Summary
L'obiettivo del presente protocollo è la produzione delle fibre di intera tabella extracellulare mirati per la riparazione della ferita che sono adatti per la valutazione preclinica come parte di un impianto di impalcatura rigenerativa. Queste fibre sono prodotte dalla cultura dei fibroblasti su membrane a fibra cava ed estratte dalla dissoluzione delle membrane.
Abstract
Scaffold ingegnerizzati derivato dalla matrice extracellulare (ECM) hanno guidato significativo interesse in medicina per il loro potenziale nel velocizzare ferita la chiusura e la guarigione. Estrazione della matrice extracellulare da fibrogenica cell culture in vitro ha il potenziale per la generazione di ECM da linee cellulari umane - e potenzialmente paziente-specifici, riducendo al minimo la presenza di epitopi xenogeniche che ha ostacolato la clinica successo di alcuni prodotti ECM esistenti. Una sfida significativa nella produzione in vitro di ECM adatto per l'impianto è che la produzione di ECM mediante coltura cellulare è in genere di rendimento relativamente basso. In questo lavoro vengono descritti i protocolli per la produzione di ECM dalle cellule coltivate all'interno di impalcature di membrana a fibra cava sacrificale. Membrane a fibra cava sono coltivate con linee cellulari di fibroblasti in un mezzo di cella convenzionale e dissolto dopo coltura cellulare per produrre fili continui di ECM. Le fibre risultanti ECM prodotte da questo metodo possono essere decellularized e liofilizzate, rendendolo adatto per lo stoccaggio e l'impianto.
Introduction
Ponteggi chirurgici impiantabili sono un appuntamento fisso della riparazione della ferita, con oltre 1 milione polimero sintetico mesh impiantata in tutto il mondo ogni anno per la riparazione della parete addominale da solo1. Tuttavia, a seguito dell'impianto i polimeri sintetici materiali tradizionalmente utilizzati nella fabbricazione di queste impalcature tendono a provocare una reazione da corpo estraneo, con conseguente infiammazione deleterio per la funzione dell'impianto e cicatrizzazione del tessuto2 . Inoltre, come i materiali predominanti mesh sintetico (cioè, polipropilene) non sono sensibilmente ristrutturati dal corpo, essi sono generalmente applicabile ai tessuti dove può essere tollerata la cicatrizzazione, limitando la loro utilità clinica verso il trattamento di tessuti con funzione di ordine superiore quale il muscolo. Mentre ci sono molti prodotti di maglia chirurgica che sono stati applicati con successo clinico, produttore risale ricorda sintetica chirurgico maglie e complicazioni dagli innesti di tessuto interspecie evidenziano l'importanza di ottimizzazione dell'impianto biocompatibilità, spingendo la FDA per stringere i regolamenti sulla chirurgica maglia produttore3,4. L'impianto di scaffold derivate dai tessuti dei pazienti riduce la risposta immunitaria, ma può provocare significative del donatore-luogo morbosità5. Matrice extracellulare (ECM) impalcature prodotte in vitro sono una possibile alternativa, come decellularizzati ECM ponteggi esibiscono eccellente biocompatibilità, particolarmente nel caso di trapianto autologo ECM impianti6.
A causa della limitata disponibilità di tessuto del paziente per la raccolta per l'impianto autologo ed il rischio di ostacolare la funzione al luogo erogatore, la capacità di produrre ECM ponteggi in vitro dalla coltura di linee cellulari umane o, se possibile, di un paziente possedere le cellule è un'alternativa attraente. Le sfide principali nella produzione di notevoli quantità di ECM in vitro è il sequestro di queste molecole di difficile acquisizione. Nel precedente lavoro, abbiamo dimostrato che ECM può essere prodotta coltivando fibroblasti ECM-secernente in schiume polimeriche sacrificale che sono dissolti dopo il periodo di coltura di ECM di rendimento che può essere decellularized per l'impianto7, 8,9,10. Come ECM prodotta schiume tendono ad adottare l'architettura interna delle schiume, membrane a fibra cava (HFMs) sono state esplorate come impalcatura sacrificale per la produzione di fili di ECM. Descritto nel presente documento sono metodi compiti per laboratorio scala produzione di membrane a fibra cava qualità cultura delle cellule e l'estrazione delle fibre della matrice extracellulare di massa dallo stesso dopo un periodo di coltura del fibroblasto. Questo approccio di coltura statica è facilmente adottabile da laboratori contenenti attrezzature per cultura standard su cellule di mammifero. ECM prodotto da questo approccio potrebbe essere applicato verso una varietà di applicazioni cliniche.
