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方法文章

检测细菌中的无机多聚磷酸盐

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DOI：

10.3791/58818

⸱

2019年1月21日

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham, 2Division of Infectious Diseases, University of Alabama at Birmingham

本文内容

摘要

我们介绍一种简单的方法，用于快速定量多种细菌中的无机多聚磷酸盐，包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及分枝杆菌。

摘要

无机多聚磷酸盐（polyP）是一种存在于所有生命域细胞中的生物大分子，在多种细菌中参与毒力和应激反应。目前已有多种用于生物材料中 polyP 定量的方法，但其中许多方法要么操作繁琐，要么灵敏度低，限制了其应用价值。本文介绍一种简化的细菌 polyP 定量方法，该方法采用硅胶膜柱提取技术，优化了多样品的快速处理流程；利用 polyP 特异性外切多聚磷酸酶 ScPPX 消化 polyP，并通过基于抗坏血酸的高灵敏比色法检测反应生成的游离磷酸盐。该方法操作简便、成本低廉，可实现对多种细菌物种中 polyP 的可靠定量。我们展示了该方法在革兰氏阴性菌（Escherichia coli）、革兰氏阳性乳酸菌（Lactobacillus reuteri）以及分枝杆菌属（Mycobacterium smegmatis）中的代表性 polyP 定量结果。此外，我们还提供了一种简单的镍亲和层析方法，用于纯化毫克级的 ScPPX，该酶目前尚未商业化供应。

引言

无机多聚磷酸盐（polyP）是一种由磷酸酐键连接的磷酸基团组成的线性生物大分子，存在于所有生命领域中1,2,3。在多种细菌中，polyP 对应激反应、运动性、生物膜形成、细胞周期调控、抗生素耐药性以及毒力具有重要作用4,5,6,7,8,9,10,11。因此，对细菌中 polyP 代谢的研究有望深入揭示细菌致病能力及其在多种环境中生存的机制。然而，在许多情况下，可用于定量细菌细胞内 polyP 的方法仍是此类研究的限制因素。

目前有多种方法用于测定生物材料中的聚磷酸盐（polyP）含量。这些方法通常包括两个独立的步骤：提取 polyP 以及对提取物中的 polyP 进行定量。当前的金标准方法由 Bru 及其同事为酵母 Saccharomyces cerevisiae 所建立12，该方法使用苯酚和氯仿提取 polyP 以及 DNA 和 RNA，随后进行乙醇沉淀，再用脱氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）处理，接着利用 S. cerevisiae 的聚磷酸盐降解酶外切聚磷酸酶（ScPPX）消化所获得的纯化 polyP13，从而释放出游离磷酸盐，最后通过基于孔雀石绿的比色法进行定量。该方法具有高度定量性，但操作繁琐，限制了单次实验可处理的样本数量，且未针对细菌样本进行优化。其他研究者曾报道使用二氧化硅珠（"glassmilk"）或二氧化硅膜柱6,14,15,16,17,18 从多种细胞和组织中提取 polyP。这些方法无法高效提取短链 polyP（少于 60 个磷酸基团）12,14,15，不过对于细菌而言这一问题影响较小，因为通常认为细菌主要合成长链 polyP3。早期使用强酸提取 polyP 的方法19,20 目前已不再广泛使用，因为 polyP 在酸性条件下不稳定12。

目前已有多种用于定量多聚磷酸盐（polyP）的报道方法。其中最常用的是4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），这是一种通常用于DNA染色的荧光染料。DAPI与polyP形成的复合物相较于DAPI-DNA复合物具有不同的荧光激发和发射最大值21,22，但该方法会受到RNA、核苷酸和肌醇磷酸等其他细胞组分的严重干扰12,15,16,23，从而降低polyP检测的特异性和灵敏度。另一种方法是利用纯化的Escherichia coli多聚磷酸激酶（PPK）将polyP和二磷酸腺苷（ADP）转化为三磷酸腺苷（ATP），再通过荧光素酶检测生成的ATP14,17,18。该方法可检测极微量的polyP，但需要两个酶促反应步骤，并且需要荧光素和高纯度的ADP，而这些试剂价格昂贵。ScPPX可特异性地将polyP水解为无机磷酸盐6,12,13,24，后者可通过更简单的方法进行检测；但ScPPX会受到DNA和RNA的抑制12，因此必须对含polyP的提取物进行DNase和RNase处理。目前PPK和ScPPX均无商业来源，且PPK的纯化过程相对复杂25,26。

