细菌中无机聚磷酸盐的检测

无机聚磷酸盐 (聚磷) 是一种线性生物聚合物的磷酸酐连接磷酸盐单位, 存在于^{生命的所有领域 1,2,3}。在不同的细菌中, 聚磷对于应激反应、动力、生物膜形成、细胞周期控制、抗生素耐药性和毒^{力 4、}5^{、6、7、8 至关重要 , 9,10,11}。因此, 对细菌中的多磷代谢的研究有可能对细菌在不同环境中引起疾病和茁壮成长的能力产生基本的洞察。然而, 在许多情况下, 细菌细胞中的聚磷定量方法是这些研究中的一个限制因素。

目前有几种方法用于测量生物材料中的多磷水平。这些方法通常涉及两个不同的步骤: 提取聚 p 和量化这些提取物中存在的聚磷。目前的金标准方法, 开发酵母酿酒酵母 12 , 提取聚 p与 dna 和 rna 使用苯酚和氯仿, 其次是乙醇沉淀, 治疗脱氧核糖核酸酶 (dnase) 和核糖核酸酶 (rnase), 并消化由此产生的纯化聚苯与酿酒酵母聚 p 降解酶外聚磷酸酶 (scppx)¹³产生游离磷酸盐, 然后用孔雀石绿基比色法。此过程是高度定量的, 但劳动密集型, 限制了可在单个实验中处理的样品数量, 并且没有针对细菌样本进行优化。另一些人报告说, 使用硅珠 ("玻璃牛奶") 或硅膜色谱柱6^{、14、15、16、17从}各种细胞和组织^中提取聚乙二醇. ^18岁这些方法不能有效地提取 12^、14、15的短链聚磷 (小于60个磷酸盐单位)^,尽管这对细菌的关注较少, 而细菌通常被认为主要是合成长链聚乙二醇³。使用强酸^{19、20 提取}聚^磷的旧方法不再被广泛使用, 因为聚乙二醇在酸性条件下不稳定12。

还有各种报告的定量聚电的方法。其中最常见的是 4 ', 6-二胺-2-苯丙二醇 (dapi), 一种荧光染料更常用于染色 dna。dapi-polyp 复合物的荧光激发和发射最大值与 dapi-dna 复合物^21、22 不同, 但其他细胞成分 (包括 rna、核苷酸和肌醇) 的干扰相当大磷酸盐^{12、15、16、23, 降低}了使用该方法进行的多聚子测量的特异性和敏感性。或者, 聚磷和二磷酸腺苷 (adp) 可以转换为三磷酸腺苷 (atp) 使用纯化的大肠杆菌多 p 激酶 (ppk) 和由此产生的 atp 量化使用荧光素酶 14^{,17 ,18}。这样就可以检测到非常少量的聚磷, 但需要两个酶反应步骤, 以及荧光素和非常纯的 adp, 它们都是昂贵的试剂。scppx 专门将聚磷消化成游离磷酸盐^{6,12,13, 24,}这可以用更简单的方法检测, 但 scppx 是由 dna 和 rna¹²抑制,需要 dnase 和 rnase 处理含有多 p 的提取物。ppk 和 scppx 都不是商业上可用的, ppk 纯化相对复杂25^,26。

细胞裂解物或提取物中的聚磷也可以通过 dapi^{阴性染色 27,}28, 29, 30 在聚丙烯酰胺凝胶上显示, 这种方法确实允许对链长进行评估, 但低吞吐量和低量化。

我们现在报告一种快速、廉价、中等吞吐量的聚 p 检测方法, 可快速定量于不同细菌种类中的多磷水平。该方法首先在95°c 下在 4 m 鸟嘌呤异硫氰酸酯 (gitc)¹⁴中裂解细菌细胞, 以灭活细胞磷酸酶, 然后进行硅膜柱提取, 以快速处理多个样品。然后用大量过量的 scppx 消化生成的含有多普的提取物, 从而无需 dnase 和 rnase 处理。我们包括一个协议, 直接镍亲和力纯化毫克数量的 scppx。最后, 用简单、灵敏、抗坏血酸的比色法24和归一化为总细胞蛋白的多 p 衍生游离磷酸盐进行量化。该方法简化了细菌细胞中聚苯的测量, 并证明了其在革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和分枝杆菌中的代表性种类中的应用。