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Protocol
1. produzione di matrice extracellulare utilizzando membrane a fibra cava sacrificale
Attenzione: N-metil-2-pirrolidone è un solvente irritante e tossico riproduttiva. L'esposizione a NMP può causare irritazione alla pelle, occhi, naso e gola. Resistente ai solventi dispositivi di protezione individuale devono essere utilizzato quando si gestisce NMP. Uso di NMP deve essere eseguita all'interno di una cappa aspirante.
- Preparazione della soluzione di polimero polisulfone per membrane a fibra cava
- Pesano 70 g di pellet polisulfone (peso molecolare di 35 kD) in una barca di pesare con una bilancia analitica.
- Trasferire 314 mL (323,3 g) di N-metil-2-pirrolidone (NMP) in un pallone di borosilicato pulito.
- Introdurre un ancoretta nel matraccio con boccetta NMP e posto sull'agitatore. Impostare una moderata velocità di rotazione dell'agitatore.
- Utilizzare un imbuto asciutto per inserire lentamente il preparato 70 g di polisolfone nel pallone con NMP.
- Lasciare la soluzione di polimero "dope" agitare per tre giorni a temperatura ambiente, o fino a quando non omogeneizzato.
- L'impostazione di concentricità e la pulizia della filiera di membrana a fibra cava
Nota: Filiere sono commercialmente disponibili; filiera corrette dimensioni sono fondamentali per la fabbricazione di successo della membrana e sono elencati nella Tabella materiali. Gestire la filiera molto delicatamente, come l'ago di filiera è particolarmente fragile.- Utilizzare un cacciavite o forare con una punta di cacciavite adatto a smontare attentamente la filiera.
- Delicatamente il flusso acetone attraverso l'ingresso e l'uscita della filiera, raccogliendo qualunque polimero acetone e residuo in un becher di vetro per lo smaltimento.
- Fissare la parte superiore del corpo della filiera con l'ago rivolto verso l'alto in una morsa da tavolo.
- Posto il corpo di presa (in basso) di filiera sulla parte superiore del corpo.
- Spostare lateralmente il corpo presa della filiera tenendo il corpo superiore fissato sulla morsa fino a quando l'ago di filiera si trova direttamente nel centro del corpo presa.
- Lentamente e con cautela reinserire le viti che uniscono i due corpi della filiera, garantendo nel contempo che l'ago visibile all'uscita della filiera rimane centrata.
- Realizzazione di membrane a fibra cava polisolfone
- Preparare una soluzione"alesaggio" contenente 45 mL di N-metil-2-pirrolidone e 255 mL di acqua deionizzata, formando una miscela di 15% di NMP con acqua deionizzata.
- Montare una filiera di membrana a fibra cava concentrici 8 cm sopra la superficie di un bagno di acqua di rubinetto di temperatura.
- Collegare l'ingresso di polimero della filiera e l'ingresso del foro della filiera a due navi di pressione separata in acciaio, avendo un volume interno di almeno 350 mL. Entrambe le navi devono disporre valvole di ritegno alle rispettive prese.
- Collegare ciascuna delle navi pressione alle autorità di regolamentazione separata N2 bombole del gas
- Utilizzare un imbuto per inserire la soluzione preparata dope (~ 315 mL) nel recipiente a pressione collegato alla presa polimero della filiera. Assicurarsi che la parte superiore del vaso è ermeticamente chiusi.
- Usare un imbuto per inserire il preparato del foro (300 mL) di soluzione nel recipiente a pressione collegato alla presa foro della filiera. Assicurarsi che la parte superiore del vaso è ermeticamente chiusi.
- Aprire la valvola di ritegno per la nave di foro in primo luogo, quindi la nave di polimero in secondo luogo. Se la filiera è sufficientemente pulita, la soluzione di alesaggio inizierà per lo streaming dalla presa di filiera.
- Pressurizzare sia vasi di 1 PSI. Confermare visivamente che soluzioni polimero sia foro sono uscendo la filiera, con una precipitazione di filamento continuo di bianco come i flussi combinati contattare il bagno d'acqua.
- Utilizzare pinze lunghe per guidare la nascente fibra sotto i rulli nel centro del bagno e quindi avvolgere la fibra nascente intorno una ruota rotante collegata ad un motore.
