Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Stromazellen vaskulären Bruchteil aus Fettgewebe durch eine Reihe von mechanischen Verfahren erhalten die Emulgierung und mehrere Centrifugations enthalten.
Abstract
Stromale vaskulären Bruch (SVF) ist eine regenerative Werkzeug für verschiedene Krankheiten geworden; Allerdings regelt die Gesetzgebung streng die klinische Anwendung der Zelle Produkte mit Kollagenase. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine injizierbare Mischung aus SVF Zellen und native extrazelluläre Matrix aus Fettgewebe durch ein rein mechanisches Verfahren zu generieren. Lipoaspirate werden in einer Zentrifuge und bei 1.200 X g für 3 min gesponnen. Die mittlere Schicht ist gesammelt und getrennt in zwei Schichten (High-Density Fett unten) und Low-Density Fett auf der Oberseite. Die obere Schicht wird direkt durch das intersyringe verschieben, mit einer Rate von 20 mL/s für 6 X bis 8 X emulgiert. Das emulgierte Fett wird bei 2.000 X g für 3 min zentrifugiert, und die klebrige Substanz unter die Ölschicht gesammelt und definiert als die extrazelluläre Matrix (ECM) / SVF-Gel. Das Öl auf die oberste Schicht wird gesammelt. Ca. 5 mL Öl 15 mL von High-Density Fett hinzugefügt und emulgiert durch intersyringe verschieben, mit einer Rate von 20 mL/s für 6 X bis 8 X. Das emulgierte Fett wird bei 2.000 X g für 3 min zentrifugiert, und die klebrige Substanz ist auch ECM/SVF-Gel. Nach der Transplantation des ECM/SVF-Gels in nude Mäuse ist das Transplantat geerntet und von histologischen Untersuchung bewertet. Das Ergebnis zeigt, dass dieses Produkt das Potenzial hat, in normalen Fettgewebe zu regenerieren. Dieses Verfahren ist eine einfache, effektive mechanische Dissoziation Verfahren die SVF-Zellen eingebettet in ihre natürliche unterstützende ECM für regenerative Zwecke zu kondensieren.
Introduction
Stammzelltherapien bieten einen Paradigmenwechsel für Gewebereparatur und Regeneration, so dass sie eine alternative therapeutische Regime für verschiedene Krankheiten1anbieten können. Stammzellen (z.B., induzierte pluripotente Stammzellen und embryonale Stammzellen) haben ein großes therapeutisches Potenzial sind aber beschränkt durch Zellregulation und ethische Erwägungen. Adipose abgeleitet mesenchymaler Stromazellen/Stammzellen (ASC) sind leicht zu beschaffen von Lipoaspirate und nicht den gleichen Beschränkungen; so ist es eine ideale Zelltyp für praktische regenerative Medizin2geworden. Darüber hinaus sie sind nonimmunogenic und haben reichlich vorhandenen Ressourcen aus körpereigenem Fett3.
ASC sind derzeit vor allem durch Kollagenase-vermittelten Verdauung des Fettgewebes gewonnen. Die stromale vaskuläre Bruchteil (SVF) von Fettgewebe enthält ASCs, endothelial Progenitor Cell, Perizyten und Immunzellen. Zwar erhalten eine hohe Dichte an SVF/ASC enzymatisch gezeigt wurde, um positive Auswirkungen haben, regelt die Gesetzgebung in verschiedenen Ländern streng die klinische Anwendung der Zell-basierte Produkte, die mit Hilfe von Kollagenase4. Verdauen das Fettgewebe mit Kollagenase für 30 min bis 1 h, SVF Zellen zu erhalten, erhöht das Risiko für beide exogene Material bei der Vorbereitung und biologische Kontamination. Die anhaftende Kultur und die Reinigung des ASC, die Tage bis Wochen dauert, erfordern spezielle Laborgeräte. Darüber hinaus werden in den meisten Studien SVF Zellen und ASC in der Schwebe verwendet. Ohne den Schutz der extrazellulären Matrix (ECM) oder einen anderen Träger freie Zellen sind anfällig, verursachen eine schlechte Zelle Aufbewahrung nach der Injektion und gefährden das therapeutische Ergebnis5. All diese Gründe beschränken die weitere Anwendung der Stammzell-Therapie.