1. 纯化酵母外聚磷酸酶 (scppx)

1. 用电穿孔³²或化学转化33法将大肠杆菌蛋白过度表达菌株 BL21(DE3)³¹ 与质粒 pScPPX2⁶转化.
2. 接种含有 100μg ml-1 氨匹液的溶酶体肉汤 (lb), 在 2升的无菌瓶中, 单菌落 BL21(DE3) 含有 pscppx2, 在37°c 孵育过夜, 吸收率约为600纳米 (a₆₀₀)0.3, 在分光光度计中测量。
3. 开始培养晃动 (180 转/分), 在37°c 下孵育 30分钟, 在此期间细胞将生长到0.4-0.5 的600澳元 。
4. 加入异丙基β-d-1-硫代卡拉多酮苷 (iptg), 最终浓度为 1 mm, 并增加100微克 ml-1 氨^匹西林, 然后在37°c 孵育 4小时, 在180转/分处晃动。
   注: 此过度表达式协议生成大量可溶性 scppx。然而, scppx 过度表达是非常宽容的, 和其他各种常见的蛋白质过度表达方案已被用于成功纯化 scppx。
5. 将细胞转移到1升离心机瓶中, 在4°c 的 5000 x 克离心20分钟内收获。取出上清液, 将细胞颗粒转移到50毫升锥形管。
   注: 电池颗粒可在-80°c 无限期地存储。
6. 将颗粒在冰上解冻, 然后在 50 mm hepes 的9毫升、0.5 m 的 ncl 和 5 mL 咪唑 (ph 8) 中重新悬浮, 总体积约为10毫升。
7. 加入 (最终浓度) 1 毫克^ml-1溶菌酶、2 mL mgcl 2和50个单位 ml-1, 加入 rna 和 dna 降解内切酶⁽见材料表), 在冰上孵育30分钟。
   注: scppx 结合核酸 (未显示数据), 因此在纯化过程中, 核酸酶处理是必不可少的。
8. 使用带有微尖端的声纳器 (见材料表), 以50% 的功率在冰上通过2个超声周期将细胞裂解, 脉冲 5秒, 关闭 5秒, 在周期之间休息2分钟。
   注: 在超声过程中使用适当的听力保护。与过度表达的情况类似, 各种细胞裂解方法是可接受的 scppx 纯化。
9. 在20°c 的 20, 000 x 克离心裂解液 20分钟, 去除不溶于水的碎片。通过0.8 微米孔径醋酸纤维素注射器过滤器, 过滤产生的上清液 (约10毫升)。
10. 使用蠕动泵或大型注射器将裂解液加载到带镍的 5 ml 螯合柱 (见材料表) 上。
11. 用50毫升 hepes、0.5 m 氯化钠、5毫米咪唑 (ph 8) 冲洗色谱柱。
12. 用50毫升 hepes、0.5 m 氯化钠、20 mm 咪唑 (ph 值 8) 冲洗色谱柱。
13. 使用 50 mm hepes、0.5 m ncl 和 0.5 m 咪唑 (ph 值 8) 的 elute scppx, 收集 15 1 毫升的分数。用布拉德福德蛋白测定 34 (见材料表)^测试这些洗脱分数的蛋白质含量, 并运行 sds-page 凝胶³⁵ , 以确认哪些馏分含有纯化的 scppx (分子量 = 45 kda)。
14. 将含有纯 scppx 的组分进行池, 并将集合蛋白的浓度调整为约2毫克 ml-1, 使用 50 mm hepes 和 0.5 m ncl.更高的蛋白质浓度可能会在下一步沉淀。
15. 通过透析将纯化后的 scppx 转化为储存缓冲液 (20 mm Tris-HCl [ph 7.5]、50 mm kcl、10% [v/v] 甘油)。将 scppx 组分放在 12, 000-14, 000 da 分子量截止透析膜管的密封长度中, 并在4°c 下连续搅拌悬浮在1升的储存缓冲液中至少4小时。存储缓冲区, 共进行3次缓冲区更改。
16. 在20°c 的 20, 000 x 克的情况下, 将纯化的透析蛋白转移到离心管或管和离心机中 20分钟, 以去除任何不溶于水的集合体。小心地将上清液转移到干净的15毫升锥形管。
17. 使用储存缓冲液将纯化后的 scppx 浓度^调整为1毫克 ml-1, 加入0.1% 的无蛋白酶 (w/v) 无蛋白酶牛血清白蛋白 (bsa; 最终浓度), 并在4°c 下储存长达6个月。
    注: scppx 失去超过90% 的活动时, 它被冻结¹³。

