检测细菌中的无机多聚磷酸盐

摘要

我们介绍一种简单的方法，用于快速定量多种细菌中的无机多聚磷酸盐，包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及分枝杆菌。

摘要

无机多聚磷酸盐（polyP）是一种存在于所有生命域细胞中的生物大分子，在多种细菌中参与毒力和应激反应。目前已有多种用于生物材料中 polyP 定量的方法，但其中许多方法要么操作繁琐，要么灵敏度低，限制了其应用价值。本文介绍一种简化的细菌 polyP 定量方法，该方法采用硅胶膜柱提取技术，优化了多样品的快速处理流程；利用 polyP 特异性外切多聚磷酸酶 ScPPX 消化 polyP，并通过基于抗坏血酸的高灵敏比色法检测反应生成的游离磷酸盐。该方法操作简便、成本低廉，可实现对多种细菌物种中 polyP 的可靠定量。我们展示了该方法在革兰氏阴性菌（Escherichia coli）、革兰氏阳性乳酸菌（Lactobacillus reuteri）以及分枝杆菌属（Mycobacterium smegmatis）中的代表性 polyP 定量结果。此外，我们还提供了一种简单的镍亲和层析方法，用于纯化毫克级的 ScPPX，该酶目前尚未商业化供应。

引言

无机多聚磷酸盐（polyP）是一种由磷酸酐键连接的磷酸基团组成的线性生物大分子，存在于所有生命领域中^1,2,3。在多种细菌中，polyP 对应激反应、运动性、生物膜形成、细胞周期调控、抗生素耐药性以及毒力具有重要作用^{4,5,6,7,8,9,10,11}。因此，对细菌中 polyP 代谢的研究有望深入揭示细菌致病能力及其在多种环境中生存的机制。然而，在许多情况下，可用于定量细菌细胞内 polyP 的方法仍是此类研究的限制因素。

目前有多种方法用于测定生物材料中的聚磷酸盐（polyP）含量。这些方法通常包括两个独立的步骤：提取 polyP 以及对提取物中的 polyP ....

方案

1. 纯化酵母外切多聚磷酸酶（ScPPX）

1. 转化 E. coli 蛋白过表达菌株 BL21(DE3)³¹ 含质粒 pScPPX2⁶ 通过电穿孔法³² 或化学转化³³.
2. 接种1 L含有100 µg mL的溶菌肉汤（LB）^-1 氨苄青霉素加入2 L无挡板锥形瓶中，接种含pScPPX2质粒的BL21(DE3)单菌落，于37 °C静置培养过夜，至600 nm波长处吸光度（A₆₀₀约为 0.3，通过分光光度计测定。
3. 开始以180 rpm振荡培养，并在37 °C下孵育30分钟，在此期间细胞将生长至A₆₀₀ 0.4 - 0.5
4. 加入异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）至终浓度为 1 mM，并额外加入 100 µg/mL^-1 氨苄青霉素，然后在37 °C、180 rpm振荡条件下孵育4小时。
   注意：本过表达方案可产生大量可溶性 ScPPX。然而，ScPPX 的过表达具有很高的容错性，多种其他常见的蛋白质过表达方案也已成功用于 ScPPX 的纯化。
5. 将细胞转移至1 L离心瓶中，在4 °C、5000 × g条件下离心20 min收集....

结果

该方案的关键步骤以简化形式示于图1中。

为展示本方案在革兰氏阴性菌中的应用，使用野生型 E. coli MG1655³⁹ 在37 °C、200 rpm振荡条件下，于LB富集培养基中培养至对数中期，随后洗涤并转移至吗啉丙磺酸缓冲（MOPS）最小培养基中继续孵育2小时⁴⁰ 含 4 g L^-1 葡萄糖和 0.1 mM K₂HPO₄，一种已知可诱导聚磷酸盐（polyP）产生的条件^14,29如图所示 图2A，我们在野生型中未检测到聚磷酸盐 大肠.......

讨论

此处描述的实验方案简化并加速了对多种细菌中聚磷酸盐（polyP）水平的定量分析，通常一套24个样本的完整处理时间约为1.5小时。该方法可实现对样品的快速筛选和突变体文库的分析，并简化了用于检测polyP随时间积累的动力学实验。我们已证实，该方案在三个不同门类的代表性细菌——变形菌门（proteobacteria）、厚壁菌门（firmicutes）和放线菌门（actinobacteria）中均能有效应用，这些菌类以其细胞壁坚韧、难以处理而著称 裂解细胞壁⁴⁹.