Um ASC aus Fettgewebe ohne Kollagenase-vermittelten Verdauung zu erhalten, wurden verschiedene mechanische Bearbeitung-Verfahren, einschließlich der Zentrifugation, mechanische, hacken, Zerkleinern, pürieren und Zerkleinern, entwickelten6,7 , 8 , 9. diese Methoden werden gedacht, um Gewebe und ASC kondensieren von mechanisch stören Reifen Adipozyten und ihre Öl-haltige Vesikel. Darüber hinaus zeigten diese Zubereitungen, die hohe Konzentrationen von ASC, therapeutische Potenzial als regenerativer Medizin in Tier8,9,10Modelle.
Im Jahr 2013 eingeführt Tonnard Et Al. der Nanofat Technik, die beinhaltet, Herstellung von emulgierten Lipoaspirate durch Intersyringe Verarbeitung11Pfropfen. Erstellt von Intersyringe, die Verlagerung Querkräfte kann selektiv Reifen Adipozyten brechen. Auf der Grundlage ihrer Erkenntnisse entwickelten wir eine rein mechanische Bearbeitung-Methode, die entfernt die meisten Lipid und Flüssigkeit in den Lipoaspirate verlassen nur SVF Zellen und fraktionierte ECM, die ECM/SVF-Gel12ist. Hier beschreiben wir die Details des mechanischen Prozesses der menschlichen abgeleitet Fettgewebe, das ECM/SVF-Gel zu produzieren.
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Protocol
Diese Forschung wurde von der ethischen Review Board im Nanfang Krankenhaus, Guangzhou, China genehmigt. Fettgewebe wurde gesammelt, von gesunden Spendern, gab schriftliche Einwilligung zur Teilnahme an der Studie. Alle Tierversuche wurden durch die Nanfang Krankenhaus institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt und durchgeführt nach den Richtlinien des National Health and Medical Research Council (China).
1. ECM/SVF-Gel-Vorbereitung
- Ernten Sie Fett.
- Führen Sie Fettabsaugung auf einen Menschen mit einer 3 mm multiport-Kanüle, enthält mehrere scharfen seitlichen Löcher von 1 mm im Durchmesser, am-0.75 atm der Saugdruck.
- 200 mL Lipoaspirate in einem sterilen Beutel zu sammeln.
- Bereiten Sie Coleman Fett.
- Die Lipoaspirate in vier 50 mL Röhrchen und die geerntete Fett für 10 min stillzustehen.
- Sammeln Sie das Fett auf die oberste Schicht in zwei 50 mL Röhrchen mithilfe einer Wide-Tip-Pipette übertragen, und entsorgen Sie den flüssigen Teil auf der unteren Ebene.
- Mit 50 mL Röhrchen, entmischen der Fettschicht am 1.200 X g bei Raumtemperatur (RT) für 3 min.
- Definieren Sie die obere Schicht (ca. 80 mL) als Coleman Fett.
- Übertragen Sie die oberen 2/3 des Fettes Coleman auf eine 20 mL-Tube mithilfe einer Pipette Wide-Tip, und definieren Sie diesen Teil als Low-Density Fett.
- Übertragen Sie der unteren 1/3 des Fettes Coleman, ein weiteres 20 mL-Tube mit Hilfe einer Pipette Wide-Tip und definieren Sie diesen Teil als High-Density-Fett.
- ECM/SVF-Gel von geringer Dichte Fett zu produzieren.
- Verwenden zwei 20 mL Spritzen, 20 mL von geringer Dichte Fett intershift durch eine Buchse auf Buchse Luer-Lock-Anschluss (mit einem Innendurchmesser von 2,4 mm) verbunden.
- Halten Sie die Schaltgeschwindigkeit stabil zu (bei 20 mL/s) und für 6 X bis 8 X wiederholen.