2. 收集聚磷酸盐提取样品

1. 在感兴趣的条件下培养细菌以测定聚乙二醇的含量。在本方案中, 在37°c 下在没有动摇的情况下, 在没有半胱氨酸 (mei-c) 的苹果酶诱导介质中, 在没有晃动的情况下, 在37°c 下种植乳酸菌乳酸菌36。
2. 通过在 1.5 ml 微离心管中离心以获得足够的细胞, 使细胞蛋白质总数达到50–100微克 (见下文步骤 3)。对于大肠杆菌, 这是一个日志相培养的1毫升,_{在一个 600}的0.2-0.4。对于l. reuteri来说, 这是一夜文化的1毫升。根据其他感兴趣的物种的需要进行调整。
3. 从细胞颗粒中完全去除上清液。
4. 将细胞颗粒重新放入25μl 的 gitc 裂解缓冲液 (4m guanidine 异硫氰酸酯, 50 mm tris-hcl, ph 值 7) 中, 并在95°c 孵育 10分钟, 在-80°c 下储存裂解液。
   注: 与裂解时间一致, 因为在高温下延长孵育可能会导致水解38降解聚磷.裂解物可以在-80°c 下无限期储存。
   注意: 鸟嘌呤异硫氰酸酯是一种各向异性盐, 应使用手套处理, 并作为危险废物处理。

3. 测定细胞裂解物的蛋白质含量

1. 在 gitc 裂解缓冲液中制备含有0、0.1、0.2 和 0.4 毫克 ml-1 的 bsa 标准。
   注: 在 gitc 中制定 bsa 标准非常重要, 因为 gitc 会影响布拉德福德检测仪的颜色开发。bsa 标准可以在-20°c 无限期地存储。
2. 在一个透明的96孔板中分离出 9 6 英寸的井的液体5μl 解冻、混合良好的细胞裂解物和 bsa 标准。
3. 在每口井中加入195μl 的布拉德福德试剂³⁴ , 并测量板读取器中595纳米 (a₅₉₅) 的吸收率 (见材料表)。
4. 通过与 bsa 标准曲线的比较, 计算每口井中的蛋白质含量, 使用公式 y = mx + b, 其中 y 为 a₅₉₅, x 为 bsa μg, m 为标准曲线的斜率, b 是标准曲线的 y 截距。将得到的值乘以 0.05, 以确定每个样本中的蛋白质总量。

4. 聚磷酸盐的提取

1. 在每个 gitc 裂解样品和涡流中加入250μl 的95% 乙醇进行混合。
2. 将该混合物应用于硅膜自旋柱和离心机上, 时间为 30秒, 为 16, 100 x 克。
3. 丢弃流经, 然后在 16 100 x 克的情况下, 加入750μl 的 5 mm tris-hcl (ph 7.5)、50 mm 氯化钠、5 mm edta、50% 乙醇和离心机。
4. 以 16 100 x g 的速度丢弃流经和离心机2分钟。
5. 将色谱柱放入干净的 1.5 ml 微泡管中, 加入150μl 的 50 mm tris-hcl (ph 值 8)。
6. 在室温下培养 5分钟, 然后在 8, 000 x 克的情况下离心 2分钟, 将聚离子培养。
   注: 如果需要, 可在-20°c 下存放至少1周。

