese der smøre på EtBr farget 18S og 28S rRNA band angir RNA degradering. Ytterligere bekreftelse av RNA kvalitet kan inkluderer bruk av en lab på-chip instrument. Videre er det også viktig å fordøye det renset RNA med DNase jeg fjerne forurensende vert genomisk DNA, som avhengig av nedstrøms programmene kan føre til falske resultater. Hvis verten gDNA er fortsatt forurensende RNA prøven i stor grad, en ekstra DNaseI behandling kan også utføres på slutten av RNA utvinning prosedyren (se Tabell for materiale).

Komplementære DNA-syntese kan sterkt påvirke de samlede qPCR-resultatene og er en del av metoden som kan introdusere variasjon. CDNA protokollen orde her består av en enkelt komponent oppsett bruker oligo (dT) og dermed bare transcribes mRNAs som inneholder polyA haler. Den lar brukerkontroll av nøyaktig hvilke komponenter til bruk i omvendt transkripsjon reaksjonen og denne modusen for cDNA syntese har vist seg vellykket TiLV gjenkjenning32. Et alternativ til dette oppsettet er et kommersielt kjøpte master-blanding som inneholder alle komponentene som kreves for omvendt transkripsjon reaksjonen og er meget raskt og enkelt uten vanlig flere trinn, pipettering og flere temperatur protokollen. Dette er en fordel fordi det reduserer håndtering og fremmer ensartethet over alle prøvene. Slike master-mikser inkluderer ofte både oligo(dT) og tilfeldig primere gjør det gjelder ulike RNA maler og genererer representant cDNA kopier av sekvenser fra hele lengden av RNAs i en befolkning (viral og tilapia vert mRNA) og i teorien, hver ønsket RNA arter kan deretter måles ved konvensjonelle PCR eller qPCR fra slik en prøve. Denne allsidigheten er den største fordelen med en 2-trinns RT PCR tilnærming; Det gir en langsiktig basseng som kan brukes til mange forskjellige eksperimenter. I resultatene, en ettrinns RT PCR tilnærming har vært representert der rekkefølgen bestemt primere (tabell 1) ble brukt og RT og PCR ble utført i en tube (se materiale). Generelt, sekvens bestemt primere tillate en høyere RT effektiviteten av bestemt målet RNA enn å bruke tilfeldige grunning, men bestemt målet RNA er den eneste som kan kvantifiseres i slike et cDNA utvalg som kan være det eneste målet for visse laboratories (se Tabell over materialer cDNA syntese produkt forslag).

Mens konvensjonelle RT PCR synes å bli brukt så langt i TiLV diagnose9,13,14,15,16,17,18, 33 , 35 , 48 , 55. RT-qPCR har vist seg å være et kraftigere verktøy for deteksjon og kvantifisering av små mengder TiLV i fisk vev eller Slim32,37. Generelt er qPCR mye brukt i klinisk virologi diagnostiske labs dens høy følsomhet, spesifisitet, god reproduserbarhet, bredt dynamisk område og hastighet21. Mens qPCR kan være utgangspunktet dyrere å implementere enn konvensjonelle RT PCR, tilbyr det mange viktige fordeler fremfor konvensjonelle PCR; den har en raskere snu-tid fra prøven resultater og krever ikke alle innlegg PCR skritt. Dette siste punktet betyr at det er minimal risiko for laboratoriet forurensning og det kan være mer lett tilpasses høy gjennomstrømming situasjoner som ved utbrudd. Det er iboende mer følsom enn konvensjonelle RT PCR, som er av avgjørende betydning å oppdage lav viral belastning i sub klinisk infeksjoner21. Dette ville kreve en nestede PCR tilnærming krever omvendt transkripsjon, to ytterligere PCR reaksjonene og analyse av agarose gel geleelektroforese. Følgende mange tar mye tid og øke sjansene for feil eller forurensning. Likevel, på grunn av dens høy følsomhet, RT-qPCR krever nitid eksperimentell design og en grundig forståelse av kvantifisering teknikker for å generere nøyaktige resultater56,57.

