本文介绍一种深度测序方法，可无偏倚地确定新生3'末端以及单链DNA分子的突变谱型。该方法的主要应用是表征新生逆转录病毒互补DNA（cDNA），即逆转录病毒逆转录过程中产生的中间产物。
本文内容
摘要
摘要
在病毒复制过程中监测核酸中间产物，可深入了解抗病毒化合物及宿主细胞蛋白对病毒DNA合成的影响及其作用机制。本文针对现有技术在基于细胞、高覆盖度和高分辨率方面检测逆转录病毒逆转录中间产物的不足，提出一种能够在病毒感染的生理环境下精确定义此类中间产物的检测方法。该方法可在单核苷酸分辨率水平捕获HIV-1感染细胞中新生成的互补DNA（cDNA）分子的3'-末端。本实验方案包括全细胞DNA的提取、病毒DNA的靶向富集 通过 杂交捕获、接头连接、凝胶纯化进行片段大小分选、PCR扩增、深度测序及数据分析。其中关键步骤是对接头分子与开放的3'-DNA末端进行高效且无偏倚的连接。本方法可用于确定给定样本中每种特定长度的逆转录产物的丰度，同时提供有关逆转录产物内部序列变异的信息，从而揭示潜在的突变。总体而言，只要模板序列已知，该检测方法适用于任何与DNA 3'-延伸相关的问题研究。
引言
为了深入剖析并全面理解病毒复制过程，需要采用日益精细的技术来捕获复制中间体。特别是，在感染细胞的背景下精确定义病毒核酸的种类可提供新的见解，因为迄今为止许多病毒复制机制都是在分离条件下进行研究的 体外 反应。一个典型的例子是逆转录病毒（如人类免疫缺陷病毒1型，HIV-1）中的逆转录过程。HIV-1逆转录的各个步骤，即病毒酶逆转录酶（RT）将单链RNA基因组复制为双链DNA的过程，主要通过使用纯化的蛋白质和核酸进行引物延伸实验来研究。1,2,3,4,5尽管已确立了基本原理，但此类检测未包含所有病毒和细胞组分，可能无法反映相关因子在生物学上真实的化学计量关系。因此，我们设计了一种强大的技术，用于确定具有精确cDNA 3'-末端的逆转录中间产物谱即， 确定其在活细胞感染背景下的确切长度和核苷酸序列6时间序列实验数据的收集可用于比较不同条件下转录本的表达模式，例如在存在抗病毒分子或蛋白质的情况下，这些条件可能影响DNA合成与积累的效率和持续性。这有助于更深入地理解病原体的自然生命周期，而该理解往往是靶向药物设计和成功治疗干预的基础。
HIV-1 逆转录包含一系列连续事件，起始于tRNA引物与基因组RNA模板的退火，随后由逆转录酶（RT）延伸，生成一段短的单链cDNA转录本，称为负链强终止（-sss）（见图1）。随后，-sss cDNA从基因组RNA的5'-长末端重复序列（LTR）转移至3'-LTR，在此处退火并作为引物，启动RT介导的负链DNA的持续延伸（参见关于逆转录的综述1,2,3,4）。这一第一次链转移是逆转录过程中的限速步骤之一，因此已知-sss cDNA会积累。在感染细胞中捕获逆转录产物的基本工作流程和文库设计如图2a所示。本方案中使用的特异性引物和分析设置（列于表1）可靶向长度范围在23至约650 nt之间的所有早期逆转录cDNA中间体，其中包括180–182 nt的-sss DNA。然而，对该策略进行适当的小幅调整后，也可应用于晚期逆转录产物，以及其他需要检测含有3'-OH末端的DNA的病毒和系统。需注意的重要限制因素包括文库中最终PCR产物的长度范围；特别是，当开放的3'-末端上的接头与上游引物结合位点之间的距离超过约1000 nt时，其测序效率可能较低，可能在文库构建过程中引入误导性的技术偏差（详见讨论部分中的详细说明及调整建议）。
先前报道的用于系统确定核酸链3'末端的技术主要集中在RNA分子，而非DNA分子。一个例子是3' RACE（cDNA末端的快速扩增）7，该方法依赖于mRNA的多聚腺苷酸化。此外，还开发了基于接头连接的策略，使用RNA连接酶，包括RLM-RACE（RNA连接酶介导的RACE）8和LACE（基于连接的cDNA末端扩增）9。需要强调的是，基于连接的扩增方法对接头连接反应本身引入的任何偏倚都非常敏感。例如，连接效率可能因3'端特定核苷酸、序列、分子总长度或局部结构的不同而有所差异。此类连接酶偏好性会导致分子捕获不完全，并在检测结果中产生偏差，这一点已被我们及其他研究者观察到9,10。为了在本方案所述的接头添加步骤中最大限度地减少连接偏倚，我们测试了多种连接策略，结果发现只有使用T4 DNA连接酶与发夹结构的单链DNA接头（如Kwok et al.11所述）的方法能够实现接近定量的连接效率，并且在使用一组特选的对照寡核苷酸进行评估时，未出现显著的连接效率差异6。因此，选择该连接策略是本方案成功的关键特征之一。
迄今为止，在感染细胞中对HIV-1逆转录酶（RT）进程的监测主要通过定量PCR（qPCR）实现，该方法使用特异性引物-探针组合，检测不同长度的逆转录产物，从而分别定量较短或较长的cDNA产物（分别代表早期和晚期逆转录产物）12,13,14。尽管该qPCR方法适用于评估逆转录过程在细胞系统中的内在效率，但其结果分辨率相对较低，且无法获得序列信息。我们提出的新方法基于优化的接头连接、PCR介导的文库构建以及深度测序，填补了这一技术空白，能够以单核苷酸分辨率对HIV-1感染过程中的逆转录进行定量监测。
我们已在一项研究中展示了该方法的实用性，该研究区分了两种关于HIV-1限制因子APOBEC3G（载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G）干扰病毒逆转录产物生成能力的假说模型6。
方案
注意：请参阅本实验方案所用特定试剂和设备的材料列表。
1. 病毒制备与细胞感染
警告：具有传染性的HIV-1仅可在经批准的生物安全防护实验室中操作。
注意：通过瞬时转染人胚胎肾（HEK）293T细胞来生产HIV-1颗粒（如步骤1.1所述）是一种标准操作，此前已有描述15,16。常规细胞培养操作此前已有描述17。
- HIV-1病毒的制备
- 在标准细胞培养箱中，于37 °C、5% CO₂条件下，将293T细胞培养于添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（完全DMEM）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中2 如前所述17.