5. 消化聚磷酸盐

1. 在 50 mm rris-h科尔 (ph 值 8) 中制备含有0、5、50或200μm 磷酸钾的标准。
   注: 磷酸钾标准可在室温下无限期储存。
2. 将每个磷酸盐标准和提取的聚磷样品的100μl 注入一个清晰的96孔板的独立井中。
3. 制备包含 (每个样品) 的主混合物: 30μl 的 5倍 scppx 反应缓冲液 (100 mm tris-hcl, 25 mm mgcl₂, 250 mm 醋酸铵, ph 7.5)¹³, 19μl 的 h2 o, 和1μl 纯化的 scppx (1 毫克 ml-1⁾。
4. 在96孔板的每口井中加入50μl 的主混合物。在37°c 下孵化15分钟。
   注: 如果需要, 可在-20°c 无限期地存储被消化的聚磷样品。

6. 检测游离磷酸盐²⁴

1. 在200毫升的水中溶解0.185 克酒石酸锑钾, 加入150毫升的 4 n h 2 so 4, 然后加入1.49 克七烷氨, 制备检测液基。搅拌溶解, 然后将最终体积为456毫升。过滤溶液以去除颗粒物, 并在4°c 下保存保护不受光线影响的时间长达1个月。
2. 制备 1 m 抗坏血酸的库存溶液。在4°c 下存放免受光线照射, 最长可达1个月。
3. 将检测液基座 9.12 ml 与 1 m 抗坏血酸的 0.88 ml 混合, 每天制备新的检测溶液工作量。在使用前, 请将检测解决方案降至室温。
4. 在96孔板中的每个样品和标准中添加50μl 的检测解决方案, 并在室温下孵育约 2分钟, 以实现颜色的发展。
5. 用板式读取器测量882纳米的吸收率, 并通过与磷酸钾标准曲线的比较计算每个样品的磷酸盐浓度。
   注意: 检测液中含有有毒盐和强酸。戴上手套, 将多余的溶液视为有毒废物。

7. 计算细胞聚磷酸盐含量

1. 根据以下公式, 将第6.5 步确定的磷酸盐浓度转化为每个细胞裂解液中的多聚苯醚衍生磷酸盐纳米摩尔醇:
   nmol 聚糖 = 1.5 x (μm pay/10)
   注: 步骤6中基于曲线的标准方法确定了步骤5.2 中所列每个100μl 聚磷样品中磷酸盐的浓度 (以μm 为单位)。要将该浓度转换为一定数量的 nmol, 100μl 除以 10 6^,使体积在 l 中, 乘以浓度 (μmol l-1),然后乘以 1, 000 (μmol 中的 nmol 数)。这就减少了将浓度除以10。步骤4中制备的萃取总体积为 150μl, 因此有必要将所得值乘以 1.5, 以计算整个萃取物中存在的磷酸盐的 nmol。
2. 通过将 nmol 聚磷除以步骤3.4 确定的每个样本中的 mg 总蛋白, 将细胞多磷含量归一化为总细胞蛋白。聚磷水平是以单个聚 p 衍生的游离磷酸盐的浓度来表示的。
   注: 在某些情况下, 样品中存在的多 p 衍生磷酸盐量可能超出磷酸盐标准曲线的线性范围 (步骤 6.5)。如果聚磷的水平非常高, 则步骤4.6 中多余的含有聚电的洗脱液可根据需要稀释1:10 或 1:10, 然后按照步骤5至7中的说明再次测量。