- Impostare la rotella di avvolgimento e motore per ruotare a una velocità di circa due metri al minuto.
- Apportare piccole modifiche ai regolatori o velocità di ruota della presa finché un flusso stazionario è raggiunto. La nascente fibra deve formare un angolo di 90° con la superficie del bagno d'acqua.
- Nelle vicinanze il N2 cilindro regolatori e contenitore a pressione valvole di ritegno e disinnestare il motore ruota della presa dopo tutta la soluzione di polimero e alesaggio è stato estruso dai vasi.
- Rimuovere le membrane a fibra cava preparato e metterli in una vasca di acqua deionizzata per tre giorni, lo scambio di acqua deionizzata una volta al giorno per rimuovere il solvente residuo.
- Le membrane a fibra cava di sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 30 minuti o di immergerli per un giorno in etanolo al 70%.
- Cella semina delle membrane a fibra cava
Nota: Tutte le procedure di coltura delle cellule dovrebbero essere eseguite all'interno di una cappa di biosicurezza.- Trattare le membrane a fibra cava con una soluzione di 20 µ g/mL di plasma bovino fibronectin in PBS (pH = 7.4) per promuovere l'adesione delle cellule.
- Pesare 1 mg di fibronectin del plasma bovino in polvere in una barca di pesare e scioglierla in 1 mL di PBS sterile (pH = 7.4) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL sterile.
- Incubare la soluzione di fibronectina 1mg/mL del plasma bovino nell'incubatrice per 30 minuti. Aggiungere la soluzione al 49 mL di PBS sterile in una provetta conica sterile 50 mL.
- Incubare le fibre in preparati 50 mL di plasma bovino fibronectin in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2 per 1 ora. Ricordare la soluzione di fibronectina per un uso successivo e conservare in una provetta conica sterile 50 mL a 4 ° C.
- Utilizzare microforbici sterile per tagliare le fibre alla lunghezza desiderata (< 6 cm).
- Cellule del fibroblasto seme direttamente nel lumina delle membrane a fibra cava con una densità di semina di 100.000 cellule per fibra utilizzando un ago da 21 gauge con siringa da 1 mL.
Nota: Un obiettivo possibile per preparare la sospensione di eritrociti per il caricamento nella siringa è una densità di sospensione di 100.000 cellule per ogni 30 microlitri di mezzo. - Inserire sei fibre seminati in un diametro di 6 cm di Petri. Consentire le fibre seminate a incubare a 37 ° C con 5% CO2 per cinque minuti.
- Rimuovere le fibre seminate dall'incubazione e loro cultura per fino a 3 settimane in DMEM/F-12 contenenti concentrazioni finali di 50 µ g/mL di acido L-ascorbico e 150 µ g/mL L-ascorbico acido 2-fosfato (preparato fresco e sterile filtrata), 5 ng/mL TGF-β1 (da sterile filtrato aliquote conservate a-20 ° C) e 1% di penicillina-streptomicina in un 6cm di Petri all'interno di un 5% CO2 incubatore a 37 ° C. Mezzo di scambio cellulare ogni due giorni.
- Trattare le membrane a fibra cava con una soluzione di 20 µ g/mL di plasma bovino fibronectin in PBS (pH = 7.4) per promuovere l'adesione delle cellule.
- Estrazione della matrice extracellulare da membrane a fibra cava coltivate
- Luogo coltivato fibre nel flaconcino di scintillazione individuali usando il forcipe.
- Consente di inserire fino a 5 mL di NMP ogni fiala utilizzando una pipetta di vetro.
- Immergere le fibre cave in NMP, esecuzione di un totale di tre scambi di NMP. Aspirare lentamente il vecchia NMP utilizzando una pipetta da 1 mL per impedire lo strappo di ECM estratta.
Nota: Quando si aggiungono NMP fresco, è utile inclinare il flaconcino e consentire il NMP correre giù i lati, altrimenti l'impalcatura di ECM rimanente è sottoposto a taglio che può causare la lacerazione. - Rimuovere NMP e risciacquato il thread risultante ECM 3 volte in acqua deionizzata.
- Tagliate un foglio di spesso di 1/32 pollici della gomma di silicone per una lunghezza di 3 pollici, larghezza di 1 pollice e un 8 mm di stampo rettangolare 4 mm al centro della lunghezza della gomma.