细胞裂解物或提取物中的多聚磷酸盐（PolyP）也可通过DAPI负染色法在聚丙烯酰胺凝胶上进行可视化27,28,29,30，该方法能够评估PolyP链的长度，但通量较低且定量效果较差。

本文报道了一种快速、低成本、中等通量的多聚磷酸（polyP）检测方法，可实现对多种细菌中polyP水平的快速定量。该方法首先在95 °C条件下，使用4 M异硫氰酸胍（GITC）裂解细菌细胞14，以灭活细胞内的磷酸酶；随后采用经优化的硅胶膜柱提取法，可快速处理多个样品。所得含polyP的提取物再用过量的ScPPX进行消化，从而无需DNase和RNase处理步骤。我们同时提供了简便的镍亲和层析纯化方案，可获得毫克级的ScPPX蛋白。最后，利用一种基于抗坏血酸的简单且灵敏的比色法24检测polyP水解产生的游离磷酸盐，并将其归一化至总细胞蛋白含量。该方法简化了细菌细胞中polyP的测定流程，我们以革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和分枝杆菌的代表性物种为例，展示了该方法的应用。

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方案

1. 纯化酵母外切多聚磷酸酶（ScPPX）

  1. 转化 E. coli 蛋白过表达菌株 BL21(DE3)31 含质粒 pScPPX26 通过电穿孔法32 或化学转化33.
  2. 接种1 L含有100 µg mL的溶菌肉汤（LB）-1 氨苄青霉素加入2 L无挡板锥形瓶中，接种含pScPPX2质粒的BL21(DE3)单菌落，于37 °C静置培养过夜，至600 nm波长处吸光度（A600约为 0.3，通过分光光度计测定。
  3. 开始以180 rpm振荡培养，并在37 °C下孵育30分钟，在此期间细胞将生长至A600 0.4 - 0.5
  4. 加入异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）至终浓度为 1 mM，并额外加入 100 µg/mL-1 氨苄青霉素，然后在37 °C、180 rpm振荡条件下孵育4小时。
    注意：本过表达方案可产生大量可溶性 ScPPX。然而，ScPPX 的过表达具有很高的容错性，多种其他常见的蛋白质过表达方案也已成功用于 ScPPX 的纯化。
  5. 将细胞转移至1 L离心瓶中，在4 °C、5000 × g条件下离心20 min收集细胞。弃去上清液，将细胞沉淀转移至50 mL锥形管中。
    注意：细胞沉淀可在 -80 °C 长期保存。
  6. 将沉淀在冰上解冻，然后用 9 mL 的 50 mM HEPES、0.5 M NaCl 和 5 mM 咪唑（pH 8）重悬，总体积约为 10 mL。
  7. 加入（终浓度）1 mg/mL-1 溶菌酶，2 mM MgCl2，以及50单位/毫升-1 一种可降解RNA和DNA的内切核酸酶（参见 材料表）并在冰上孵育30分钟。
    注意：ScPPX 可结合核酸（数据未显示），因此在纯化过程中核酸酶处理至关重要。
  8. 使用带微探头的超声波破碎仪（参见 材料表)，在冰上进行2个循环的超声处理以裂解细胞，超声功率为50%，每次超声5秒，间隔5秒，循环之间休息2分钟。
    注意：超声处理过程中应使用适当的听力保护装置。与过表达情况类似，多种细胞裂解方法均可用于ScPPX的纯化。
  9. 在4 °C条件下，以20,000 × g离心裂解液20分钟，去除不溶性碎片。将所得上清液（约10 mL）通过孔径0.8 µm的醋酸纤维素注射器滤器过滤。
  10. 将裂解液上样至已负载镍离子的5 mL螯合柱（参见 材料表使用蠕动泵或大容量注射器。
  11. 用 50 mL 的 50 mM HEPES、0.5 M NaCl、5 mM 咪唑（pH 8）缓冲液冲洗层析柱。
  12. 用 50 mL 的 50 mM HEPES、0.5 M NaCl、20 mM 咪唑（pH 8）缓冲液冲洗层析柱。
  13. 用50 mM HEPES、0.5 M NaCl和0.5 M咪唑（pH 8）洗脱ScPPX，收集15个1 mL的洗脱组分。使用Bradford蛋白定量法检测这些洗脱组分中的蛋白含量。34 （参见 材料表）并进行SDS-PAGE凝胶电泳35 以确认哪些组分含有纯化的 ScPPX（分子量 = 45 kDa）。
  14. 合并含有纯ScPPX的组分，并将合并后蛋白的浓度调节至约2 mg/mL-1 使用50 mM HEPES和0.5 M NaCl。较高的蛋白质浓度可能在下一步中发生沉淀。
  15. 将纯化的ScPPX通过透析置换至储存缓冲液（20 mM Tris-HCl [pH 7.5]，50 mM KCl，10% [v/v] 甘油）中。将合并的ScPPX组分置于密封的截留分子量为12,000–14,000 Da的透析膜管中（参见 材料表）并悬浮于1 L保存缓冲液中，在4 °C下持续搅拌至少4小时。使用新鲜的保存缓冲液重复此步骤，共更换缓冲液3次。
  16. 将纯化并透析后的蛋白质转移至离心管中，在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 20 分钟，以去除不溶性聚集体。小心地将上清液转移至干净的 15 mL 圆锥形离心管中。
  17. 将纯化的 ScPPX 浓度调整至 1 mg/mL-1 加入储存缓冲液，添加0.1%（w/v）无蛋白酶的牛血清白蛋白（BSA；终浓度），于4 °C保存，可存放长达6个月。
    注意：ScPPX 在冷冻后会失去超过 90% 的活性13.