- 在标准的层流生物安全柜中，移除培养基，并向接近汇合的10 cm细胞培养皿（约1.2 × 10⁶细胞）加入3 mL预热至37 °C的胰蛋白酶7 293T 细胞的细胞。将培养皿放回培养箱中孵育 2-3 分钟。
- 将培养皿从培养箱中取出，放回组织培养操作台，加入7 mL完全培养基。在培养皿中用移液器吹打数次，以重悬细胞。取2.5 mL细胞悬液接种至新的10 cm培养皿中，按1:4比例传代，并加入7.5 mL完全培养基。
- 次日，将10 µg的HIV-1前病毒质粒DNA（如pNL4.3）与1 mL无血清最低必需培养基混合，按每1 µg DNA加入4.5 µL的比例添加聚乙烯亚胺（PEI）溶液（25,000 mW，1 mg/mL，pH 7）。室温孵育10分钟后，逐滴加入293T细胞中。
- 转染24小时后，吸去培养基，加入6 mL含RNase-free DNase（20 U/mL）的完全DMEM。6小时后，更换为10 mL完全DMEM。
- 转染48小时后，收集上清液，使用10 mL注射器经0.22 µm滤膜过滤至15 mL聚丙烯管中。
- 向敞口薄壁超速离心管中加入 2 mL 无菌的含 20% 蔗糖的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）。将滤过的细胞上清液缓慢铺加在蔗糖溶液上方。
- 在4 °C条件下，使用超速离心机以134,000 x g离心1小时15分钟。
- 小心地从超速离心机中取出离心管。使用抽吸装置或移液器缓慢移除上清液和蔗糖溶液。移除最后的蔗糖溶液时，应使用较小的移液器并倾斜离心管。将沉淀的病毒颗粒留在管底。
注意：沉淀物将不可见。 - 加入200 µL 1x PBS，置于冰箱中孵育4至12小时，重悬后分装为20 µL每份，于-80 °C冻存。
- 测定p24Gag 使用p24 HIV-1抗原ELISA试剂盒（按照制造商说明书）进行内容检测。
- T细胞系感染
- 培养一种永生化T细胞系（例如，CEM-SS 细胞）置于添加了 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 培养基（完全 RPMI 培养基）中培养。使用血细胞计数板对细胞进行计数18 每个样本接种1个孔，每孔加入1 mL完整的RPMI培养基，含2 × 106 细胞/mL，置于12孔细胞培养板中。
- 加入相当于150 ng p24的HIV-1颗粒Gag 将培养板放入带有生物安全盖的摆动离心桶中，在台式离心机中于30 °C、2,000 × g条件下离心2小时，进行离心感染。
- 从离心机中取出培养板，置于标准组织培养孵育箱中，在37 °C、5% CO₂条件下静置1小时。2.
- 为去除未进入细胞的病毒，将细胞悬液转移至微量离心管中，在室温（RT）下以500 × g离心2分钟，收集细胞。弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
- 将细胞沉淀重悬于1 mL预热（37 °C）的无菌1×PBS中。重复离心、移除上清液和重悬步骤两次。
- 再次离心，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL完全RPMI培养基中。将每种悬液加入新的12孔板中的一个孔内。
- 在初次加入病毒后6小时（离心后4小时），参照步骤1.2.4的方法通过离心收集细胞。移除并弃去上清液。细胞沉淀可于-80 °C冷冻保存，或直接用于DNA提取。
2. DNA 提取、HIV-1 DNA 定量及通过杂交捕获进行富集
- 按照试剂盒说明书对组织培养细胞使用血液和组织总DNA提取试剂盒提取全细胞DNA。唯一不同之处在于使用200 µL无核酸酶的H2O进行洗脱，而非试剂盒提供的洗脱缓冲液。
注意：在加入变性裂解缓冲液（试剂盒中的"AL缓冲液"）和蛋白酶后，样品可从生物安全 containment 实验室转移至标准安全级别的实验室继续后续操作。 - 通过qPCR测定HIV-1 cDNA的拷贝数。
- 取第2.1步洗脱液17 µL，加入2 µL 10x限制性内切酶缓冲液和1 µL DpnI限制性内切酶。在37 °C孵育1小时，以去除转染过程中可能残留的输入质粒DNA。
- 使用以下引物探针组合对负链强终止cDNA进行qPCR扩增：oHC64（5′-taactagggaacccactgc-3′）和oHC65（5′-gctagagattttccacactg-3′），探针为oHC66（5′-FAM- acacaacagacgggcacacacta-TAMRA-3′）。qPCR反应体系及具体条件参见参考文献6,13。同时设置pNL4.3前病毒质粒的系列稀释样本作为标准曲线，用于确定cDNA分子的拷贝数。
注意：预期数量请参见讨论部分。
- 通过杂交捕获法富集HIV-1 DNA。
注意：从本步骤开始，建议对所有DNA样品使用低核酸结合特性的微量离心管以及带气溶胶过滤功能的移液器吸头。如有可能，应在PCR工作站内操作。除非另有说明，所有步骤和试剂均在室温（RT）下进行。- 为制备磁性链霉亲和素微珠的主混合液，将每份样品100 µL微珠加入同一微量离心管中。将该管置于适用于微量离心管的磁力架上。
- 待微珠沉降到管壁靠近磁铁的一侧（约1分钟）后，吸除储存缓冲液，将管从磁力架上取下，加入500 µL结合与洗涤缓冲液（BW缓冲液，5 mM Tris-HCl pH 7.5，0.5 mM EDTA，1 M NaCl）重悬微珠以进行洗涤。
- 将管重新放回磁力架，吸除上清液，加入500 µL酪蛋白溶液。从磁力架上取下管，重悬后在室温孵育10分钟，然后用BW缓冲液洗涤。
注意：“洗涤”指将管置于磁力架上，吸除上清液，取下管，加入缓冲液并重悬微珠。 - 将管再次放回磁力架，吸除上清液，每份样品用500 µL BW缓冲液重悬微珠，并加入每种捕获用生物素化寡核苷酸各50 pmol（参见表1，本例中使用三种寡核苷酸）。（例如，若处理5份DNA样品，则使用第2.3.1步中的500 µL磁珠和每种寡核苷酸250 pmol）。
- 在室温下于翻转混合仪中轻轻摇动孵育30分钟。
- 用1x TEN缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM EDTA，100 mM NaCl）洗涤两次，每次500 µL。
- 每份样品用10 µL 1x TEN缓冲液重悬微珠。
- 为每份样品标记一个微量离心管，加入10 µL微珠悬液、170 µL DNA（来自第2.1步）和90 µL 3x TEN缓冲液。在干式加热块中92 °C孵育2分钟，使DNA变性。
- 将管转移至另一设定为52 °C的干式加热块中，孵育1小时。在此期间定期倒置混匀（约每10分钟一次）。
- 用500 µL 1x TEN缓冲液洗涤一次，然后用35 µL无核酸酶的H2O重悬。
- 为洗脱目标DNA，将管在干式加热块中92 °C孵育2分钟，随后迅速将管依次置于磁力架上（一次一管）。待微珠吸附至管壁后，将含有HIV-1 DNA的上清液转移至新管中。
- 可选：重复qPCR检测（如第2.2.2步所述），以测定回收的HIV-1 cDNA量。
注意：预期数量请参见讨论部分。
3. 接头连接
- 准备接头