- Posizionare il pezzo preparato di gomma su un 3 pollici standard di diapositiva 1-inch microscopia ed autoclave a 121 ° C per 30 minuti.
- Porre ogni fibra di ECM fianco a fianco in 8mm di stampo in silicone 4 mm fino a quando non c'è spazio aperto visibile.
- Posizionare lo stampo in una provetta conica per centrifuga da 50 mL e congelare a-80 ° C fino a quando completamente congelato.
- Lyophilize maglia ECM congelata durante la notte o fino a quando è completamente asciutto. Conservare la maglia a 4° C fino al momento per decellularizzati.
2. decellularizzazione della matrice extracellulare
- Preparare una soluzione di 1% (w/w%) sodio dodecil solfato (SDS) in acqua deionizzata.
- Incubare matrice extracellulare estratti nello stampo a 1% SDS per 24 ore a temperatura ambiente su un rocker con agitazione delicata.
- Risciacquo estratte matrice extracellulare tre volte in sterile tampone fosfato salino (PBS) con agitazione delicata, utilizzando 3 mL di PBS per risciacquo.
Nota: Risciacqui devono essere eseguiti delicatamente per minimizzare la frammentazione delle impalcature preparate. - Preparare 1 L di tampone di digestione dnasi/RNAsi.
Nota: Dnasi/RNAsi digestione tampone può essere conservato per diversi mesi a 4° C.- Pesare 1,54 g di Tris-HCl, 308 mg di MgCl2e 56 mg di CaCl2 in barche di pesare separato.
- Combinare Tris HCl, MgCl2e CaCl2 con 1 L di acqua deionizzata in un grande pallone con un ancoretta e mescolare fino a quando tutti i componenti sono disciolti.
- Filtro sterile il buffer di digestione con un filtro da 0,22 µm in una bottiglia di borosilicato 1L sterile e conservare a 4° C.
- Preparare 5 mL di soluzione di digestione dnasi/RNAsi.
Nota: La soluzione di digestione deve essere usata entro 24 ore dalla preparazione.- Pesare 0,125 mg (50 kU) della dnasi I nel peso barca e aggiungere 5 mL di buffer di digestione.
- Aggiungere 75 µ l di soluzione madre di RNasi A nel buffer di digestione.
- Riempire ogni stampino con soluzione di digestione e incubare a 4 ° C per 6 ore.
- Aspirare la soluzione di digestione e lavare tre volte in PBS sterile.
- Aspirare il PBS e incubare impalcature durante la notte in 10% penicillina-streptomicina in PBS a 4° C.
- Aspirare la penicillina-streptomicina e risciacquare ponteggi tre volte con PBS sterile.
- Posizionare lo stampo in una provetta conica per centrifuga da 50 mL e congelare a-80 ° C.
- Lyophilize la maglia di ECM decellularizzata durante la notte o fino a quando è completamente asciutto.
- Trasferire i liofilizzato ponteggi all'interno di una cappa di biosicurezza in un contenitore sterile a 4° C in attesa di utilizzo.
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Representative Results
Successo della produzione di matrice extracellulare di impalcature sacrificale è subordinato a impalcatura appropriata fabbricazione, coltura cellulare e procedure di solvente risciacquo. Fabbricazione delle membrane a fibra cava viene eseguita utilizzando un sistema di bagnato-filatura a secco-jet assemblato con componenti disponibili in commercio (Figura 1) che utilizza estrusione di soluzione polimerica attraverso l'intercapedine di un acciaio disponibile in commercio filiera (diametro interno = 0,8 mm, diametro esterno = 1,6 mm) per generare un tubo nascente della soluzione di polimero che precipita in una membrana a fibra cava a contatto con un bagno d'acqua.
Nella Figura 2è illustrato un esempio di processo per l'estrazione di ECM da HFMs. Figura 3A Mostra che una sezione trasversale del polisolfone HFMs fabbricato dal presente protocollo, che esibiscono strati esterni e interni dei pori di barretta-come caratteristici di una membrana asimmetrica. In questo protocollo, le cellule sono seminate in particolare il lume interno della membrana e coltivate in piastre di Petri diametro 6 cm (Figura 3B), con le cellule tendono a proliferare su tutte le superfici della membrana. Membrane coltivate possono essere sottoposti quindi a batch NMP e risciacquo con acqua deionizzata in flaconcini di vetro standard scintillazione (Figura 3), producendo traslucidi discussioni di ECM (Figura 3D). ECM-producendo le cellule rimangono vitali all'interno di HFMs per tutto il periodo di 3-settimana della cultura (Figura 4).