2. 聚磷酸盐提取样品的收获

  1. 在感兴趣的条件下培养细菌，以测定其聚磷酸盐（polyP）含量。本实验方案中，将Lactobacillus reuteri36在不含半胱氨酸的苹果酸酶诱导（MEI-C）培养基37中，于37 °C静置培养过夜。
  2. 通过离心收集足量细胞，置于1.5 mL微量离心管中，使总细胞蛋白量达到50 – 100 µg（见下文步骤3）。对于E. coli，取A600为0.2 - 0.4的对数生长期培养物1 mL；对于L. reuteri，取过夜培养物1 mL。根据其他目标菌种的具体情况相应调整。
  3. 彻底移除细胞沉淀中的上清液。
  4. 将细胞沉淀重悬于250 µL GITC裂解缓冲液（4 M 异硫氰酸胍，50 mM Tris-HCl，pH 7）中，于95 °C孵育10分钟以实现裂解。将裂解产物储存于-80 °C。
    注意：裂解时间应保持一致，因为高温长时间孵育可能导致聚磷酸盐通过水解降解38。裂解产物可在-80 °C长期保存。
    警告：异硫氰酸胍为变性盐，操作时应佩戴手套，并作为危险废物妥善处理。

3. 测定细胞裂解液的蛋白质含量

  1. 在GITC裂解缓冲液中配制含有0、0.1、0.2和0.4 mg mL-1 BSA的BSA标准品。
    注意：必须在GITC中配制BSA标准品，因为GITC会影响Bradford法显色反应。BSA标准品可在-20 °C长期保存。
  2. 取5 µL解冻后充分混匀的细胞裂解液及BSA标准品，分别加入透明96孔板的不同孔中。
  3. 每孔加入195 µL Bradford试剂34，使用酶标仪在595 nm处测定吸光度（A595）（参见材料表）。
  4. 根据BSA标准曲线，使用公式 y = mx + b 计算每孔中的蛋白含量，其中 y 为A595，x 为BSA的微克数（µg），m 为标准曲线的斜率，b 为标准曲线的y轴截距。将计算结果乘以0.05，得到每个样品中的总蛋白毫克数（mg）。

4. 提取多聚磷酸盐

  1. 向每个 GITC 裂解的样品中加入 250 µL 95% 乙醇，并涡旋混匀。
  2. 将该混合物加入硅胶膜离心柱中，于 16,100 × g 离心 30 秒。
  3. 弃去穿流液，然后加入 750 µL 含 5 mM Tris-HCl（pH 7.5）、50 mM NaCl、5 mM EDTA 和 50% 乙醇的洗涤液，于 16,100 × g 离心 30 秒。
  4. 弃去穿流液，再于 16,100 × g 离心 2 分钟。
  5. 将离心柱转移至一支洁净的 1.5 mL 微量离心管中，并加入 150 µL 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）。
  6. 室温孵育 5 分钟，然后于 8,000 × g 离心 2 分钟以洗脱多聚磷酸盐（polyP）。
    注意：如有需要，洗脱液可在 -20 °C 下保存至少 1 周。