- 将冻干的接头（见 表1 "full Kwok + MiSeq"）用无核酸酶的 H2O 溶解至 100 µM。
- 每份样品外加一个对照样品，分别加入 0.45 µL 的 10×T4 DNA 连接酶缓冲液、4 µL 接头和 0.05 µL 无核酸酶的 H2O。在 92 °C 加热 2 分钟，然后缓慢冷却。
注意：如有条件，可使用具有可调冷却速率的 PCR 仪（设置为 2% 的冷却速率），从 92 °C 降至 16 °C 约需 30 分钟。或者，也可将样品置于 92 °C 的干式加热块中，随后关闭电源，待加热块自然冷却至室温时取出接头混合液。此步骤旨在使接头形成发夹结构（见 图2b）。
- 使用一组合成的寡核苷酸（见 表2）代替从细胞中提取的 DNA，制备对照反应。
- 将每种寡核苷酸配制成 100 µM 的储存液。取 17 种寡核苷酸各 1 µL 混合，并加入 8 µL H2O，使终体积为 25 µL，各寡核苷酸等摩尔混合。
- 将上述混合液用无核酸酶的 H2O 进行连续稀释，稀释比例为 1:2,500。取 1 µL 稀释后的混合液与 17.3 µL 无核酸酶的 H2O 混合，用于步骤 3.3.1 的对照样品连接反应，使每种寡核苷酸终浓度为 1.6 fmol（在 60 µL 反应体系中相当于 0.026 nM）。
- 设置连接反应
- 在 PCR 管中进行终体积为 60 µL 的反应，加入 6 µL 10×T4 DNA 连接酶缓冲液、24 µL 40% PEG、6 µL 5 M 甜菜碱、4.5 µL（400 pmol）接头（按步骤 3.1.2 预先退火）、1.2 µL T4 DNA 连接酶（2,000,000 单位/mL）以及 18.3 µL DNA（来自步骤 2.3.11）。
注意：对于 40% PEG 等黏稠溶液，需特别注意准确移取体积。不要配制总混合液（mastermix）。 - 按照步骤 3.3.1 的相同条件设置反应，但使用步骤 3.2.2 中制备的对照寡核苷酸混合液。
- 充分混匀各反应体系，并在 PCR 仪中于 16 °C 过夜孵育。
- 在 PCR 管中进行终体积为 60 µL 的反应，加入 6 µL 10×T4 DNA 连接酶缓冲液、24 µL 40% PEG、6 µL 5 M 甜菜碱、4.5 µL（400 pmol）接头（按步骤 3.1.2 预先退火）、1.2 µL T4 DNA 连接酶（2,000,000 单位/mL）以及 18.3 µL DNA（来自步骤 2.3.11）。
4. 接头去除与片段大小分离
- 变性凝胶电泳
- 向每个连接反应中加入 30 µL 含甲酰胺的 DNA 上样缓冲液。用移液器充分混匀。
- 在PCR仪中94 °C加热2分钟，然后立即置于冰上。
- 将一块预制的6% Tris/硼酸/EDTA（TBE）变性尿素聚丙烯酰胺凝胶（10孔梳）放入合适的凝胶电泳槽中。加入1× TBE（89 mM Tris碱，89 mM 硼酸，2 mM EDTA）电泳缓冲液，并在250 V/最大恒定电压下预电泳20分钟。
- 使用注射器和21G针头，用电泳缓冲液冲洗凝胶孔。
- 将每份90 µL样品分别加入三个孔中（每孔30 µL），以250 V/最大电压运行20分钟，直至深蓝色染料前沿迁移至凝胶约一半位置。
- 从凝胶中染色并切割核酸
- 每个样本准备3个小型微量离心管（0.5 mL），用21 G注射器针头在管底刺孔（操作锐器时需小心）。将制备好的小管插入2.0 mL微量离心管中，并标记样本名称及 "低", "中" 或 "高".
- 取出凝胶盒并撬开。用剃须刀片将凝胶垂直切割，完整切下含有3个加样孔的胶条。将胶条放入盛有约30 mL 1x TBE缓冲液和5 µL 氰染料核酸染料的容器中，孵育3–5分钟。
注意：凝胶回收步骤极易受到交叉污染的影响。建议每次电泳只上一个样品，并为每块凝胶染色使用独立且洁净的容器。若凝胶颗粒接触到戴着手套的手指，应立即更换手套。 - 用ddH₂O彻底清洁蓝光透射仪的表面2取出凝胶块 染色容器并将其放入光箱中。
- 打开光源盒，通过橙色滤光片观察染色的核酸。
注意：适配器通常显示过载，并以较大功率运行 "斑点" 带有连接的HIV-1 DNA作为条带在上方跑出。 - 使用新的剃须刀片，若凝胶两侧存在未加样区域，则将其切除。接着，在接头（adaptor）上方进行切割，以去除接头及凝胶下部。最后，切除凝胶最顶端部分，包括约1 mm的加样孔（gel pockets）区域，该区域常出现高分子量DNA的强锐信号。
- 将含有样品的剩余凝胶块（通常大小约为 2 x 3 cm）水平均分为三等份： "低", "中" 和 "高" 分子量区域
注意：每一块将分别进行处理[即每个原始样本将分为三管（低、中、高）。 - 将三个凝胶片段分别切成更小的碎片（约 2 x 2 mm 的颗粒），并转移至已准备好的 0.5 mL 微离心管中（步骤 4.2.1）。
- 以最大转速开盖离心1分钟，使胶粒通过小孔挤入2 mL离心管，形成胶状混合物。若0.5 mL离心管底部仍有残留胶粒，使用针头或移液器吸头手动转移至2 mL离心管中。
- DNA提取
- 加入1 mL尿素凝胶提取缓冲液（0.5 M NH₄HCO₃，40%甲醇）4CH3CO2，1 mM EDTA，0.2% SDS）加入凝胶碎屑中，于室温下用翻转混匀仪旋转混匀至少3小时（过夜亦可）。
- 使用一套洁净的镊子将一片小型圆形玻璃纤维滤膜加入带有醋酸纤维素膜滤器（0.2 µm）的离心柱中，以避免膜堵塞。 使用倒置的移液器吸头将滤膜放置到位。
- 将含有凝胶碎片和提取缓冲液的2 mL离心管在微量离心机中短暂离心，然后将700 µL上清液转移至已准备好的滤柱中。保留凝胶碎片及剩余上清液。
- 在微型离心机中以最高速度离心过滤柱1分钟。将穿滤液转移至新的2.0 mL微型离心管中。
- 用剩余的上清液重新加载层析柱。尽量从提取物浆液中获取尽可能多的液体。转移凝胶碎片无需担心。再次离心，并合并相同提取样品的穿流液。
- DNA沉淀
- 向4.3.5步骤的穿流液中加入3 µL多聚A RNA（1 µg/µL，作为载体）、1 µL糖原和0.7 mL异丙醇。短暂涡旋混匀，于-80 °C冷冻过夜。
- 从-80 °C冰箱中取出样品，短暂解冻。将样品置于预冷（4 °C）的微量离心机中，以最大速度离心30 min。
- 移除并弃去上清液。注意不要吸走沉淀，若不确定是否会影响沉淀，可残留30至50 µL液体。
注意：通常所有 "高" 样品显示出比之前更明显的沉淀物 "中" 和 "低" 样本。 - 加入800 µL 80%乙醇，倒置离心管并再次以最高速度离心1分钟。用移液器吸除大部分乙醇，短暂再次离心，然后用小体积移液器吸除残留乙醇。
- 将管盖打开，置于55 °C干式加热块中，使残留乙醇挥发。待样品干燥后（2–4分钟），加入20 µL无核酸酶水2轻轻旋转离心管，使液体覆盖管底，确保DNA沉淀完全溶解。DNA样品可保存于-20 °C。
5. PCR 扩增与文库构建
- 使用20 µL DNA聚合酶预混液、18 µL步骤4.4.5中沉淀并重新溶解的DNA以及1 µL上游引物，配制40 µL PCR反应体系 "MP1.0 + 22HIV" （10 µM）（参见 表1），以及1 µL多重寡核苷酸引物（index引物1至24）（见 材料表).