HFMs coltivate per tre settimane con il muscolo scheletrico del ratto primario, fibroblasti (RWF) sono stati dissolti tramite tre scambi di N-metil-2-pirrolidone, dopo i quali essi sono stati risciacquati tre volte in acqua deionizzata. La matrice estratta, normalmente essere traslucido in apparenza quando idratato (Figura 5A), tenderà al cloud su idratazione, se non sottoposto a risciacquo solvente appropriato a causa della presenza di residuo polimero. Si deve inoltre osservare che l'ECM restanti dopo la dissoluzione della membrana è un po ' fragile, che richiede cura nella movimentazione con una pinzetta. Fibre di ECM assemblati in mesh e quindi liofilizzato presentano un colore biancastro e la aspetto fibroso con un allineamento longitudinale lordo (figura 5B).
Figura 1: flusso del processo illustrato per la fusione di membrane a fibra cava. Membrane a fibra cava sono realizzate utilizzando il metodo di separazione onnipresente insolubile indotto fase (NIPS) utilizzando un sistema preparato da componenti commercialmente disponibili elencati nella tabella delle specifiche dei materiali. Polisolfone in NMP (17,8 w/w%) e NMP foro soluzioni (15 w/w% NMP in acqua) sono estrusi da recipienti in acciaio inox separata da pressurizzato N2 in una filiera, generando una membrana a fibra cava nascente all'uscita della filiera che precipita completamente in caso di contatto con il bagno di precipitazione di acqua del rubinetto. Fibra cava nascente manualmente è guidata sotto e sopra guide e permesso di raccogliere su un disco rotante motorizzato della presa ad un tasso di 2,3 metri al minuto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Illustrated produzione di ECM da membrane a fibra cava colta. Membrane a fibra cava sono seminate con fibroblasti e coltivate per tre settimane, seguita da scambio di NMP 3 x e lo scambio di acqua deionizzata 3 x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: cultura ed estrazione di ECM. Membrane a fibra cava mesoporosi asimmetrica (A) sono state coltivate per tre settimane con cellule RSMF in DMEM/F-12 con acido ascorbico completato e TGF-β (B). Fibre cave coltivate (C, D in alto) erano sciolto tramite 3 scambi in n-metil-2-pirrolidone poi lavate tre volte in acqua deionizzata, conseguente a fili continui di ECM (D, inferiore). Alto ingrandimento microscopio a scansione microscopia di superficie della fibra ECM (E). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: vitalità su membrane a fibra cava cellulare. Membrane a fibra cava rappresentativo in coltura con cellule RSMF per tre settimane sono state sezionate longitudinalmente usando un rasoio bene per rivelare la superficie luminale dell'HFMs e sottoposti a vive-morte di colorazione con calceina ed EthD-1. Vitalità colorazione ha rivelato uno strato confluente di cellule vitali con trascurabile EthD-1 fluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: montaggio dell'impianto ECM. Discussioni individuali matrice extracellulare (n = 30) derivato dalla cultura di RSMF cellule sono stati disposti longitudinalmente in uno stampo in silicone (A) e decellularized di SDS 1% seguita da trattamento con dnasi I, RNasi A e penicillina-streptomicina. Decellularizzati ECM è stata quindi liofilizzato, producendo una maglia bianco sporco con un aspetto fibroso e architettura longitudinale (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I processi descritti consentono la produzione di massa ECM biomateriali in vitro utilizzando membrane a fibra cava espressi da un sistema a secco-jet wet spinning permettendo per produzione all'ingrosso poco costoso di membrane, nonché attrezzature di cultura cellulare standard. Mentre le membrane fabbricate in questo protocollo sono destinate per l'uso nella coltura delle cellule, il sistema descritto può anche essere adattato per la produzione di membrane per scopi di separazione, con poro distribuzione e cavo fibra dimensioni regolabili variando dimensioni di filiera, polimero utilizzato, droga e foro portata, velocità della presa e condizioni ambientali. 13 se il protocollo dettagliato impiega membrane a fibra cava, in linea di principio qualsiasi coltura cellulare dissolvable impalcatura con proprietà di trasporto appropriato come celle aperte schiume potrebbero essere utilizzate, come dimostrato nel precedente lavoro7, 8,9. Questo approccio generale appaia utile per la produzione di ponteggi di ECM da impalcature sacrificale che possono imitare più fedelmente l'architettura interna dei tessuti. Prodotto da questo protocollo, in particolare gli impianti presentano un allineamento lordo (figura 5B), che può essere di particolare beneficio verso la ricostruzione di tessuti altamente allineati come tendini, legamenti e muscolo scheletrico.