DNA bindende fluorophore, SYBR Green jeg har vist i denne protokollen. Det er en dsDNA uspesifikke DNA bindende fargestoff og dermed spesifisiteten av analysen ligger helt i settet med primere, som kan generere falske positiver58. Derfor, mens dsDNA smelter curve analyse utført på slutten av hver PCR er en særlig viktig del av PCR reaksjonen fordi den bekrefter at eneste PCR amplicon riktig tm er produsert (dette bør også oppnås ved gel geleelektroforese når nye analyser blir implementert). Tm av et DNA-fragment er avhengig av en rekke funksjoner som sin lengde, GC komposisjon, sekvens, strand komplementaritet, konsentrasjon så vel som på buffer komponenter og PCR enhancers. Smeltende kurve analysene i representant resultatene vises fra to laboratorier ikke avsløre tilstedeværelsen av primer-dimers eller andre uønskede PCR-produkter, men hvis dette er observert med andre eksempler og/eller eksperimentelle oppsetninger, så analysen bør være nytt optimalisert. Mer avansert qPCR teknologi krever ikke slikt smeltende kurve skritt og faktisk, siden dette metoder papir ble skrevet, en TaqMan basert TiLV RT-qPCR er utviklet to grunninger og en sonde gjør det svært TiLV bestemt34.

Utvilsomt, grunning designet for RT-qPCR analyser er grunnleggende for suksessen til analysen og primerne her ble designet basert på offentlig tilgjengelig TiLV genomic dataene på den tid32. Men RNA-virus er velkjente viser høy mutasjon priser og mulig stammer unnslippe de gjeldende diagnostiske testene, som ble observert i ISAV59. Det vil alltid være vanskelig for slike virus typer generere en universell pan-TiLV RT-qPCR analysen og slike analyser bare stadig vil forbedres hvis flere TiLV genomic data fra vidtrekkende steder og tidsperioder blir tilgjengelige.

Til slutt, er det viktig å kjøre identiske eller hvis mulig, tre eksemplarer reaksjoner i begge intra og inter qPCR analyser. Hvis Ct verdiene er svært høy, så er bruk av replikat spesielt viktig å fastslå at PCR reaksjonen er pålitelig og reproduserbar. Generelt, hvis data fra repliserer reaksjoner varierer mer enn 0,5 sykluser, reaksjonene skal gjentas og hvis Ct verdiene konsekvent varierer > 0,5 sykluser i replikerer, analysen bør optimeres re. Bruk av en integrert qPCR pipettering robot hjelper utrolig med dette problemet, men det er en luksus-verktøyet. Som med alle eksperiment er inkludering tilstrekkelig og riktig kontrollene av største betydning for utviklingen av robust molekylær analyser, spesielt i laboratorier hvor slike analyser må være akkreditert. Kontroller bør inneholde positive (positiv TiLV eksempel, TiLV plasmider standard) og negative kontroller (NTC og -RT) prøver, i tillegg til oppdagelsen av endogene tilapia housekeeping gener. Slike kontroller kan ikke undervurderes og bør inkluderes i hver analysen å riktig forstå kvaliteten på hvert trinn i analysen og riktig tolke resultatene.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi er takknemlige til instituttet av veterinær bakteriell, Vetsuisse fakultet, Universitetet i Bern for deres støtte. Dette arbeidet ble finansiert av komiteen for akademiske forfremmelse av tidlig karriere forskere og likestilling ved Vetsuisse fakultet, Universitetet i Bern av 120% modell finansiering til PN. WS og PR støttes av Center for Advanced Studies for landbruk og mat, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, Bangkok, Thailand under høyere utdanning forskning fremme og National Research University prosjektet i Thailand, Office av høyere utdanning provisjon, Utdanningsdepartementet, Thailand. Vi vil gjerne takke Dr. Kwanrawee Sirikanchana for hennes lydkommentarer og Piyawatchara Sikarin for redigering av video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue collection Step 1
Tricaine methanesulfonate Sigma-Aldrich E10521 An alternative to clove oil. 