- Die Mischung bei 2.000 X g bei RT 3 min entmischen.
- Sammeln Sie den Öl-Anteil auf der Oberseite in ein 10 mL-Tube mithilfe einer Pipette Wide-Tip bei RT für die weitere Verwendung.
- Sammeln Sie die klebrige Substanz in der mittleren Schicht, die ECM/SVF-Gel (Abb. 1A), ist durch die Verwendung einer Wide-Tip-Pipette, und entsorgen Sie die Flüssigkeit auf der unteren Ebene.
- ECM/SVF-Gel aus High-Density-Fett zu produzieren.
- 15 mL von High-Density Fett fügen Sie 5 mL Öl (gesammelt von Schritt 1.3.4 hinzu).
- Intershift gemischte Fett zwischen Spritzen 6 X bis 8 X bis ein Kraftstofffilter innerhalb der Emulsion beobachtet wird.
- Die Mischung bei 2.000 X g bei RT 3 min entmischen.
- Verwerfen Sie den Öl-Teil auf der Oberseite.
- Sammeln Sie die klebrige Substanz in der mittleren Schicht (ECM/SVF-Gel) mithilfe einer Pipette Wide-Tip und entsorgen Sie die Flüssigkeit auf der unteren Ebene.
- Mischen Sie das ECM/SVF-Gel von Schritten 1.3.5 und 1.4.5.
2. Akt Mausmodell ECM/SVF-Gel Graft
- Die nackte Mäuse zu betäuben (8 Wochen alt, weiblich) mit Isofluran (1-3 %) Inhalation Anästhesie in ein Tier OP-Saal.
- Übertragen Sie das ECM/SVF-Gel auf eine 1 mL Spritze.
- Verbinden Sie 1 mL Spritze mit einer stumpfen Infiltration Kanüle.
- Stecken Sie die Kanüle subkutan in jeder Flanke der Maus.
- 0,3 mL des ECM/SVF-Gels zu injizieren.
(3) Gewebe Ernte auf 3, 15 und 90 Tage nach der ECM/SVF-Gel-Injektion
- Die Mäuse mit Isofluran (1-3 %) zu betäuben Inhalation-Anästhesie.
- Die Mäuse durch zervikale Dislokation Methode zu opfern.
- Machen Sie einen Schnitt an der Mittellinie von der Maus Rückenhaut mit Chirurgische Scheren.
- Sezieren Sie und ernten Sie die Fett Transplantate auf beiden Seiten der Maus. Betten Sie die Fett Transplantate in 4 % Paraformaldehyd bei RT über Nacht.
- Austrocknen des Gewebes in steigenden Konzentrationen von Ethanol: 70 % Ethanol, zwei Änderungen, 1 h; 80 % Ethanol, eine Änderung, 1 h; 95 % Ethanol, eine Änderung, 1 h; 100 % Ethanol, drei Änderungen, 1,5 h; Xylol, drei Änderungen, 1,5 h.
- Infiltrieren Sie das Gewebe mit Paraffinwachs (58-60 ° C), zwei Änderungen, 2 h.
- Einbetten des Gewebes in Paraffin-Blöcke. Schneiden Abschnitte bei einer Dicke von ca. 4 µm und legte sie auf den Folien.
4. Hämatoxylin und Eosin Färbung
- Deparaffinize Paraffin Block Folien durch Einweichen in Xylol, I, II und III (10 min).
- Rehydrieren Sie die Gewebeschnitte, indem man sie durch abnehmende Konzentrationen (100 %, 100 %, 95 %, 80 %, 70 %) der Ethanol-Bäder für 3 min.
- Spülen Sie die Gewebeschnitte in destilliertem Wasser (5 min).
- Führen Sie die Gewebeschnitte in Hämatoxylin für 5 min zu Flecken.
- Spülen Sie die Gewebeschnitte in fließendem Leitungswasser für 20 min. Decolorize in saurem Alkohol von 1 % (1 % HCl in 70 % Alkohol) für 5 S. Spülen unter fließendem Leitungswasser bis in den Abschnitten wieder blau angezeigt werden.