注意：每个样本的三个反应（低、中、高）需分别进行独立的PCR反应，但使用相同的带索引引物；每个原始感染样本使用不同的索引。- 在以下条件下运行PCR反应：94 °C变性2分钟，随后进行18个循环的三步PCR；94 °C变性15秒，55 °C退火15秒，68 °C延伸30秒。
- 作为质量控制选项，使用高灵敏度自动凝胶电泳系统分析PCR反应。取2 µL低、中、高分子量样品，按照制造商说明书进行电泳。
注意：两条引物应可见，通常在约45和95 nt的计算长度处出现条带（实际长度可能不同）。此外，应在150至500 nt范围内检测到DNA。若无信号，建议增加2至10个额外的PCR循环。对于在步骤3.3.2中制备的寡核苷酸对照样本，不得增加额外循环数。 - 使用基于磁性磁珠的PCR纯化系统去除引物。
- 取每份PCR反应的20 µL，将样品混合在一起（在此阶段混合所有样品）。将剩余的20 µL反应物作为备份在-20 °C冷冻保存。
- 让磁珠恢复至室温，然后加入1.8倍体积的磁珠溶液至混合的PCR反应产物中。用移液器混匀，室温孵育5分钟。
注意：例如，若准备了4个样本，每个样本均包含低、中、高三个反应，则PCR反应总体积为4 × 3 × 20 µL = 240 µL，磁珠溶液总体积为432 µL。 - 将离心管置于微型离心管磁力架上，静置约1分钟使磁珠充分结合，吸除上清液并弃去。保持离心管置于磁力架上，加入500 µL 80%乙醇。
- 乙醇中静置30秒，然后彻底去除，并让磁珠在空气中干燥约5分钟。加入40 µL无核酸酶的H2取下试管，离开磁铁，用移液器反复吹打数次。
- 静置悬浮液5分钟。将离心管重新置于磁力架上，待磁珠吸附至管壁后，将上清液转移至新离心管中。此即为文库。取10 µL用于质量控制，其余部分于-20 °C保存。
6. 评估文库
- 确定文库的质量、浓度和摩尔浓度。
- 采用荧光定量法。根据制造商说明书，使用高灵敏度双链DNA检测试剂盒分别测量1 µL和3 µL文库样品。
注意：典型浓度范围为 1 至 10 ng/µL。 - 采用高灵敏度自动凝胶电泳法测定文库DNA的分子量谱，具体步骤如上文所述（步骤5.2）。
- 使用自动化凝胶电泳分析确定文库的平均分子量，并据此计算将文库稀释至无核酸酶水中的浓度20 至 4 nM。只要所有索引均唯一，多个文库可合并。
- 采用荧光定量法。根据制造商说明书，使用高灵敏度双链DNA检测试剂盒分别测量1 µL和3 µL文库样品。
- 可选的低通量质量控制
- 将DNA文库进行TA克隆19 将文库分子插入载体以进行扩增。按照试剂盒说明书操作，培养约10–20个菌落并提取DNA 通过 小量制备方案，如文中所述20.
- 使用本地测序服务对载体进行测序，确认插入片段包含目标HIV-1来源序列及文库特异性接头。
7. 高通量测序运行
- 使用测序平台配套的商业软件创建测序样本表。
- 注明所选测序试剂盒。通常选择150个循环的试剂盒，但也可根据所需的读长选择其他型号。
- 选择 "仅 Fastq" 作为应用工作流程，选择一个包含多重寡核苷酸试剂盒中所含的24个指数（见试剂盒说明书）的模板。
- 选择 "25 nt" 用于 Read1 和 "125 nt" 用于Read2，保留6个核苷酸用于单索引读取。
注意：在内部分析中，仅使用Read2进行分析。为满足测序平台算法要求，Read1长度应至少保持为25 nt。
- 严格按照制造商的说明进行上机前文库制备和设置。选择最高20 pM的浓度，并添加15%的PhiX spike-in，因为该文库复杂度极低。
8. 数据分析
- 根据测序平台制造商的指南，检查通过过滤的百分比和平均 Q30 质量得分是否可接受。
注：通过过滤的比例通常 > 90%，Q30 得分通常 > 80%。 - 从制造商的测序平台下载 .fastq.gz 文件。
- 设置测序脚本
- 创建一个名为 "AnalysisXYZ" 的新目录（文件夹），并前往 https://github.com/malimlab/seqparse 下载所有源代码文件（parse_sam.pl、rc_extract.pl、parse.sh）到该目录中。
- 从 http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml 下载短读长比对工具 Bowtie 1.1.2 版本至同一目录。
- 下载后将在 "AnalysisXYZ" 目录下生成一个名为 "Bowtie-1.1.2" 的子目录。进入该目录中的 "Indexes" 子目录，并下载提供的模板序列，包括 6 个具有 .ebwt 扩展名的文件。
- 从 http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/download.html 下载 FASTQ/A 短读长预处理工具包 fastx-0.0.13 至 "AnalysisXYZ" 目录。
- 将 Samtools（https://sourceforge.net/projects/samtools/files/）和 bam-readcount（https://github.com/genome/bam-readcount）均下载至 "Documents" 目录。
- 将步骤 8.2 中下载的所有 read 2 文件（以 …_R2_001.fastq.gz 结尾）移动到 "AnalysisXYZ" 目录中。
- 打开命令行控制台/终端，使用 cd 命令将当前目录切换至 "AnalysisXYZ"，然后输入 "./parse.sh ." 以运行脚本。
- 在 "Analysis XYZ" 目录下的 parse_results 子目录中，查找包含各样本总读数、长度校正读数和标准化读数汇总的 .csv 文件，以及各样本的碱基变异文件。
注：有关分析过程的更多详细信息，请参见讨论部分。该脚本将返回 csv 文件，其中包含沿 HIV-1NL4.3 强终止序列及第一条链转移至第 635 位核苷酸处每个核苷酸的总读数。作为参考，在使用指定细胞数量和病毒接种量感染的样本中，若无抗病毒蛋白或化合物存在，通常可观察到 50,000 至 100,000 条唯一读段。寡核苷酸对照样本通常产生 100,000 至 200,000 条读段。
结果
本文所述技术已应用于一项更广泛的研究，旨在探讨抗逆转录病毒人源蛋白 APOBEC3G (A3G) 抑制 HIV-1 逆转录的机制6。图 3 展示了在感染了 vif 缺陷型 HIV-1 的 CEM-SS T 细胞样本中，应用该方案于存在或不存在 A3G 条件下获得的代表性结果。图 3a 绘制了每个样本在过滤掉所有具有相同 6 nt 条形码和相同长度的 PCR 重复序列（由提供的分析软件执行）后获得的总唯一读数。A3G 水平的增加降低了总读数，这反映了 A3G 对逆转录酶介导的 cDNA 合成的抑制作用，此前已通过 qPCR 进行描述和测量6,13,21,22。在图 3b 中，显示了前 182 个核苷酸内每个可能长度的分子比例。对于不存在 A3G 的 HIV-1 感染，最丰富的物种是主要的 180 核苷酸强终止分子本身，同时在较短长度范围（23 至 40 核苷酸）内也有部分读数积累（上图，蓝色直方图）。添加 A3G 改变了这一分布，检测到在少数几个非常特异且可重复的位置上，较短的截短 cDNA 分子急剧增加（中图和下图）。由于 A3G 是一种胞苷脱氨酶，当 A3G 存在于感染性病毒颗粒中时，cDNA 中会发生胞嘧啶向尿嘧啶（识别为 C 到 T）的突变21,23,24。利用获得的测序信息，将 C 到 T 突变的百分比绘制在同一图表上（红色虚线）。需要注意的是，突变谱图来源于所有唯一读数的合并，每个核苷酸的覆盖度会有所不同。然而，如果需要，可以将序列信息关联回每个分子，并与特定的 3' 末端相关联。所提供的数据取自 Pollpeter et al.6，并且已证明突变谱图与 cDNA 长度谱图之间的相关性是由于细胞 DNA 修复机制对脱氨基 cDNA 的检测和切割所致。