5. 多聚磷酸盐的消化

  1. 配制含有 0、5、50 或 200 µM 磷酸钾的标样，溶于 50 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 8）中。
    注意：磷酸钾标样可在室温下长期保存。
  2. 将每种磷酸盐标样及提取的聚磷酸盐（polyP）样品各取 100 µL，分装至透明 96 孔板的不同孔中。
  3. 配制主反应混合液（每份样品）：30 µL 5x ScPPX 反应缓冲液（100 mM Tris-HCl、25 mM MgCl2、250 mM 醋酸铵，pH 7.5）13、19 µL H2O 和 1 µL 纯化的 ScPPX 酶（1 mg mL-1）。
  4. 向 96 孔板的每个孔中加入 50 µL 主混合液，于 37 °C 孵育 15 分钟。
    注意：如有需要，消化后的 polyP 样品可在 -20 °C 长期保存。

6. 检测游离磷酸盐24

  1. 通过将0.185 g酒石酸锑钾溶解于200 mL水中，加入150 mL 4 N H2SO4，再加入1.49 g钼酸铵，配制检测试剂基础液。搅拌至完全溶解后，定容至456 mL。过滤溶液以去除颗粒物，并在4 °C避光保存，可保存最多1个月。
  2. 配制1 M抗坏血酸储备液。避光保存于4 °C，可保存最多1个月。
  3. 每天现配工作用检测试剂，将9.12 mL检测试剂基础液与0.88 mL 1 M抗坏血酸混合。使用前使检测试剂恢复至室温。
  4. 向96孔板中的每个样品和标准品孔中加入50 µL检测试剂，室温孵育约2分钟，使显色反应进行。
  5. 使用酶标仪在882 nm处测定吸光度，并通过与磷酸钾标准曲线比较，计算各样品的磷酸盐浓度。
    注意：检测试剂含有有毒盐类和强酸。操作时需佩戴手套，废弃溶液应作为有毒废物处理。

7. 计算细胞内多聚磷酸盐含量

  1. 根据以下公式，将步骤 6.5 中测定的磷酸盐浓度转换为每份完整细胞裂解液中多聚磷酸盐（polyP）来源的磷酸盐的纳摩尔数（nmol）：
              nmol polyP = 1.5 × (µM 磷酸盐 / 10)
    注：步骤 6 中基于标准曲线的方法测定的是在步骤 5.2 中分取的每份 100 µL polyP 样品中磷酸盐的浓度（单位为 µM）。为将该浓度转换为摩尔数（nmol），需将 100 µL 除以 106 得到以升（L）为单位的体积，再乘以浓度（µmol L-1），然后乘以 1,000（即每 µmol 所含的 nmol 数）。该计算可简化为将浓度除以 10。步骤 4 中制备的总提取液体积为 150 µL，因此需将所得数值乘以 1.5，以计算整个提取液中所含的磷酸盐 nmol 数。
  2. 通过将每份样品中 polyP 的 nmol 数除以步骤 3.4 中测定的总蛋白质量（mg），对细胞内 polyP 含量进行基于总蛋白量的归一化处理。polyP 水平以单个 polyP 来源的游离磷酸盐浓度表示。
    注：在某些情况下，样品中 polyP 来源的磷酸盐含量可能超出磷酸盐标准曲线的线性范围（步骤 6.5）。若 polyP 水平极高，可将步骤 4.6 中含过量 polyP 的洗脱液按需稀释 1:10 或 1:100，然后按照步骤 5 至 7 的方法重新测定。

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结果

本方案的关键步骤以简化形式在图1中示出。

为展示本方案在革兰氏阴性菌中的应用，将野生型 E. coli MG165539 在 LB 富集培养基中于 37 °C 摇床（200 rpm）培养至对数中期，随后洗涤并转移至含 4 g L-1 葡萄糖和 0.1 mM K2HPO4 的吗啉丙磺酸缓冲（MOPS）最低培养基40中继续孵育 2 小时，该条件已知可诱导聚磷酸盐（polyP）的生成14,29。如图 2A所示，我们在 LB 培养基中生长的野生型 <...