- Fügen Sie zwei bis drei Tropfen Farbstoff Eosin Y direkt auf den Folien mit Pipette, und lassen Sie den Farbstoff für 10 min eingestellt.
- Waschen Sie die Folien in Leitungswasser für 1-5 min.
- Pausiert die Folien in steigenden Konzentrationen (70 %, 80 %, 95 %, 100 %, 100 %) von Ethanol für 3 min.
- Deaktivieren Sie den Folien in Xylol I und II für 5 min.
- Montieren Sie die Folien in der Montage von Medien.
5. immunofluorescent Färbung
- Deparaffinize Sie die Gewebeschnitte in Xylol, I, II und III (5 min).
- Rehydrieren Sie die Gewebeschnitte, indem man sie durch verschiedene Konzentrationen (100 %, 100 %, 95 %, 95 %, 70 %) der Alkohol-Bäder für 3 min.
- Inkubieren Sie die Abschnitte in einer 3 % H2O2 Lösung in Methanol bei RT für 10 min.
- Spülen Sie die Folien 2 X mit destilliertem Wasser, 5 min.
- Legen Sie die Folien in einem Dia-Korb. 300 mL 10 mM Citrat-Puffer (pH 6.0) zugeben und die Folien bei 95-100 ° C für 10 min inkubieren.
- Kühlen Sie die Folien in RT für 20 min.
- Spülen Sie die Folien 2 X mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 5 min.
- 100 µL der fötalen Rinderserum 10 % auf den Folien hinzufügen und in eine feuchte Kammer bei RT für 1 h inkubieren.
- Über Nacht inkubieren Sie in den Abschnitten mit Primärantikörper Lösung (Meerschweinchen Anti-Maus Perilipin, 1: 400) bei 4 ° C.
- Spülen Sie die Folien mit PBS 3 X, 5 min.
- Inkubieren Sie die Abschnitte mit Sekundärantikörper Lösung (Ziege Anti-Guinea Pig-488-IgG) für 2 h bei RT
- Spülen Sie die Folien mit PBS 3 X, 5 min.
- Das Wasser rund um den Bereich mit sauberen Papiertuch abwischen.
- Drop-4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) und Alexa Fluor 488 konjugiert Isolectin in den Kreis den Abschnitt auf der Folie abdecken.
- Montieren Sie die Deckgläsern und im Dunkeln trocknen lassen.
- Beobachten Sie die Folien mit einem Fluoreszenz-Mikroskop.
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Representative Results
Nach der Verarbeitung der Coleman Fett zu ECM/SVF-Gel, das Volumen der ausrangierten Öl nimmt 80 % des letzten Bandes, und nur 20 % des Fettgewebes unter die Ölschicht erhalten gilt als ECM/SVF-Gel (Abb. 1A). ECM/SVF-Gel hat eine glatte Flüssigkeit-wie Struktur, die es ermöglicht, durch eine feine Nadel 27 G gehen; jedoch Coleman Fett besteht aus einer integralen adipösen Aufbau mit großen Fasern und kann nur durch eine 18 G-Kanüle (Abbildung 1B) gehen.
Am 3. Tag nach der Transplantation erschienen zahlreiche kleine Präadipozyten mit mehreren intrazellulären Lipid Tröpfchen, umfangreiche gut vaskularisierte Bindegewebe und infiltrierten Entzündungszellen. Ab dem 15. Tag, die Anzahl der entzündlichen Zellen begannen, schrittweise reduziert werden, und Adipozyten zu Reifen. Tagsüber 90 waren die meisten vaskularisierte Bindegewebe in die Transplantate von Reifen Adipozyten (Abbildung 2, obere Leiste) ersetzt worden.
ECM/SVF-Gel Transplantate enthielt ein paar Perilipin-Positive Adipozyten, 3 Tage nach der Transplantation. Kleine Präadipozyten mit mehreren intrazellulären Lipid Tröpfchen begann am 15. Tag erscheinen. Jedes Feld des ECM/SVF-Gels graft Abschnitte am Tag 90 zeigte zahlreiche Perilipin-Positive Adipozyten und neu gebildete Blutgefäße (Abbildung 2, unten).