通过处理一组已知序列、长度和浓度的合成寡核苷酸混合物，可轻松制备3'-末端作图方法的阳性对照。该对照在步骤3.3.2的接头连接阶段加入，建议将其包含在所有多重文库中。来自对照样本的数据应显示所有寡核苷酸均处于预期的输入比例，且背景读数极低。图4展示了由17条化学合成的寡核苷酸组成的阳性对照结果（序列见表2），这些寡核苷酸以等摩尔比例混合。如预期所示，所有分子的丰度接近相等，仅有微小差异（上图）。在-sss DNA序列中大多数未被寡核苷酸覆盖的位置读数为零，但我们观察到少量比实际对照寡核苷酸短1或2个核苷酸的次要产物。我们尚未深入研究这些次要产物，但推测其可能代表购入的寡核苷酸储备液中存在的降解或不完全合成产物（寡核苷酸订购时为HPLC纯化级别，供应商标明纯度> 80%）。下图显示了另一轮文库测序中的对照样本结果，其中17条寡核苷酸之间的变异略大，并与整体长度相关，即较长的对照分子检测效率高于较短分子。这可能是由于PCR扩增或MiSeq测序过程中簇生成存在轻微偏好性所致，后者具有最佳插入片段大小范围，当文库插入片段长度分布较宽时可能更为明显。一种基本的校正方法是应用基于斜率的归一化因子，该斜率反映与分子长度相关的偏差趋势（粉红色线）。相关计算已包含在分析程序中（见实验方案第8.3步）。
图 1: HIV-1 逆转录起始步骤示意图。 该过程始于tRNA(Lys,3)（橙色）与病毒基因组RNA（gRNA）中的引物结合位点（PBS）退火（步骤1），从而启动并延伸病毒cDNA（蓝色，步骤2）。 与此同时，逆转录酶（RT）的RNaseH活性降解模板RNA（步骤3）。逆转录过程中的第一个完整中间产物是负链强终止（(-)sss）cDNA，当RT催化的聚合反应到达gRNA重复（R）区域的5'末端时，该中间产物即形成（步骤3）。(-)sss中间产物通过其互补序列与基因组RNA模板3'端的长末端重复序列（LTR）R区退火，转移至模板的3'末端，随后继续进行DNA聚合（步骤4）。在本方法中，通过测定新生病毒cDNA（蓝色）的精确长度来确定逆转录的进程。PPT，多聚嘌呤序列；U5，5'独特序列；U3，3'独特序列。本图转载自先前发表的研究6。 请点击此处查看本图的放大版本。
图2：接头连接与PCR扩增策略的工作流程概要及示意图。 (a) 用于确定感染细胞中HIV-1逆转录本3'-末端的所述技术的主要步骤流程图。该图改编自先前发表的文献6(b) 衔接子连接与PCR扩增策略示意图。在先前步骤中已纯化的、长度各异的新生cDNA分子，使用T4 DNA连接酶连接至一条单链DNA衔接子。该发夹形衔接子（命名为 "全基因组测序 + MiSeq"，参见 表1设计灵感来源于Kwok 等.11接头携带一个随机的6 nt条形码序列，可通过碱基配对促进连接反应，同时作为唯一读段的标识符。接头的3'末端带有Spacer（SpC3），以防止自连。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将连接产物与过量接头分离。将凝胶中的核酸染色后，在接头上方至加样孔区域等分为三个大小相同的凝胶片段切下，操作方式同前25洗脱、沉淀并重悬后，使用与接头已知序列互补的引物（引物1，多重寡核苷酸试剂盒，参见 材料清单以及一个携带tRNA后紧接的HIV-1 5'-LTR序列前22个核苷酸的引物（引物2，MP1.0 + 22HIV）。所选引物的5'端包含适用于所选测序平台的接头序列（P5和P7），以及用于区分同一文库中不同样本的索引序列。图中指示了测序读段引物的起始位置。蓝色框表示用于确定被捕获分子原始3'末端的目标区域。该图改编自先前发表的研究6. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 3：代表性结果。 (a) 使用所述方案处理的代表性样本的总读数计数。这包括所有被鉴定为 HIV-1 分子独特读数的序列，其 3' 末端位于负链 cDNA 的前 635 个核苷酸内（直至 PPT，参见图 1）。感染不携带 A3G 的 HIV-1 可获得最高的读数数量，而 A3G 会抑制 cDNA 合成，从而降低总读数计数。未感染的细胞作为阴性对照，而一组合成寡核苷酸则作为阳性对照。b) 蓝色直方图显示了 HIV-1NL4.3 序列（x 轴）第 23 至 182 个核苷酸位置之间（全长 -sss cDNA 为 180 至 182 个核苷酸）每种长度 cDNA 的相对丰度（比例尺位于左侧 y 轴）。cDNA 的相对丰度计算为在 -sss cDNA 序列特定核苷酸处终止的序列绝对数量除以所有长度小于或等于 182 个核苷酸的读数总和。红色虚线显示的是在相应位置携带 C 到 T/U 突变的读数百分比（比例尺位于右侧 y-轴）。图 3b 转载自先前发表的一篇文献6。请点击此处查看此图的更大版本。
图4：对照样品的代表性结果。 图中显示了两个包含等摩尔量的17种不同长度合成寡核苷酸混合物的分析谱图。这些寡核苷酸的序列来源于HIV-1NL4.3 ，设计时覆盖了多种长度，并确保3'-端核苷酸包含全部4种碱基（见表2）。上方图谱显示的是来自图3a的阳性对照样品结果，未检测到对分子长度或开放3'-末端的显著偏好性。下方图谱显示的是另一次文库测序运行的结果，该次运行在测序中产生了轻微的长度偏好性。在此情况下，建议应用一个归一化校正因子，该因子来源于代表片段大小偏倚的斜率（以粉红色标示）。本图改编自先前发表的研究6。请点击此处查看此图的高清版本。
| 引物名称 | 长度（nt） | 序列 | 用途 | 制造商（纯化方式） | ||||||||||||||
| full Kwok + MiSeq | 61 | 5’-PHO-tgaagagcctagtcgctgttcannnnnnctgcccatagagagatcggaagagcacacgtct-SpC3-3’ | 接头 | IDT DNA technologies (HPLC) | ||||||||||||||
| 2xBiotin SS bait | 40 | 5’-biotin-cagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggac-biotin-3’ | 杂交捕获 | MWG Eurofins (HPLC) | ||||||||||||||
| Biotin 1-16 ss | 22 | 5’-cagtgtggaaaatctctagcag-BiTEG-3’ | 杂交捕获 | MWG Eurofins (HPLC | ||||||||||||||
| Biotin tRNA + CTG | 16 | 5’-cagtggcgcccgaaca-BITEG-3’ | 杂交捕获 | MWG Eurofins (HPLC) | ||||||||||||||
| MP1.0 + 22HIV | 82 | 5’-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctcactgctagagattttccacactg-3’ | PCR 扩增 | MWG Eurofins (HPLC | ||||||||||||||