Step 1.1
RNAlater stabilization solution Thermo Fisher Scientific   AM7020 For storing tissues if they cannot be processed immediately
Step 1.3
RNA extraction Step 2
TRIreagent Sigma-Aldrich  Step 2.1
TRIzol Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) 15596026 Step 2.1
GENEzol Geneaid GZR100 Step 2.1
Trisure Bioline BIO-38032 Step 2.1
Homemade solution  -  - 94.53 g/L (800 mM) guanidine thiocyanate
30.45 g/L  (400 mM) ammonium thiocyanate
8.20 g/L  (100 mM) sodium acetate
380 mL/L  (38 % v/v) phenol
50 mL/L (5 % v/v) glycerol
1.0 g/L (0.1 % w/v) 8-quinolinol, pH 5.0
Store up to 2 years at 4oC
Step 2.1
MagNA Lyser Green Beads Roche 3358941001 An alternative tissue homogenization method used in conjunction with tissue lysing machines detailed below
Step 2.2
Lysing Matrix D, 2 mL Tube MP BIOMEDICALS 116913050
Chloroform Sigma-Aldrich C2432 Step 2.3
Chloroform RCI Labscan AR1027E-G2.5L Step 2.3
1-Bromo-3-chloropropane Sigma-Aldrich B9673 A less toxic alternative to chloroform
Step 2.3
Isopropanol (GC) ≥ 99.8 % Sigma-Aldrich 59300 Step 2.6
Isopropanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur) Merck KGaA (EMSURE) 1.09634.2500 Step 2.6
Glycogen, molecular biology grade (e.g., Sigma, cat. no. G1767) Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific) R0551 Useful step if tissue starting material is small to maximise RNA precipitation
optional
Ethanol (purity (GC) ≥ 99.9 % Sigma-Aldrich (EMD Millipore) 1.00983 Step 2.9
Ethanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur) Merck (EMSURE) 1.00983.2500 Step 2.9
Nuclease-free water Promega P1193 Step 2.13
Nuclease-free water Multicell 809-115-CL Step 2.13
Ambion TURBO DNA-free kit  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) AM1907 Can be performed at the end of the RNA extraction protocol
optional
cDNA synthesis Step 4
Viva cDNA Synthesis Kit Vivantis cDSK01 Step 4.1 & 4.3
ReverTra Ace qPCR RT MasterMix with gDNA remover Toyobo A1172K An alternative option 
see discussion
ReverTra Ace qPCR RT Kit Toyobo FSQ-101 An alternative option 
see discussion
AffinityScript Multiple Temperature Reverse Transcriptase  Agilent Technologies 600107 An alternative option 
PCR Step 5
DNA polymerase systems: Step 5.2
   - Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X)  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)  14001012a Step 5.2
   - GoTaq Mastermix Promega M7122 Step 5.2
Separate PCR mixture components: Step 5.2
10mM dNTP Mix Vivantis NP2409 Step 5.2
25mM MgCl2 Thermo Fisher Scientific R0971 Step 5.2
10X Taq Buffer with KCl Thermo Fisher Scientific 00348114 Step 5.2
Taq DNA polymerase Vivantis PL1202 Step 5.2
   - Verso 1-step RT-PCR ReddyMix with ThermoPrime Taq Thermo Fisher Scientific  AB1454 One step RT-PCR exemplified in Figure 3B
Gel electrophoresis: For visulation of PCR products from steps 5.1-5.4
Ethidium Bromide solution (10 mg/mL) Thermo Fisher Scientific 17898 Step 5.5
Tris/Acetic/EDTA (TAE) buffer: Step 5.5
   - Tris Vivantis PR0612-1KG Step 5.5
   - Acetic acid (glacial) (ACS, ISO, Reag. Ph Eur) Merck KGaA (EMSURE) 1.00063.2500 Step 5.5
   - Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BIO-RAD 161-0729 Step 5.5
Agarose Vivantis PC0701-100G Step 5.5
DNA ladders and markers Vivantis NL1405 Step 5.5
DNA gel loading dye (6X) Thermo Fisher Scientific R0611 Step 5.5
qPCR Step 6