Abbildung 1 : Bilder von der ECM/SVF-Gel. Zentrifugiert Coleman Fett und ECM/SVF-Gel nach der Verarbeitung (A). ECM/SVF-Gel kann leicht durch eine 27 G Nadel injiziert werden; Coleman Fett kann jedoch nur durch eine Kanüle 18 G (B) übergeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Histologische Veränderung der ECM/SVF-Gel nach der Transplantation. ECM/SVF-Gel zeigten umfangreiche gut vaskularisierte Bindegewebe und Infiltration von Entzündungszellen an Tag 3. Anschließend wurde der Großteil der vaskularisierte Bindegewebe durch eine Struktur mit Reifen Adipozyten (obere Abdeckung) ersetzt. Immunofluorescent Färbung zeigt, dass die meisten des Gewebes besteht aus Perilipin-negativen Bereich am 3. Tag. Tag 15 erschien eine große Portion Perilipin + Adipozyten. Zahlreiche Perilipin-Positive Adipozyten fanden sich nach 90 Tagen (untere Leiste). Der Maßstabsbalken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Stammzellbasierte regenerative Therapie hat einen großen potenziellen Nutzen bei verschiedenen Krankheiten gezeigt. ASC sind hervorragende therapeutische Kandidaten, denn sie einfach sind zu erhalten und haben die Kapazität für die Reparatur von Gewebe und die Regeneration der neuartige Gewebe15. Allerdings gibt es Einschränkungen für den Ausbau ihrer klinischen Anwendung, da es komplizierte Verfahren zum Isolieren von Zellen und Kollagenase erfordert für die Verarbeitung von6. Daher ist es wichtig, eine einfache Technik, um Stammzellen ohne den Einsatz von Kollagenase zu entwickeln.
In dieser Studie präsentierten wir einen rein mechanischen Vorgang des Fettgewebes SVF Zellen erhalten, die durch die native adipösen ECM geschützt sind. Darüber hinaus ist dieser Prozess Kollagenase-frei. Eine frühere Studie im Vergleich verschiedener Intersyringe Bearbeitungszeiten und zeigte, dass die intersyringe Verarbeitung von standard Coleman Fett für 1 min bei einer Flussrate von 10 mL/s das optimale Protokoll zur Herstellung von ECM/SVF-Gel12 ist. Durch die Verwendung intersyringe verlagert, werden die meisten Fettzellen in den Lipoaspirate mit den meisten der SVF Zellen und ECM bewahrt zerstört. Somit ist Intersyringe Verlagerung der wichtigste Schritt des gesamten Prozesses. Der intersyringe Schaltgeschwindigkeit und der Zeitaufwand für die Durchführung der Verschiebung bestimmen die Zerstörung des Fettgewebes da sheering Kraft, die durch den intersyringe Prozess erstellt der Schaltgeschwindigkeit zugeordnet ist. Wir empfehlen, dass die Schaltgeschwindigkeit sollte stabil bei 20 mL/s. unzureichende Vernichtung führt zu verbleibenden unerwünschten Fettzellen, während Overdestruction führt zu Beschädigung der SVF-Zellen. Das Produkt dieses Protokolls kann definiert werden als ECM/SVF-Gel nur dann, wenn es folgenden Kriterien erreicht: 1) seine letzte Band ist ~ 20 % des ursprünglichen Volumens; (2) Es ist leicht durch eine 27 G Nadel injiziert. Eine frühere Studie zeigte, dass das ECM/SVF-Gel hohe Dichten der beiden CD45 enthält-/ CD31- / CD34 + ASC und die SVF-Zelldichte ist > 4.0 x 105 Zellen/mL12.