该协议的关键步骤在图 1中以简化的形式绘制。

为了证明该协议在革兰氏阴性菌中的使用, 在37°c 的 lb 富培养基中 , 野生大肠杆菌mg1655 39 在晃动 (200 转/分) 的情况下生长到中原木阶段, 然后冲洗和孵育2小时含有4克 l-1 葡萄糖和 0.1 mm k2 hpo 4 的最低培养基40 , 已知可诱导生产多磷 14, 29.如图 2a所示, 我们在 lb 生长的野生大肠杆菌和 192±14 (平均±标准偏差 [sd]) 中没有检测到多磷, 这与以前的报告14,29 一致.正如预期的那样, 一个不含多 p 激酶41的ppk突变体6在任何一种介质中都不产生多磷, 一个不含外多磷酸酶42的 ppk 突变体6产生的聚磷约相同。聚磷作为野生类型, 与野生类型 14,29、43相比, 在磷酸盐运输中存在缺陷的 pob 突变体29产生的聚磷明显较少。

为了证明该协议在革兰氏阳性菌中的应用, 利用寡核苷酸定向重组44构建的野生型 l. reuteri atcc pta 64pta 75 36 和缺乏多 p 激酶的同源 ppk1 空突变体. 在37°c 的 mei-c 中过夜生长, 不需要晃动。如图 2b所示, 在这些条件下, 野生型积累了 51±6 nmol gmg-1 总蛋白, 而ppk1突变体所含这一数量不到一半。l. reuteri含有第二个多聚 p 激酶, 由ppk2基因45编码, 这大概是ppk2空突变体中存在的多 p 的原因。

为了证明该协议在分枝杆菌中的应用, 在 hartmans-de bont (hdb) 培养基47中, 将分枝杆菌 smatis 株smr5 46 生长到中对数阶段, 然后用2% 乙醇在 hdb 或 hdb 中冲洗和稀释5倍。然后, 这些培养物在37°c 下隔夜孵育, 并有晃动 (180 转/分)。如图2c 所示, 在没有乙醇的情况下, m. smegmatis积累了 141±52 nmol mg-1 总蛋白, 而乙醇处理导致增加了三倍, 达到437±102 nmol 聚糖 mg-1 总蛋白. 这一结果是意料之中的, 因为此前有报道称, 乙醇会提高m. smegmatis48 中的多聚糖含量。

图 1: 聚磷酸盐萃取和测量过程示意图.阐述了多聚子量化协议的基本步骤。细菌细胞颗粒在95°c 的 gitc (鸟嘌呤异硫氰酸酯) 中被裂解。利用布拉德福德法检测裂解物的小等价物中的蛋白质含量。聚磷采用硅膜柱提取, 然后用 scppx 进行消化。所得到的游离磷酸盐是用抗坏血酸法进行定量的。总聚 p 衍生磷酸盐为每个样本的总蛋白进行归一化。a595 = 595 纳米的吸收率;a882 = 882 纳米的吸收率。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: 不同细菌的代表性结果.(a)大肠杆菌mg1655 野生和等基因 ppk、ppk 和pob 突变体在 37°c 时生长, 在富裕的 lb 介质 (黑眼圈) 中晃动 (200 rpm) 至 a600 = 0.2-0.4, 然后转移到最小介质 (mops含有4克 l-1 葡萄糖和 0.1 mm k2hpo 4为 2小时 (白圆; n = 3, ±sd).(b) l. reuteri atcc pta 6475 (圆圈) 和一个等基因ppk1空突变体 (三角形) 在 medi-c 介质中在37°c 下连夜生长, 不需要晃动 (n = 3, ±sd)。(c) m. smegmatis smr5 生长在37°c 下, 在 hdb 介质中晃动 (180 转/分) 至 a 600 = 1,有 (封闭方块) 或不含 (开放方块) 2% 乙醇 (n = 3, ±sd)。聚磷水平是以单个聚 p 衍生的游离磷酸盐的浓度来表示的。请点击这里查看此图的较大版本.

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