表1：本实验方案中使用的寡核苷酸，包括其长度、序列及修饰方式。该表格改编自先前发表的研究6。 请点击此处下载本表格的 Excel文件。
| 引物名称 | 长度（nt） | 序列 | 制造商（纯化方式） | |||||||||||||
| HTP con long C | 120 | 5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaagc-3’ | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
| HTP con long G | 119 | 5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaag-3’ | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
| HTP con long T | 116 | 5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggctt-3’ | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
| HTP con long A | 118 | 5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaa-3’ | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
| HTP con mid C | 76 | 5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcac-3’ | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
| HTP con mid G (a) | 71 | 5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacg-3’ | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
| HTP con mid G (b) | 72 | 5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgg-3’ | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
| HTP con mid A | 69 | 5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacaga-3’ | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
| HTP con mid T | 85 | 5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactt-3’ | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
| HTP con short A | 40 | 5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgaggga-3’ | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
| HTP con short T | 33 | 5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggt-3’ | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
| HTP con short G | 41 | 5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgaggg-3’ | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
| HTP con short C | 34 | 5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtc-3’ | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
| HTP Con 46 (T) | 46 | 5’-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctct-3’ | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
| HTP Con 83 (C) | 83 | 5’-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactac-3’ | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
| HTP Con 103 (C) | 103 | 5’-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagc-3’ | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
| HTP Con 107 (A) | 107 | 5’-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagcttta-3’ | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
表2：用作阳性对照样本的17种合成对照寡核苷酸列表。 前13种寡核苷酸根据其长度[长片段（116至120 nt）、中片段（69至85 nt）、短片段（33至41 nt）]及其3'-末端进行选择。本表改编自先前的出版物6。 请点击此处以下载该表格的 excel文件。
讨论
快速、可靠且经济高效的深度测序技术的广泛应用，已彻底改变了生命科学领域的诸多方面，使得基于测序的分析能够达到前所未有的深度。目前仍存在的挑战在于如何创新性地设计并构建具有代表性的测序文库。本文描述了一种用于捕获新生病毒cDNA分子（特别是HIV-1逆转录过程中间产物）的实验方案。
该策略中最关键的步骤是以定量且无偏倚的方式将接头连接至开放的3'-末端。针对两种单链DNA末端之间的连接效率，包括分子间和分子内连接，已针对多种应用进行了研究和优化11,26,27,28,29. 在步骤3.3所述条件下使用发夹接头与T4 DNA连接酶的选择是经验性优化的结果，我们在此过程中评估了不同的连接酶、接头和试剂，用于连接代表HIV-1序列的合成寡核苷酸（表 2）（数据未显示）。在这些 体外 测试反应，我们证实了T4 DNA连接酶介导的发夹接头连接，如Kwok所述 等.11，具有极低的偏差，在接头过量使用时可实现受体分子接近完全的连接。添加核苷酸序列以使接头适用于多重引物系统对接头连接效率无影响（见 图4）。相比之下，我们发现一种耐热的5' DNA/RNA连接酶（"连接酶A"，参见 材料表 与此处比较的精确连接酶相比），它是一种经过改造的RNA连接酶，部分开发目的是为了提高以单链DNA作为受体时的连接效率27，确实在连接两条单链DNA分子方面比RNA连接酶更有效"连接酶 B"）但存在显著偏差，即使在长度仅相差一个碱基的寡核苷酸之间，连接效率也表现出显著差异[表 2；HTP 含 mid G（a）和（b）]。此外，我们发现仅在含有 mid G 的反应中存在极小的偏好性 "连接酶 C" 结合带有随机化5'末端的接头（该策略用于抵消已知的核苷酸偏好性） "连接酶 C"；例如参见 Ding 等.30）。然而， "连接酶 C"介导的分子间连接不完全，因此T4 DNA连接酶系统成为更优的选择。