Während des Prozesses der Erstellung ECM/SVF-Gel war Zentrifugation durchgeführt 2 x vor und nach intersyringe verlagert. Vor der Intersyringe verschieben verwenden wir Zentrifugation erstellen "benotet dichten" von Fett. Dies ist ein weiterer wichtiger Schritt. Es ist erwiesen, dass die High-Density Fettschicht an der Unterseite, nach der Zentrifugierung, reich an verkürzten ECM hat aber weniger Öl, während die Low-Density Fettschicht auf der Oberseite mehr Öl hat aber weniger ECM Faser16,17. Daher sollten diese beiden Ebenen auf zwei verschiedene Arten verarbeitet werden. Low-Density Fett kann direkt die intersyringe verarbeitet um die Fettzellen zu zerstören werden. Das High-Density-Fett auf der unteren Ebene erfordert jedoch zusätzliche Öl um die Zerstörung der Fettzellen zu erleichtern. Das zusätzliche Öl kann die Dichte des High-Density-Fett, machen die Verlagerung viel einfacher verringern. Darüber hinaus hilft das Öl mehr Öl aus der defekten Fettzellen zu extrahieren; jedoch nicht wässrige Flüssigkeit. So haben wir extra Öl zum High-Density-Fett. Die Zentrifugation nach der Intersyringe Verschiebung ist, den Öl-Anteil vom SVF Zellen und ECM zu trennen. Öl sollte in das Endprodukt vermieden werden.
Die Transplantation von ECM/SVF-Gel führte eine große Abscheiderate. Wie wir bereits, der entscheidende Schritt der Verarbeitung von ECM/SVF-Gel erwähnt ist intersyringe verlagert, die meisten von den Fettzellen zerstört. Somit blieb wenig Adipozyten im ECM/SVF-Gel. Wie in Abbildung 2dargestellt, erschien ein kleiner Perilipin-positiven Bereich der transplantierten ECM/SVF-Gel am 3. Tag. Jedoch nach 15 Tagen, viele Perilipin-Positive Adipozyten erschien und wurde nach 90 Tagen Reifen. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass die Transplantation von ECM/SVF-Gel Host zellvermittelte Fettgewebe Regeneration14induziert. Mit Anti-Human Leukocyte Antigen, um den Ursprung der neugeformten Adipozyten zu identifizieren, entdeckten wir, dass, obwohl die meisten Zellen in der SVF Transplantat abgeleitet wurden, ein Großteil der neu gegründeten Fettgewebe Host abgeleitet. ECM/SVF-Gel hat eine große regenerative Funktion, wie wir bereits berichtet. Dieses Produkt hatte große therapeutische Wirkung in12der Wundheilung. Darüber hinaus half es Verbesserung der Überlebensrate von freier Lappen in einem Mausmodell durch Beschleunigung der Angiogenese10.
SVF-Gel ist eine autologe injizierbare, native ECM und funktionale zellulären Komponenten enthält. Das Produkt wird aus Lipoaspirate durch ein einfaches mechanisches Verfahren erzeugt, ohne irgendwelche Bedenken hinsichtlich regulatorischer Fragen leicht durchgeführt werden können. Die regenerative Wirkung von ECM/SVF-Gel bleibt jedoch unklar. Um die wohltuende Wirkung von ECM/SVF-Gel besser zu charakterisieren, sind weitere Untersuchungen zur Charakterisierung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen die regenerative Wirkung von ECM/SVF-Gel auf dem Weg.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Nationalfonds Natur aus China (81471881, 81601702, 81671931), die naturwissenschaftlichen Grundlage der Provinz Guangdong (2014A030310155) und das Administrator-Stiftung der Nanfang Hospital (2014B009, 2015Z002, 2016Z010, 2016B001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4 | Molecular Probes | I21411 | |
| guinea pig anti-mouse perilipin | Progen | GP29 | |
| DAPI | Thermofisher | D1306 | |
| wide tip pipet | Celltreat | 229211B | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP2 | |
| nude nice | Southern Mdical University | / | |
| light microscope | Olympus | / | |
| 50 mL tube | Cornig | 430828 | |
| sterile bag | Laishi | / | |
| microtome | Leica | CM1900 | |
| centrifuge | Heraus |
References
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