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讨论

此处描述的实验方案简化并加速了对多种细菌中聚磷酸盐（polyP）水平的定量分析，通常一套24个样本的完整处理时间约为1.5小时。该方法可实现对样品的快速筛选和突变体文库的分析，并简化了用于检测polyP随时间积累的动力学实验。我们已证实，该方案在三个不同门类的代表性细菌——变形菌门（proteobacteria）、厚壁菌门（firmicutes）和放线菌门（actinobacteria）中均能有效应用，这些菌类以其细胞壁坚韧、难以处理而著称 裂解细胞壁49.

使用ScPPX消化法检测polyP比使用DAPI进行荧光检测更具特异性、更灵敏，且成本更低， 比使用PPK将聚磷酸盐转化为ATP在技术上更为简便。尽管ScPPX受到DNA和RNA的抑制12，我们通过使用大量过量的酶（每样品1 µg），实现了对含有超过6,000 nmol polyP/mg的细菌的完全消化-1 蛋白29其他已发表的方法每反应使用 ...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本项目得到了阿拉巴马大学伯明翰分校微生物学系启动资金以及美国国立卫生研究院资助 R35GM124590（资助 MJG）和 NIH 资助 R01AI121364（资助 FW）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
E. coli BL21(DE3)Millipore Sigma69450
质粒 pScPPX2Addgene112877可供学术及其他非营利性机构使用
LB肉汤Fisher ScientificBP1427-2E. coli 培养基
氨苄青霉素Fisher ScientificBP176025
异丙基 β异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）Gold BiotechnologyI2481C
HEPES缓冲液Gold BiotechnologyH-400-1
氢氧化钾（KOH）Fisher ScientificP250500用于调节HEPES缓冲溶液的pH值
氯化钠（NaCl）Fisher ScientificS27110
咪唑Fisher ScientificO3196500
溶菌酶Fisher ScientificAAJ6070106
氯化镁（MgCl2)Fisher ScientificBP214-500
Pierce 通用核酸酶Fisher ScientificPI88700Benzonase（Sigma-Aldrich 货号：E1014）可作为合适的替代品
Model 120 超声波破碎仪Fisher ScientificFB-120其他细胞裂解方法（例如高压均质法）也可能有效
5 mL HiTrap 螯合 HP 柱GE Life Sciences17040901任何镍亲和层析柱或树脂均可替代使用
六水合硫酸镍(II)Fisher ScientificAC415611000用于HiTrap柱的预处理
0.8 µm孔径醋酸纤维素注射器滤器Fisher Scientific09-302-168
Bradford 试剂伯乐（Bio-Rad）5000205
Tris缓冲液Fisher ScientificBP1525
光谱 Spectra/Por 4 RC 透析膜管，12,000 至 14,000 道尔顿截留分子量Fisher Scientific08-667B其他具有不同截留分子量（MWCO）的透析膜 < 30,000 道尔顿也应可行
盐酸（HCl）Fisher ScientificA144-212用于调节Tris缓冲溶液的pH值
氯化钾（KCl）Fisher ScientificP217500
甘油Fisher ScientificBP2294
10x MOPS 培养基混合液TeknovaM2101E. coli 培养基
葡萄糖Fisher ScientificD161
磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4)Fisher ScientificBP362-500
磷酸氢二钾（K2HPO4)Fisher ScientificBP363-500
脱水酵母提取物Fisher ScientificDF0886-17-0
胰蛋白胨Fisher ScientificBP1421-500
七水合硫酸镁Fisher ScientificM63-50
硫酸锰一水合物Fisher ScientificM113-500
异硫氰酸胍Fisher ScientificBP221-250
牛血清白蛋白（无蛋白酶）Fisher ScientificBP9703100
透明平底96孔板Sigma-AldrichM0812-100EA任何透明的96孔板均可使用
Tecan M1000 Infinite 酶标仪Tecan, Inc.不适用任何能够测量595 nm和882 nm吸光度的酶标仪均可使用
乙醇Fisher Scientific04-355-451
硅胶膜离心柱Epoch生命科学1910-050/250
乙二胺四乙酸（EDTA）Fisher ScientificBP120500
1.5 mL 微量离心管Fisher ScientificNC9580154
乙酸铵Fisher ScientificA637-500
酒石酸锑钾Fisher ScientificAAA1088922
4 N 硫酸（H₂SO₄）2SO4Fisher ScientificSA818-500
七钼酸铵Fisher ScientificAAA1376630
抗坏血酸Fisher ScientificAC401471000

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