在整个实验流程中设置多个质量控制步骤，并包含阳性和阴性对照，可在继续进行检测前发现潜在问题，并为故障排查提供指导。步骤 2.2.2 和 2.3.12 中的 qPCR 定量可确保输入材料的量足够。典型的 cDNA 拷贝数在 200 µL 洗脱液（来自步骤 2.1）中每 µL 约为 10,000 至 300,000。杂交捕获步骤可能导致总体 HIV-1 cDNA 量有所损失，但应实现对特异性 HIV-1 cDNA 相对于细胞 DNA 的显著富集；可通过使用适当的引物在富集前后利用 qPCR 定量基因组 DNA，或通过测定总 DNA 浓度来评估富集效果。杂交捕获步骤后回收的 HIV-1 cDNA 应至少达到输入量的 10%。起始材料过少可能解释为何寡核苷酸阳性对照成功（见步骤 3.3.2），但样本中获得的有效测序读段数量有限。总体测序读段数偏低也可能由于存在不含 MiSeq 接头的无关 DNA 物种，导致文库浓度被高估。这将导致簇密度偏低，可通过除荧光定量法测定总 DNA 量外，再使用 qPCR 测定文库中 HIV-1 序列的浓度来改善。由于该方法具有高度敏感性，必须特别注意避免任何低水平污染，包括来自其他样本（特别是高浓度对照寡核苷酸储备液）以及实验室设备的污染。在此方面，在紫外灭菌的 PCR 工作站中操作具有优势。最终文库的自动化凝胶电泳（步骤 6.1.2）是另一项质量控制措施。通常观察到的核酸片段大小范围为 150 至 500 nt。在 PCR 后、纯化前的可选对照中可检测到的引物（见步骤 5.2 注释），此时应已不存在。在代表性结果中，样本强度曲线在 160 至 170 nt 处出现一个峰，在 320 至 350 nt 处出现第二个更尖锐的峰。这可能反映了两种常见高丰度逆转录产物：较短片段（插入长度为 1 至 20 nt）和全长强终止产物（插入长度为 180 至 182 nt）（图 3b）。
尽管本实验方案和所选引物专门针对早期HIV-1逆转录产物，但该方法总体上适用于任何旨在确定DNA开放3'末端的研究。在其他应用场景中，主要需调整的是杂交捕获方法和引物设计策略。例如，若目标改为晚期HIV-1转录本，则建议使用更多种类、沿cDNA全长分布的生物素化寡核苷酸进行捕获，这有望降低杂交捕获步骤中的产物损失。如引言中所述，在设计用于检测3'末端的区域范围时，必须考虑其局限性，以避免多种偏差来源。首先，若连接了接头的模板长度差异较大，PCR反应中可能出现偏差。其次，本研究所使用的测序平台（例如，MiSeq）对插入片段长度具有最佳范围要求，过短或过长的产物可能无法以相同效率被测序。部分问题可通过计算方法加以校正，例如通过计算线性长度偏差的校正因子（见图4，底部图示）。然而，若希望进行3'末端定位的目标区域较长（> 1000 nt），更合理的做法是将连接后的转录本分反应处理，并使用多个上游引物分段检测3'末端。
该分析程序为专门分析HIV-1序列末端紧邻固定接头序列的最后一个核苷酸以及所有碱基的碱基变异以识别任何突变而自行编写。具体步骤如下：首先，使用fastx-0.0.13工具包去除接头序列；然后，去除所有重复序列（即包含条形码在内的完全相同序列）。所有剩余的唯一序列读段随后使用Bowtie（http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml）比对至HIV-1序列，最大错配数设为三个碱基。模板序列为HIV-1 cDNA（NL4.3株）的前635个核苷酸（nt），包含-sss序列以及从第一链转移产物至多聚嘌呤 tract（U5-R-U3-PPT；见图1）的区域。因此，所提供的软件和模板仅在将该方法用于相同应用（检测HIV-1NL4.3的早期逆转录本）时可直接适用。若用于其他目标序列，则需进行相应调整。每条读段3'末端的位置由其在比对中的位置确定。记录每个位置的碱基判读结果，并根据每个碱基的总覆盖深度计算突变率；由于读段长度不同，且较长的插入片段可能无法被Read2的125个碱基测序完全覆盖，因此各碱基的覆盖深度存在差异。
总之，我们认为所描述的方法是适用于多种研究的有力工具。其显而易见的应用包括通过抗逆转录病毒药物或细胞限制因子来研究逆转录抑制机制。然而，只需进行相对较小的调整，即可将该系统应用于其他单链DNA病毒中间体的3'末端定位分析，例如细小病毒复制过程中存在的中间体。此外，该方法的原理——特别是其优化的连接步骤——可为任何3'端DNA延伸片段的表征提供文库构建设计的核心部分，包括由细胞内双链DNA聚合酶催化的延伸反应。
披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
作者感谢Malim实验室成员、Luis Apolonia、Jernej Ule和Rebecca Oakey提供的支持。作者感谢伦敦国王学院基因组中心的Matt Arno以及伦敦大学学院（UCL）神经学研究所下一代测序平台的Debbie Hughes在MiSeq测序运行方面提供的帮助。本研究得到了英国医学研究理事会（M.M.，项目编号G1000196和MR/M001199/1）、惠康信托基金（M.M.，项目编号106223/Z/14/Z）、欧洲委员会第七框架计划（FP7/2007-2013）资助协议编号PIIF-GA-2012-329679（D.P.）以及英国卫生部的资助。 通过 由英国国家卫生研究院研究综合生物医学研究中心授予盖伊医院与圣托马斯国民保健基金会信托，合作方为伦敦国王学院和国王学院医院国民保健基金会信托。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 293T 细胞 | ATCC | CRL-3216 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | 吉布科 | 31966-021 | |
| 青霉素/链霉素 | 吉布科 | 15150-122 | |
| 胎牛血清 | 吉布科 | 10270-106 | |
| HeraCell Vios 250i CO₂ 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | 51030966 | |
| 层流罩 - CAS BioMAT2 | Wolflabs | CAS001-C2R-1800 | |
| 10 mm 细胞培养处理培养皿 | 康宁 | 430167 | |
| TrypLE™ Express (1x)，稳定型胰蛋白酶替代酶 | 吉布科 | 12605-010 | |
| OptiMEM®（最低必需培养基） | 吉布科 | 31985-047 | |
| HIV-1 NL4-3 感染性分子克隆（pNL4-3） | 美国国立卫生研究院艾滋病试剂项目 | 114 | |
| 聚乙烯亚胺（PEI）- 分子量：25000 | PolySciences 公司 | 23966-2 | 溶解至 1 mg/mL 并调节 pH 至 7 |