PowerUP SYBR Green Master Mix Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) A25779 Exemplified in Figures 4-6B
Step 6.2
iTaq Universal SYBR Green Supermix BIO-RAD 1725120 Exemplified in the video and in Figures 4-6A
Step 6.2
Equipment 
Dounce tissue grinder pestle Sigma-Aldrich P1110 Protocol 2
MagNA Lyser Instrument Roche 3358976001 An alternative tissue homogenizing option for protocol 2 which are used in conjunction with the lysing beads detailed above
Step 2.2
FastPrep-24 5G Homogenizer MP BIOMEDICALS 116005500
Refrigerated microcentrifuge Eppendorf Eppendorf 5427R Protocol 2
Step 2.4, 2.7 & 2.10
Refrigerated microcentrifuge Eppendorf Eppendorf 5418R
Heat box Labnet AccuBlock Digital Dry Bath Protocol 2
Step 2.13
Microvolume spectrophotometer  Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) Nanodrop 2000 Protocol 3
Step 3.1 - 3.4
PCR machine BIO-RAD T100 Thermal Cycler Protocol 5
Step 5.4
Power supply BIO-RAD PowerPac HC Protocol 5
Step 5.5
Horizontal gel electrophoresis BIO-RAD Mini ReadySub-Cell GT Cell #1704487edu Protocol 5
Step 5.5
Mini microcentrifuge Corning LSE 6766 Useful to quickly spin down PCR reaction tubes in protocols 4, 5 & 6
Step 6.5.1
Microcentrifuge LioFuge LM-60 Step 6.5.1
qPCR machine and software Thermo Fisher Scientific 7500 Fast Real-Time PCR System with 7500 Software v2.0 Protocol 6
Step 6.6-6.8
qPCR machine and software BIO-RAD CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System with CFX Manager software
General Materials 
Mayo scissors Step 1.1-1.2
Forceps Step 1.1-1.2
Pipette Rainin Pipette-Lite XLS
Aerosol-barrier pipette tips Sigma-Aldrich Z333328, Z333336, Z333344
Nuclease-free 1.5-ml microcentrifuge tubes Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. FAO. The State of World Fisheries and Aquaculture, 2014. Opportunities and Challenges. , Rome. (2014).
  2. FAO. The State of World Fisheries and Aquaculture, 2016. Contributing to Food Security and Nutrition for all. , Rome. (2016).
  3. WorldBank. FISH TO 2030: Prospects for Fisheries and Aquaculture. Agriculture and Environmental Services Discussion Paper 03. , (2013).
  4. Wing-Keong, N., Nicholas, R. A review of the nutrition and feeding management of farmed tilapia throughout the culture cycle. Reviews in Aquaculture. 5 (4), 220-254 (2013).
  5. Cleasby, N., et al. The socio-economic context for improving food security through land based aquaculture in Solomon Islands: A peri-urban case study. Marine Policy. 45, 89-97 (2014).
  6. Ponzoni Raul, W., et al. Genetic improvement of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) with special reference to the work conducted by the WorldFish Center with the GIFT strain. Reviews in Aquaculture. 3 (1), 27-41 (2011).
  7. Hounmanou, Y. M. G., et al. Tilapia lake virus threatens tilapiines farming and food security: Socio-economic challenges and preventive measures in Sub-Saharan Africa. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 493, 123-129 (2018).
  8. OIE. Tilapia Lake Virus (TiLV) - a novel orthomyxo-like virus. OIE technical disease cards. , http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Internationa_Standard_Setting/docs/pdf/A_TiLV_disease_card.pdf (2018).
  9. Mugimba, K. K., et al. Detection of tilapia lake virus (TiLV) infection by PCR in farmed and wild Nile tilapia (Oreochromis niloticus) from Lake Victoria. Journal of Fish Diseases. , (2018).