Scambio regolare di media e, in particolare, il completamento del mezzo con acido ascorbico e TGF-β è cruciale per la produzione di ECM, come l'acido ascorbico è un enzima essenziale nella biosintesi di collagene, e TGF-β induce la sintesi di numerose proteine ECM10 . Inoltre, risciacquo di ECM con NMP deve essere eseguita, altrimenti polimero residua rimarrà in ECM estratta, che appare come una pellicola bianca durante i risciacqui di acqua. Deve prestare attenzione per non agitare non eccessivamente ECM durante la dissoluzione della membrana, come è relativamente fragile. Impalcature di ECM raccolte destinate all'impianto devono essere sottoposto a un passaggio di decellularizzazione come descritto per rimuovere xenogenici epitopi per minimizzare una potenziale reazione da corpo estraneo ospite.
L'importanza di questa tecnica sta nella sua produzione di ponteggi biocomplesso di intera tabella extracellulare che può essere ristrutturato per i processi di guarigione dell'organismo. Utilizzando questo approccio per produrre ECM da cellule specifiche ad una specie di destinazione, potrebbe essere possibile per ridurre al minimo la reazione da corpo estraneo che ostacola l'efficacia clinica di questa classe di biomateriali; utilizzando cellule specifiche di un individuo, la reazione da corpo estraneo può essere attenuato ulteriormente. Questo approccio permette anche per la produzione di ECM mirata verso particolari tessuti, con rapporti recenti che suggeriscono che il tessuto-specifici ECM può essere particolarmente efficace in determinate applicazioni12. Come questo protocollo consente la produzione di ECM attraverso varie linee cellulari, impianti combinando ECM da diversi tipi cellulari (ad es. muscolare, nervoso, endoteliale) potrebbero essere usati per personalizzare gli impianti per approssimare più fedelmente la struttura e la chimica complessità dei tessuti dell'obiettivo. Mentre le maglie di ECM qui presentate sono stati originariamente inteso come scaffold per la riparazione della ferita, possono anche avere uso come piattaforme per indagini su interazioni cellula-ECM, durotaxis e biosensori. In particolare, questo approccio si presta lo sperimentatore la capacità di produrre ECM da tipi cellulari specifici di interesse che possono prevedere nuove intuizioni riguardanti il significato biologico di tessuto-specifici ECM struttura, composizione e funzione.
Potenziali miglioramenti per le tecniche di produzione di ECM qui presentate potrebbero includere la scalabilità tramite l'uso di bioreattori dinamici e di pre-condizionamento, nonché l'esplorazione di materiali alternativi impalcatura sacrificale ed architetture. In particolare, la transizione verso un processo di rimozione dell'impalcatura solventless migliorerebbe la sicurezza del processo di estrazione; scaffold sacrificale composto da materiali che sono degradabili dagli enzimi, come la cellulosa rigenerata, possono consentire per solventless ECM estrazione14. Mentre la resistenza alla trazione di questi materiali è di sotto di quelli di materiali sintetici, esistono parecchi viali per il miglioramento di queste impalcature, tra cui esplorazione delle varie condizioni di coltura, formulazioni di media e geometrie di impalcatura sacrificale. Gli avanzamenti recenti di ingegneria genetica potrebbero essere sfruttati per produrre linee cellulari pro-fibrotici, che in combinazione con le piattaforme per la cattura di ECM potrebbero consentire la produzione di ponteggi soddisfare esigenze cliniche. Inoltre, sistemi di cultura dinamica come membrana a fibra cava di flusso-ciclo continuo bioreattori facilitano tassi elevati di nutrienti cambio favorevole a una maggiore e più rapida produzione di ECM e possono essere di particolare interesse nello sfruttare questo esistenti utilizzare la tecnica per la produzione di maggiori quantità di ECM per la ricerca biologica e clinica.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dall'Istituto nazionale dell'artrite e patologie del sistema muscoloscheletrico e malattie della pelle dei National Institutes of Health, sotto numero di premio R15AR064481, la National Science Foundation (CMMI-1404716), nonché la Arkansas Biosciences Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
References
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