| RQ1 RNase-free DNase | 普洛麦格 | M6101 | |
| 0.22 μm 滤器 | Triple Red 有限公司 | FPE404025 | |
| 15 mL 聚丙烯离心管 | 康宁 | CLS430791 | |
| 蔗糖 | Calbiochem | 573113 | |
| 磷酸盐缓冲液（1x） | 吉布科 | 14190-094 | |
| 超速离心管 | 贝克曼库尔特 | 344060 | |
| 超速离心机 | Sorval | WX Ultra 系列 | Th-641 转子 |
| Alliance HIV-1 p24 抗原 ELISA 试剂盒 | 珀金埃尔默 | NEK050001KT | |
| CEM-SS 细胞 | 美国国立卫生研究院艾滋病试剂项目 | 776 | |
| 罗斯韦尔帕克纪念研究所培养基 | 吉布科 | 31870-025 | |
| CoStar® 细胞培养处理多孔板 | 康宁 | CLS3513-50EA | |
| 台式离心机：Heraus™ Multifuge™ X3 FR | 赛默飞世尔科技 | 75004536 | |
| TX-1000 摆动桶转子 | 赛默飞世尔科技 | 75003017 | |
| 微量离心机：5424R | 艾本德 | 5404000060 | |
| 总 DNA 提取试剂盒（DNeasy 血液与组织试剂盒） | 凯杰 | 69504 | |
| 无核酸酶 H₂O | 安比昂 | AM9937 | |
| Cutsmart 缓冲液 | 新英格兰生物实验室（DpnI 酶配套组分） | R0176S | |
| DpnI 限制性内切酶 | 新英格兰生物实验室 | R0176S | |
| qPCR 引物寡核苷酸 | MWG Eurofins | N/A | HPSF 纯化 |
| TaqMan PCR 通用预混液 | 赛默飞 | 4304437 | |
| LoBind Eppendorf® 管 | 艾本德 | 30108078 | |
| Axygen™ 气溶胶过滤吸头，1000 μL | 费希尔科技 | TF-000-R-S | |
| Axygen™ 气溶胶过滤吸头，200 μL | 费希尔科技 | TF-200-R-S | |
| Axygen™ 气溶胶过滤吸头，20 μL | 费希尔科技 | TF-20-R-S | |
| Axygen™ 气溶胶过滤吸头，10 μL | 费希尔科技 | TF-10-R-S | |
| PCR 清洁工作台 | LabCaire | 型号 PCR-62 | |
| DynaMag™2 磁力架 | 赛默飞 | 12321D | |
| 链霉亲和素磁性微球（Streptavidin MagneSphere®） | 普洛麦格 | Z5481 | |
| 酪蛋白 | 赛默飞世尔科技 | 37582 | |
| 滚轴混合仪，Revolver™ 360° | Labnet | H5600 | |
| Tris-Base | 费希尔科技 | BP152-5 | |
| 盐酸 | 西格玛 | H1758-100ML | |
| EDTA 二钠盐二水合物 | Electran（VWR） | 443885J | |
| 氯化钠 | 西格玛 | S3014 | |
| Dri-Block® 模拟加热块 | Techne | UY-36620-13 | |
| PCR 管及拱形盖 | 赛默飞世尔科技 | AB0266 | |
| PCR 仪 | 艾本德 | Mastercycler® 系列 | |
| T4 DNA 连接酶 | 新英格兰生物实验室 | M0202M | |
| 40% 聚乙二醇溶液（PEG）溶于 H₂O，分子量：8000 | 西格玛 | P1458-25ML | |
| 甜菜碱溶液，5 M | 西格玛 | B0300-1VL | |
| 上样缓冲液 II（含甲酰胺缓冲液） | 赛默飞世尔科技 | AM8546G | |
| 预制 6% TBE 尿素凝胶 | 英潍捷基 | EC6865BOX | |
| Mini 细胞电泳系统 | 英潍捷基，Novex | XCell SureLock™ | |
| Tris/硼酸/EDTA 溶液（10x） | 费希尔科技 | 10031223 | |
| 21 G × 1 1/2 针头 | VWR | 613-2022 | |
| SYBR Gold 核酸染料（10000x） | 生命科技 | S11494 | |
| Dark Reader DR46B 凝胶成像仪 | 费希尔科技 | NC9800797 | |
| 乙酸铵 | 默克 | 101116 | |
| SDS 溶液 20%（w/v） | 伯乐 | 161-0418 | |
| 离心管滤器 | Appleton Woods | BC591 | |
| 玻璃纤维滤膜 GF/D，10 mm | Whatman（VWR） | 512-0427 | |
| 多聚腺苷酸（polyA）RNA | 西格玛 | 10108626001 | |
| 糖原，分子生物学级 | 赛默飞世尔科技 | R0561 | |
| 异丙醇（2-丙醇） | 费希尔科技 | 15809665 | |
| 乙醇，分子生物学级 | 费希尔科技 | 10041814 | |
| Accuprime™ Supermix I（DNA 聚合酶预混液） | 生命科技 | 12342-010 | |
| NEBNext® Illumina 多重引物（Index Primer Set 1 和 2） | 新英格兰生物实验室 | E7335S；E7500S | |
| Tapestation D1000 Screentape 高灵敏度 | 安捷伦科技 | 5067-5584 | |
| Tapestation D1000 试剂 | 安捷伦科技 | 5067-5585 | |
| 2200 Tapestation — 自动化凝胶电泳系统 | 安捷伦科技 | G2965AA | |
| Agencourt® AMPure® XP 磁珠 | 贝克曼库尔特 | A63880 | |
| Qubit™ dsDNA HS 检测试剂盒 | 英潍捷基 | Q32851 | |
| Qubit™ 2.0 荧光计 | 英潍捷基 | Q32866 | |
| Topo™ TA 克隆试剂盒 | 英潍捷基 | 450071 | |
| 测序平台：MiSeq 系统 | 因美纳 | ||
| 实验管理器（样本表软件） | 因美纳 | 注：使用 TruSeq LT 作为模板 | |
| Miseq™ 试剂盒 V3（150 个循环） | 因美纳 | MS-102-3001 | |
| 测序中心：BaseSpace | 因美纳 | https://basespace.illumina.com | |
| 连接酶 A：耐热 5’ App DNA/RNA 连接酶 | NEB | M0319S | 本实验方案未使用，但在优化过程中进行了测试，结果在讨论部分中描述。 |
| 连接酶 B：T4 RNA 连接酶 1 | NEB | M0204 | 本实验方案未使用，但在优化过程中进行了测试，结果在讨论部分中描述。 |
| 连接酶 C：CircLigase | Epicentre | CL4111K | 本实验方案未使用，但在优化过程中进行了测试，结果在讨论部分中描述。 |
参考文献
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