  10. Koesharyani, I., Gardenia, L., Widowati, Z., Khumaira,, Rustianti, D. D. Studi kasus infeksi tilapia lake virus (tilv) pada ikan nila (Oreochromis niloticus). Jurnal Riset Akuakultur. 13 (1), 85-92 (2018).
  11. OIE. Tilapia lake virus disease (TiLV), Chinese Taipei. Immediate Notification. , http://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Reviewreport/Review?reportid=24033 (2017).
  12. OIE. Tilapia Lake Virus Disease (TiLV), Peru. Immediate Notification. , (2018).
  13. Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), e00431-e00416 (2016).
  14. Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
  15. Nicholson, P., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Egyptian fish farms experiencing high mortalities in 2015. Journal of Fish Diseases. 40 (12), 1925-1928 (2017).
  16. Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
  17. Tattiyapong, P., Dachavichitlead, W., Surachetpong, W. Experimental infection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) and red tilapia (Oreochromis spp.). Veterinary Microbiology. 207, 170-177 (2017).
  18. Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
  19. Thangaraj, R. S., et al. Derivation of two tilapia (Oreochromis niloticus) cell lines for efficient propagation of Tilapia Lake Virus (TiLV). Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 492, 206-214 (2018).
  20. Hanson, L. A., Rudis, M. R., Vasquez-Lee, M., Montgomery, R. D. A broadly applicable method to characterize large DNA viruses and adenoviruses based on the DNA polymerase gene. Virology Journal. 3, 28-28 (2006).
  21. Josko, D. Molecular virology in the clinical laboratory. Clinical Laboratory Science. 23 (4), 231-236 (2010).
  22. Munir, K., Kibenge, F. S. Detection of infectious salmon anaemia virus by real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods. 117 (1), 37-47 (2004).
  23. Snow, M., et al. Developement, application and validation of a Taqman real-time RT-PCR assay for the detection of infectious salmon anaemia virus (ISAV) in Atlantic salmon (Salmo salar). Developments in Biologicals. 126, discussion 325-136 133-145 (2006).
  24. Matejusova, I., McKay, P., McBeath, A. J., Collet, B., Snow, M. Development of a sensitive and controlled real-time RT-PCR assay for viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) in marine salmonid aquaculture. Diseases of Aquatic Organisms. 80 (2), 137-144 (2008).
  25. Garver, K. A., et al. Development and validation of a reverse transcription quantitative PCR for universal detection of viral hemorrhagic septicemia virus. Diseases of Aquatic Organisms. 95 (2), 97-112 (2011).
  26. Dalla Valle, L., et al. Development of a sensitive and quantitative diagnostic assay for fish nervous necrosis virus based on two-target real-time PCR. Veterinary Microbiology. 110 (3-4), 167-179 (2005).
  27. Hodneland, K., Garcia, R., Balbuena, J. A., Zarza, C., Fouz, B. Real-time RT-PCR detection of betanodavirus in naturally and experimentally infected fish from Spain. Journal of Fish Diseases. 34 (3), 189-202 (2011).
  28. Hodneland, K., Endresen, C. Sensitive and specific detection of Salmonid alphavirus using real-time PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 131 (2), 184-192 (2006).
  29. Wang, X. W., Ao, J. Q., Li, Q. G., Chen, X. H. Quantitative detection of a marine fish iridovirus isolated from large yellow croaker, Pseudosciaena crocea, using a molecular beacon. Journal of Virological Methods. 133 (1), 76-81 (2006).
  30. van Beurden, S. J., et al. Development and validation of a real-time PCR assay for the detection of anguillid herpesvirus 1. Journal of Fish Diseases. 39 (1), 95-104 (2016).
  31. Ciulli, S., et al. Development and application of a real-time PCR assay for the detection and quantitation of lymphocystis disease virus. Journal of Virological Methods. 213, 164-173 (2015).
  32. Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
  33. Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 476, 111-118 (2017).