使用ScPPX消化法检测polyP比使用DAPI进行荧光检测更具特异性、更灵敏，且成本更低， 比使用PPK将聚磷酸盐转化为ATP在技术上更为简便。尽管ScPPX受到DNA和RNA的抑制¹²，我们通过使用大量过量的酶（每样品1 µg），实现了对含有超过6,000 nmol polyP/mg的细菌的完全消化^-1 蛋白²⁹其他已发表的方法每反应使用 .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
E. coli BL21(DE3)	Millipore Sigma	69450
质粒 pScPPX2	Addgene	112877	可供学术及其他非营利性机构使用
LB肉汤	Fisher Scientific	BP1427-2	E. coli 培养基
氨苄青霉素	Fisher Scientific	BP176025
异丙基 β异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）	Gold Biotechnology	I2481C
HEPES缓冲液	Gold Biotechnology	H-400-1
氢氧化钾（KOH）	Fisher Scientific	P250500	用于调节HEPES缓冲溶液的pH值
氯化钠（NaCl）	Fisher Scientific	S27110
咪唑	Fisher Scientific	O3196500
溶菌酶	Fisher Scientific	AAJ6070106
氯化镁（MgCl2)	Fisher Scientific	BP214-500
Pierce 通用核酸酶	Fisher Scientific	PI88700	Benzonase（Sigma-Aldrich 货号：E1014）可作为合适的替代品
Model 120 超声波破碎仪	Fisher Scientific	FB-120	其他细胞裂解方法（例如高压均质法）也可能有效
5 mL HiTrap 螯合 HP 柱	GE Life Sciences	17040901	任何镍亲和层析柱或树脂均可替代使用
六水合硫酸镍(II)	Fisher Scientific	AC415611000	用于HiTrap柱的预处理
0.8 µm孔径醋酸纤维素注射器滤器	Fisher Scientific	09-302-168
Bradford 试剂	伯乐（Bio-Rad）	5000205
Tris缓冲液	Fisher Scientific	BP1525
光谱 Spectra/Por 4 RC 透析膜管，12,000 至 14,000 道尔顿截留分子量	Fisher Scientific	08-667B	其他具有不同截留分子量（MWCO）的透析膜 < 30,000 道尔顿也应可行
盐酸（HCl）	Fisher Scientific	A144-212	用于调节Tris缓冲溶液的pH值
氯化钾（KCl）	Fisher Scientific	P217500
甘油	Fisher Scientific	BP2294
10x MOPS 培养基混合液	Teknova	M2101	E. coli 培养基
葡萄糖	Fisher Scientific	D161
磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4)	Fisher Scientific	BP362-500
磷酸氢二钾（K2HPO4)	Fisher Scientific	BP363-500
脱水酵母提取物	Fisher Scientific	DF0886-17-0
胰蛋白胨	Fisher Scientific	BP1421-500
七水合硫酸镁	Fisher Scientific	M63-50
硫酸锰一水合物	Fisher Scientific	M113-500
异硫氰酸胍	Fisher Scientific	BP221-250
牛血清白蛋白（无蛋白酶）	Fisher Scientific	BP9703100
透明平底96孔板	Sigma-Aldrich	M0812-100EA	任何透明的96孔板均可使用
Tecan M1000 Infinite 酶标仪	Tecan, Inc.	不适用	任何能够测量595 nm和882 nm吸光度的酶标仪均可使用
乙醇	Fisher Scientific	04-355-451
硅胶膜离心柱	Epoch生命科学	1910-050/250
乙二胺四乙酸（EDTA）	Fisher Scientific	BP120500
1.5 mL 微量离心管	Fisher Scientific	NC9580154
乙酸铵	Fisher Scientific	A637-500
酒石酸锑钾	Fisher Scientific	AAA1088922
4 N 硫酸（H₂SO₄）2SO4	Fisher Scientific	SA818-500
七钼酸铵	Fisher Scientific	AAA1376630
抗坏血酸	Fisher Scientific	AC401471000