  34. Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 497, 184-188 (2018).
  35. Behera, B. K., et al. Emergence of Tilapia Lake Virus associated with mortalities of farmed Nile Tilapia Oreochromis niloticus (Linnaeus 1758) in India. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 484, 168-174 (2018).
  36. Ferguson, H. W., et al. Syncytial hepatitis of farmed tilapia, Oreochromis niloticus (L.): a case report. Journal of Fish Diseases. 37 (6), 583-589 (2014).
  37. Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 486, 75-80 (2018).
  38. Yang, C. G., et al. Evaluation of reference genes for quantitative real-time RT-PCR analysis of gene expression in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Gene. 527 (1), 183-192 (2013).
  39. Bustin, S. A. Real-time, fluorescence-based quantitative PCR: a snapshot of current procedures and preferences. Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (4), 493-498 (2005).
  40. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27 (2-3), 126-139 (2006).
  41. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine. 27 (2-3), 95-125 (2006).
  42. Mackay, I. M., Arden, K. E., Nitsche, A. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Research. 30 (6), 1292-1305 (2002).
  43. Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
  44. Bustin, S. A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology. 25 (2), 169-193 (2000).
  45. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Research. 6 (10), 986-994 (1996).
  46. Rutledge, R. G., Côté, C. Mathematics of quantitative kinetic PCR and the application of standard curves. Nucleic Acids Research. 31 (16), e93-e93 (2003).
  47. Svec, D., Tichopad, A., Novosadova, V., Pfaffl, M. W., Kubista, M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomolecular Detection and Quantification. 3, 9-16 (2015).
  48. Amal, M. N. A., et al. A case of natural co-infection of Tilapia Lake Virus and Aeromonas veronii in a Malaysian red hybrid tilapia (Oreochromis niloticus × O. mossambicus) farm experiencing high mortality. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 485, 12-16 (2018).
  49. Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by ‘summer mortality’ syndrome. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 473, 430-432 (2017).
  50. OIE. Tilapia Lake Virus disease (TiLV), Philippines. Immediate Notification. , (2017).
  51. OIE. Tilapia lake virus disease (TiLV), Malaysia. Immediate Notification. , https://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Reviewreport/Review?page_refer=MapFullEventReport&reportid=24809 (2017).
  52. Abdullah, A., et al. First detection of tilapia lake virus (TiLV) in wild river carp (Barbonymus schwanenfeldii) at Timah Tasoh Lake, Malaysia. Journal of Fish Diseases. 41 (9), 1459-1462 (2018).
  53. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  54. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).
  55. Del-Pozo, J., et al. Syncytial Hepatitis of Tilapia ( Oreochromis niloticus L.) is Associated With Orthomyxovirus-Like Virions in Hepatocytes. Veterinary Pathology. 54 (1), 164-170 (2017).
  56. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  57. Purcell, M. K., Getchell, R. G., McClure, C. A., Garver, K. A. Quantitative polymerase chain reaction (PCR) for detection of aquatic animal pathogens in a diagnostic laboratory setting. Journal of Aquatic Animal Health. 23 (3), 148-161 (2011).
  58. Simpson, D. A., Feeney, S., Boyle, C., Stitt, A. W. Retinal VEGF mRNA measured by SYBR green I fluorescence: A versatile approach to quantitative PCR. Molecular Vision. 6, 178-183 (2000).
  59. Kibenge, M. J., et al. Discovery of variant infectious salmon anaemia virus (ISAV) of European genotype in British Columbia, Canada. Virology Journal. 13, 3 (2016).

Tags

Miljøfag problemet 141 Tilapia innsjøen virus tilapia diagnose RT PCR RT-qPCR orthomyxo-lignende virus
Påvisning av Tilapia Lake Virus bruker konvensjonelle RT PCR og SYBR grønne RT-qPCR
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nicholson, P., Rawiwan, P.,… More

Nicholson, P., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR. J. Vis. Exp. (141), e58596, doi:10.3791/58596 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter